一种培育无花植物的基因表达载体的构建及其培育无花植物的基因工程方法.pdf

本发明提出了一种可以导致植物不开花的基因表达载体的构建方法及其培育无花植物的转基因方法。利用拟南芥控制花芽原基细胞形成的leafy基因上游启动子序列和淀粉芽孢杆菌核糖核酸水解酶基因barnase构建了一个培育无花植物的基因表达载体；将该表达载体转入植物细胞后，转基因植株花原基细胞自动死亡，因而不能形成花器官、植株彻底不开花、不结实。本发明所构建的培育无花植物的基因表达载体效果好、性能稳定。可以用于改良花和果实无观赏价值、开花结实会给人们带来麻烦的园林植物，也可以用于改良花、果实和种子无经济价值的植物，培育不开花、不结实的植物品种。

1、  一种培育无花植物的基因表达载体，其特征在于构建步骤为：
(1)根据pCAMBIA1305.1质粒中农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子Tnos序列，设计并合成2条引物：Nos-F：5’-ggggtacccgatcgttcaaacatttggc-3’，
Nos-R：5’-ggcttaagacactgatactttaattcccg-3’；
以pCAMBIA1305.1质粒为摸板，利用PCR技术扩增农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子Tnos片段，回收Tnos片段，经过Kpn I和EcoR I酶切后，连接到pCAMPPNN质粒上，得到pCAMPPNN-Nos质粒，pCAMPPNN质粒由pCAMBIA1305.1质粒改造而来：原pCAMBIA1305.1质粒上由2x35S启动子控制的潮霉素基因表达盒被农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子控制的卡那霉素基因表达盒所替代；原控制报告基因gus的35S启动子被农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子所替代；
(2)根据barnase基因的序列，设计并合成2条引物：
Bar-F：5’-ctggtaccatggcacaggttatcaacacg-3’，
Bar-R：5’-gtgtcgaccagacctttacaaaaatcagataa-3’；
以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)基因组DNA为摸板，通过PCR扩增淀粉芽孢杆菌核糖核酸水解酶基因barnase，回收barnase基因片段，经过KpnI和EcoR I酶切后，连接到pCAMBIA-Nos质粒(1)上，得到pCAMPPNN-Barn-Nos质粒；
(3)根据控制拟南芥花原基细胞形成的leafy基因上游启动子序列，设计并合成2条特异引物：Lfy-F：5’-aggtcgacgtatataaagatcaacatgaacagg-3’，
Lfy-R：5’-cagtcgacatctatttttctctctctctctatc-3’；
(4)以拟南芥(Arabidopsis thaliana)的幼叶为材料，用CTAB法提取拟南芥基因组DNA；
(5)以拟南芥基因组DNA为摸板，利用引物Lfy-F和Lfy-R通过PCR技术扩增leafy基因的启动子；
(6)将该片段克隆到pGEM-T载体上，并转化大肠杆菌。挑选单菌落测序；
(7)将序列正确的启动子用Sal I切下，并连接到pCAMPPNN-Barn-Nos质粒上，通过酶切验证，获得leafy基因启动子连接方向正确的无花植物表达载体pCAMPPNN-P_lfy-Barn-Nos。

2、  一种培育无花植物的基因工程方法，其特征在于是将所述的无花植物表达载体pCAMPPNN-Plfy-Barn-Nos通过根癌农杆菌介导法，或者是基因枪法，或者是原生质体共培养的方法导入植物基因组中，实现对植物的遗传转化。

3、  一种培育无花植物的基因工程方法，其特征在于步骤为：
(1)将无花植物表达载体pCAMPPNN-Plfy-Barn-Nos导入根癌农杆菌中，获得基因工程菌株，该基因工程菌株保藏号为CCTCC NO：M208198；
