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1、10申请公布号CN104046664A43申请公布日20140917CN104046664A21申请号201410318539122申请日20140706C12P19/04200601A23L1/29200601A23L1/30200601C12R1/1020060171申请人浙江大学地址310058浙江省杭州市西湖区余杭塘路388号72发明人汪以真靳明亮徐春兰羊雪芹74专利代理机构杭州中成专利事务所有限公司33212代理人金祺54发明名称肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法及应用57摘要本发明公开了一种肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，步骤如下取保藏号为CGMCCNO2279的肠杆菌Z020。
2、6；接种到灭菌PDA加富固体培养基上，得到活化菌种；将活化菌种接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，得到发酵种子液；接种发酵种子液，得到含有肠杆菌Z0206胞外多糖的发酵液；加入乙醇，分离取沉淀，得到粗多糖粉末；将粗多糖粉末溶解于20倍体积热的蒸馏水中，加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；将所得的蛋白酶处理液取上清；向所得的清液中加SEVAG试剂，制得多糖溶液；将所得的多糖溶液，经真空冷冻干燥等步骤后，得多糖精品。51INTCL权利要求书1页说明书7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页10申请公布号CN104046664ACN104046664A1/1页21一种。
3、肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征是1斜面种子培养取保藏号为CGMCCNO2279的肠杆菌Z0206；种肠杆菌Z0206多糖的制备方法接种到灭菌PDA加富固体培养基上，2832培养3648H，再次转接到PDA加富固体培养基上，2832培养3648H，得到活化菌种；2发酵罐培养将步骤1所得到的活化菌种接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，温度2832摇床振荡培养1820H，得到发酵种子液；发酵罐内加入70发酵培养基，121蒸汽灭菌20MIN，接种发酵种子液，发酵时间4872H，得到含有肠杆菌Z0206胞外多糖的发酵液；3将步骤2所得的发酵液于6070条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/。
4、10，加入35倍体积预冷的95乙醇，分离取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤，真空干燥，得到粗多糖粉末；4将步骤3所得的粗多糖粉末溶解于20倍体积热的蒸馏水中，用NA2CO3调PH至7090，加入质量为多糖质量1/401/20的胰蛋白酶，55水解12H后，用草酸调PH至5057，加质量为多糖质量1/401/20的木瓜蛋白酶，6570水解23H后，于100水浴加热56MIN，以终止酶反应；5将步骤4所得的蛋白酶处理液用草酸调PH值至70，加入3的三氯乙酸，室温下180200R/MIN搅拌1H后，11000RPM离心1015MIN，取上清；6向步骤5所得的清液中加入1/3体积的SEVAG试剂。
5、，充分振荡脱去蛋白，制得多糖溶液；7将步骤6所得的多糖溶液用氨水调PH至80，在50下滴加20的H2O2，至溶液为淡黄色，保温2H，然后用稀盐酸中和PH值至70；自来水透析12D，蒸馏水透析23D后，经真空冷冻干燥得多糖精品。2根据权利要求1所述的肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征在于所述步骤1和2中，PDA加富固体培养基的配方如下马铃薯20，蛋白胨0205，酵母浸膏03，葡萄糖2，琼脂粉16；PDA加富液体培养基配方如下马铃薯20，蛋白胨0205G，酵母浸膏03，葡萄糖2；发酵培养基的配方如下玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403，CAC。
6、L201。3根据权利要求2所述的肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征在于所述步骤2中，摇瓶发酵条件为接种量3环，往复振荡冲程410CM，振荡频率200250RPM。4根据权利要求2或3所述的肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征在于所述步骤2中，发酵罐发酵条件为接种量4，PH为75，温度32，通气量为025075VVM，机械搅拌转速200300RPM。5根据权利要求4所述的肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征在于所述步骤6中的SEVAG试剂由氯仿和正丁醇组成；所述氯仿和正丁醇的体积比为41。6如权利要求15任一所述方法制备而得的肠杆菌Z0206细菌多糖在制备增强机体抗氧化功能和。
7、免疫调节功能的保健品或添加剂中的应用。权利要求书CN104046664A1/7页3肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法及应用技术领域0001本发明涉及一种高产细菌多糖菌株，及利用该菌株发酵生产多糖的方法和多糖的应用，它属于生物工程技术领域。背景技术0002多糖在自然界分布很广，在高等植物、动物、微生物体内均有存在，是自然界含量最丰富的生物聚合物之一。多糖具有多方面的功能，如能量储存、结构支持、防御功能等。早在上世纪40年代，多糖就开始用作药物，1951年美国人REIHYH首次发现微生物担子菌中的多糖有抑制肿瘤的活性，到了60年代，多糖作为广泛的免疫促进剂引起人们的极大兴趣，开发多糖为保健食品与药。
8、物也倍受关注。已有研究证明饲料中添加活性多糖能显著提高动物免疫功能，改善动物生长和生产性能，降低动物死亡率。0003很多多糖具有免疫增强活性，表现出对宿主免疫的介导和调节作用，通过刺激免疫细胞