(2)在YEP培养基中培养基因工程菌株，直到菌液的光密度值O.D.₆₀₀达到0.5-1.0；
(3)将欲作无花培育的植物材料(子叶、胚轴心、叶片、茎段、愈伤组织等)切成小块，浸泡在根癌农杆菌菌液中，保持30min；
(4)将植物材料取出，放在无菌滤纸上，吸干菌液；
(5)将植物材料转移到添加有乙酰丁香酮的再生培养基上，在光照下培养2-3天；
(6)将植物材料转移到添加有卡那霉素，或潮霉素和羧苄青霉素，或特美亭等抗生素的选择再生培养基上，每2星期将植物材料转到新鲜的选择再生培养基上，直到形成不定芽；
(7)将不定芽切下，接种到含特美亭抗生素的生根培养基上，诱导不定芽生根，形成完整植株；
(8)再生植株经过练苗和清洗后，进行转基因植株的鉴定(如GUS染色、PCR等)，将转基因植株移栽入土壤中，同时栽培非转基因植株作为对照，常规栽培和管理，到开花时选择完全不开花的转基因植株。

一种培育无花植物的基因表达载体的构建及其培育无花植物的基因工程方法
技术领域：
本发明属于农业和林业生物技术植物基因工程领域。特别是一种培育无花植物的基因表达载体的构建及其培育无花植物的基因工程方法。
背景技术
植物在人类的生活和生存环境中发挥着极为重要的作用，但有些植物开花结实的特点给人类带来了许多麻烦。如悬铃木(法国梧桐)植株高大、树冠浓密，在夏季给人们带来了荫凉，是我国广大城乡十分重要的人行道树种。但是成年的法国梧桐大量开花、结果，果实成熟后开裂、果毛在空中飞舞，不仅污染了环境，而且容易掉入眼睛和被吸入呼吸道，危害人们的身体健康。又如杨树，既是我国重要的人行道树种，也是我国十分重要的造林速生树种，但每年春夏季节，杨树开花所形成的花絮在空中漫天飞舞，同样容易被人吸入呼吸道和掉入人的眼睛中，危害健康。在杨树造林地区，每年杨树的花絮数量多，卷成球状或者条状，遇火即燃，常常造成火灾。又如原产东亚的观叶园林植物——火焰卫矛和日本小檗，因为叶色美丽而长期受到人们的喜爱和栽培，但是它们旺盛的开花结实能力使得它们已经在美国和加拿大的野外大量繁殖、抑制了本地植物的生长，成为了严重危害当地生物多样性的外来入侵性物种。另外，还有一些园林植物开花时产生的花粉可以引起人们的过敏反应，造林树种的开花结实会消耗营养、影响木材的生长。因此，对于花、果实和种子均没有经济价值的经济植物，防止其开花结实具有重要意义。
目前对控制植物不开花结实或者少开花结实的研究很少，而且主要集中在悬铃木上。控制悬铃木开花结实的主要措施有：
1.选育少果、无果品系：通过对大量的实生悬铃木进行筛选，曾得到了果球少的悬铃木无性系^[1]；利用秋水仙素化学诱变悬铃木，也曾得到了不开花的悬铃木^[2]。
2.修剪控果：通过修剪已经可以开花的枝条、促进当年不能开花的次级枝条的生长来控制悬铃木的矮化结果，能有效控制悬铃木的结果量^[3-5]。但是修剪控果的工作量大，并且年年都要不断地重复操作，而且不能彻底解决问题。
3.化学药剂处理：利用对植物花果有催熟脱落作用的化学药剂(如乙烯利、脱落酸、赤霉素、石硫合剂、碘化钾、三氯醋酸等)在开花期间喷洒或注射于悬铃木上，促进花和幼果萎缩、脱落，从而达到控制悬铃木果毛污染的目的^[6-8]。使用化学药剂控制悬铃木开花结果的方法存在工作量大、除花除果不彻底、容易污染环境等缺点。
植物分子生物学和基因工程技术的发展为人们培育不育植物提供了一个快速有效的途径。目前，人们可以利用基因工程技术可以培育雄性不育或者雌性不育的植物，这些植物均表现自花授粉不能结实。如Mariani等人^[9-12]将烟草的花药绒毡层特异表达基因TA29启动子与RNase基因barnase相融合，导入烟草和油菜基因组中，培育出了雄性不育的转基因烟草和油菜；Colombo等^[13]用矮牵牛子房的特异启动子FBP7控制barnase基因表达，培育出了雌性不育不结实的矮牵牛。但是，雄性不育或者雌性不育基因工程技术培育出的植物仍然可以开花、形成花粉，不能解决一些植物形成花絮和过敏花粉的问题；而且，雄性不育转基因植物虽然自花授粉不结实，但异花授粉可以结实；雌性不育转基因植物虽然自花授粉和异花授粉均不结实，但是它的花粉是可育的，可以传播给同种非转基因植物。因此，已有的培育雄性不育和雌性不育植物基因工程技术不能彻底地防止植物开花、结实的问题，建立一个新的、有效的防止植物开花结实的方法，对于培育一些无花的植物品种具有重要意义。
参见：
1.曾幼佛，黄正华.悬铃木少毛栽培管理的调查研究.中国园林，1985，1：21-23
2.周业恒，江守和，鲁润龙，等.悬铃木无球果育种的研究.园艺学报，1993，20：295-298
3.蒋淮军.采用抹头重剪法是解决悬铃木弊端的有效途径.江苏绿化，1997，1：30
4.章利民.悬铃木修剪控果技术.江苏林业科技，2000，27：37-38
5.王玉勤.二球悬铃木“除毛”修剪.园林.2006，5：42
6.沈国华，汪企明，蒋慎明，等.应用化学药剂控制悬铃木飞毛污染的研究.江苏林业科技，1995，22：1-5
7.郭传友，王义彰，朱胜东，周守标.悬铃木落果的化学调控.淮北煤师院学报.2002，23：49-52
8.彭香华，李项强.防止悬铃木果毛污染试验.新疆林业，2004，3：25
9.Mariani，C.，Gossele，V.，Beuckeleer，M.D.，Truttner，J.，Leemans，J.andGoldberg，R.B.Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonucleasegene.Nature.1990：357：384-387
10.沈革志，王新其，朱玉英，等..TA29-barnase基因转化甘蓝产生雄性不育植株.植物生理学报.2001，27：43-48
11.何业华，熊兴华，官春云，等.根癌农杆菌介导TA29-Barnase基因转化甘蓝型油菜的研究.作物学报.2003，29：615-620
12.张慧军，王寰宇，石跃进，等..雄性不育基因对棉花的遗传转化.棉花学报.2007，19：261-266
13.Colombo，L.，Franken，J.，Van der Krol AR，Wittich，P.E.，Dons，H.J.，Angenent，GC.Downregulation of ovule-specific MADS box genes from petunia results inmaternally controlled defects in seed development.Plant Cell.1997，9：703-715
发明内容
本发明的目的是提出构建一种可以导致植物不开花的基因表达载体，该表达载体转入植物细胞后，转基因植物的花原基细胞自动死亡，因而不能形成花器官，从而达到植物彻底不开花、不结实的目的。
本发明是这样实现的。无花植物的基因表达载体构建步骤为：
(1)根据pCAMBIA1305.1质粒中农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子Tnos序列，设计并合成2条引物，Nos-F：5’-ggggtacccgatcgttcaaacatttggc-3’(下划线部分为Kpn I酶切位点)；Nos-R：5’-ggcttaagacactgatactttaattcccg-3’(下划线部分为EcoR I酶切位点)。以pCAMBIA1305.1质粒为摸板，利用PCR技术扩增农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子Tnos片段。回收Tnos片段，经过Kpn I和EcoR I酶切后，连接到pCAMPPNN质粒上，得到pCAMPPNN-Nos质粒。pCAMPPNN质粒由pCAMBIA1305.1质粒改造而来，原pCAMBIA1305.1质粒上由2x35S启动子控制的潮霉素基因表达盒被农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子控制的卡那霉素基因表达盒所替代；原控制报告基因gus的35S启动子被农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子所替代(图1)。
(2)根据barnase基因的序列，设计并合成2条引物，Bar-F：5’-ctggtaccatggcacaggttatcaacacg-3’(下划线部分为Kpn I酶切位点)；Bar-R：5’-gtgtcgaccagacctttacaaaaatcagataa-3’(下划线部分为Sal I酶切位点)。以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)基因组DNA为摸板，通过PCR扩增淀粉芽孢杆菌核糖核酸水解酶基因barnase。回收barnase基因片段，经过Kpn I和EcoR I酶切后，连接到pCAMPPNN-Nos质粒(1)上，得到pCAMPPNN-Barn-Nos质粒。
(3)根据控制拟南芥(Arabidopsis thaliana)花原基细胞形成的leafy基因上游启动子序列，设计并合成2条特异引物：Lfy-F：5’-aggtcgacgtatataaagatcaac atgaacagg-3’(下划线部分为Sal I酶切位点)；Lfy-R：5’-cagtcgacatctatttttctctctctctctatc-3’(下划线部分为Sal I酶切位点)。
(4)以拟南芥的幼叶为材料，用CTAB法提取拟南芥基因组DNA。
(5)以拟南芥基因组DNA为摸板，利用引物Lfy-F和Lfy-R通过PCR技术扩增leafy基因的启动子。
(6)将该片段克隆到pGEM-T载体上，并转化大肠杆菌。挑选单菌落测序。
(7)将序列正确的启动子用Sal I切下，并连接到pCAMPPNN-Barn-Nos质粒上，通过酶切验证，获得leafy基因启动子连接方向正确的无花植物表达载体pCAMPPNN-P_lfy-Barn-Nos。
该基因表达载体结构示意见图1。
该基因表达载体可以通过根癌农杆菌介导法、基因枪法、原生质体共培养等方法导入植物基因组中，实现对植物的遗传转化。以根癌农杆菌介导法为例，培育一种无花植物的步骤为：
(1)用冻融法将上述无花植物表达载体pCAMPPNN-P_lfy-Barn-Nos导入根癌农杆菌EHA105中，获得基因工程菌株。该基因工程菌株于2008年10月30日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M208198，简称基因工程菌M208198。分类命名为根癌农杆菌3#/pP_Ify-Barn-Nos(Agrobacteriumtumefaciens 3#/pP_Ify-Barn-Nos)。
该基因工程菌株菌株的菌学特性：
a、形态特性：杆状，大小为(0.6～1.0μm)×(1.5×3.0μm)，有荚膜，单个成对排列，不形成芽孢，在含糖培养基上产生黏性菌落。
b、生理生化特性：革兰氏阴性、好氧，生长温度25～28℃，具有卡那霉素和利福平抗性。
(2)在YEP培养基中培养基因工程菌株，直到菌液的光密度值达到0.5-1.0。
(3)将欲作无花培育的植物材料切成小块，浸泡在根癌农杆菌菌液中，保持30min。
(4)将植物材料取出，放在无菌滤纸上，吸干菌液。
(5)将植物材料转移到添加有乙酰丁香酮的再生培养基上，在光照下培养2-3天。
(6)将植物材料转移到添加有卡那霉素(kanamycin，抗生素)和羧苄青霉素(Carbenicillin)或特美亭(timentin，抗生素)的选择再生培养基上，每2星期将植物材料转到新鲜的选择再生培养基上，直到形成不定芽。
(7)将不定芽切下，接种到含特美亭(timentin，抗生素)的生根培养基上，诱导不定芽生根，形成完整植株。
(8)再生植株经过练苗和清洗后，进行转基因植株的鉴定(如GUS染色、PCR、Southern blot等)，将转基因植株移栽入土壤中，同时栽培非转基因植株作为对照，常规栽培和管理，到开花时选择完全不开花的转基因植株。
本发明所构建的培育无花植物的基因表达载体可以用于下列类型植物的遗传改良，培育无花的植物新品种：
(1)花和果实无观赏价值、开花与结实会给人类带来麻烦的园林植物，如悬铃木、杨树、柳树、火焰卫矛、日本小檗等。
(2)花、果实和种子无经济价值的植物，如茶树、竹子和造林树种(杨树、松树、杉树、按树、白桦树等)。这些植物以收获叶片或者茎干为目的，开花结籽会消耗养分，不利于提高叶片和茎干的产量和质量。
附图及说明：
图1为本发明构建培育无花植物的基因表达载体结构示意图。
图2移栽70天后正常开花的非转基因烟草图片。
图3移栽90天后不开花的转基因烟草图片，其主茎和侧枝不形成花芽、不开花。
图4移栽55天后正常开花的非转基因矮牵牛图片。
图5移栽150天后不开花的转基因矮牵牛图片。
图6移栽60天后正常开花的非转基因四季海棠图片。
图7移栽200天后不开花的转基因四季海棠图片。
在图1中，T-DNA的左边界；RB：T-DNA的右边界；Pnos：农杆菌胭脂碱合成酶基因的启动子；NPTII：新霉素磷酸基转移酶II基因，用于筛选转基因植株；Tnos：农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子；GUS：β-葡糖醛酸酶基因，该基因用于检测转基因植株；Plfy：控制拟南芥花芽原基细胞形成的leafy基因的启动子；barnase：淀粉芽孢杆菌核糖核酸水解酶基因，为细胞毒性基因。
具体实施方式
实施例1：无花烟草(Nicotiana tabacum)的培育
(1)将上述无花植物表达载体pCAMPPNN-P_lfy-Barn-Nos导入根癌农杆菌中，获得基因工程菌株。该基因工程菌株于2008年10月30日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M208198。。
(2)在YEP培养基中、28℃和250rpm的摇床上培养基因工程菌株M208198，直到菌液的光密度值O.D.₆₀₀达到0.8左右。
(3)收集基因工程菌菌液30ml，在4℃和5000rpm的离心10min，倒出上清液，菌体重新悬浮在液体MS培养基中，备用。
(4)将烟草无菌苗的叶片切成小块，放在无菌的培养皿中。
(5)将制备好的基因工程菌菌液倒入放有烟草叶片的培养皿中，混合均匀，浸润30min。
(6)将烟草叶片取出，放在无菌滤纸上，吸干菌液。
(7)将烟草叶片转移到添加有100μM乙酰丁香酮、2mg/L BA和0.1mg/LNAA的MS培养基上，在光照下培养2天。光照条件：光强1500-2000lux，光照时间：14h/d。
(8)2天后，将烟草叶片从共培养基上转移到选择再生培养基上，在光照下培养，每15天将叶片转到新鲜的选择再生培养基上，直到形成了不定芽。选择再生培养基为添加有2mg/LBA、0.1mg/L NAA、50mg/L卡那霉素(kanamycin)和100mg/L特美亭(timentin)的MS培养基；光照条件：光强为1500-2000lux，光照时间：14h/d。
(9)将长1-2cm的不定芽切下，转移到生根培养基上，在光照下培养，直到不定芽生根、形成完整的植株。生根培养基为添加有1mg/L IBA、50mg/L卡那霉素(kanamycin)和100mg/L特美亭(timentin)的MS培养基；光照条件：光强为1500-2000lux，光照时间：14h/d。
(10)将生根的植株从三角瓶中取出，洗去琼脂，用GUS染色法检测报告基因gus的表达情况选出转基因植株，并移栽到土壤中，在温室中栽培，常规管理。
(11)转基因植株移栽后，其形态和生长速度与非转基因植株没有明显差异。10株非转基因烟草植株在移栽后65-75天出现花蕾、随后开花、结果(图2)。在25株转基因烟草植株中，有20株在移栽后68-87天出现花蕾、随后开花；另外有5株的主茎和侧枝则一直没有形成花蕾，因而不开花(图3)。移栽2年后无花的特性保持不变。
(12)将无花的转基因植株长出的侧枝进行扦插，所繁殖的植株也均不开花，说明转基因植株无花性状表现稳定。
实施例2无花矮牵牛(Petunia hybrida)的培育
(1)在YEP培养基中、28℃和250rpm的摇床上培养基因工程菌株M208198，直到菌液的光密度值O.D.₆₀₀达到0.8左右。
(2)收集基因工程菌菌液30ml，在4℃和5000rpm的离心10min，倒出上清液，菌体重新悬浮在液体MS培养基中，备用。
(3)将矮牵牛无菌组培苗的叶片切成小块，放在无菌的培养皿中。
(4)将制备好的基因工程菌菌液倒入放有矮牵牛叶片的培养皿中，混合均匀，浸润30min。
(5)将矮牵牛叶片取出，放在无菌滤纸上，吸干菌液。
(6)将矮牵牛叶片转移到添加有100μM乙酰丁香酮、2mg/L BA和0.5mg/LNAA的MS培养基上，在光照下培养3天。光照条件：光强1500-2000lux，光照时间：14h/d。
(7)3天后，将矮牵牛叶片从共培养基上转移到选择再生培养基上，在光照下培养，每15天将叶片转到新鲜的选择再生培养基上，直到形成不定芽。选择再生培养基为添加有2mg/L BA、0.2mg/L NAA、50mg/L卡那霉素(kanamycin)和100mg/L特美亭(timentin)的MS培养基；光照条件：光强1500-2000lux，光照时间：14h/d。
(8)将长约1cm的不定芽切下，转移到生根培养基上，在光照下培养，直到不定芽生根、形成完整的植株。生根培养基为添加有1mg/L IBA、50mg/L卡那霉素(kanamycin)和100mg/L特美亭(timentin)的MS培养基；光照条件：光强为1500-2000lux，光照时间：14h/d。
(9)将生根的植株从三角瓶中取出，洗去琼脂，通过检测报告基因GUS的表达情况，选出转基因植株，移栽到土壤中，在温室中栽培，常规管理。
(10)转基因植株移栽后，其形态和生长速度与非转基因植株没有明显差异。10株非转基因植株在移栽后43-50内出现花蕾，随后开花(图4)。在32株转基因植株中，有25株在移栽后40-58天形成了花蕾，并陆续开花，但有7株的主茎和侧枝在栽培后一直没有形成花蕾，完全不开花(图5)，移栽6个月后无花的特性保持不变。
(11)将无花的转基因植株长出的侧枝进行扦插，所繁殖的植株也均不开花，说明转基因植株无花性状表现稳定。
实施例3无花四季海棠(Begonia semperflorens)的培育
(1)在YEP培养基中、28℃和250rpm的摇床上培养基因工程菌株M208198，直到菌液的光密度值O.D.₆₀₀达到0.8左右。
(2)收集基因工程菌菌液30ml，在4℃和5000rpm的离心10min，倒出上清液，菌体重新悬浮在液体MS培养基中，备用。
(3)将四季海棠无菌组培苗的叶片切成小块，放在无菌的培养皿中。
(4)将制备好的基因工程菌菌液倒入放有四季海棠叶片的培养皿中，混合均匀，保持30min。
(5)将四季海棠叶片取出，放在无菌滤纸上，吸干菌液。
(6)将四季海棠牛叶片转移到添加有100μM乙酰丁香酮、1mg/L BA和0.2mg/L NAA的MS培养基上，在光照下培养3天。光照条件：光强1500-2000lux，光照时间：14h/d。
(7)3天后，将四季海棠叶片从共培养基上转移到选择再生培养基上，在光照下培养，每15天将叶片转到新鲜的选择再生培养基上，直到形成不定芽。选择再生培养基为添加有1mg/L BA、0.2mg/L NAA、50mg/L卡那霉素(kanamycin)和100mg/L特美亭(timentin)的MS培养基；光照条件：光强1500-2000lux，光照时间：14h/d。
(8)将长1-2cm的不定芽切下，转移到生根培养基上，在光照下培养，直到不定芽生根、形成完整的植株。生根培养基为添加有1mg/L IBA、50mg/L卡那霉素(kanamycin)和100mg/L特美亭(timentin)的MS培养基；光照条件：光强为1500-2000lux，光照时间：14h/d。
(9)将生根的植株从三角瓶中取出，洗去琼脂，通过检测报告基因GUS的表达情况，选出转基因植株，移栽到土壤中，在温室中栽培，常规管理。
(10)在移栽过程中转基因的四季海棠植株的形态和生长速度与非转基因的四季海棠植株无明显差异。10株非转基因植株在移栽后40-49天出现花蕾，随后开花(图6)。在23株转基因植株中，有19株在移栽后38-55天形成了花蕾，并陆续开花；有4株的主茎和侧枝在栽培后一直没有形成花蕾，表现为完全不开花(图7)，移栽10个月后无花的特性保持不变。
(11)将无花的转基因植株长出的侧枝进行扦插，所繁殖的植株也均不开花，说明转基因植株无花性状表现稳定。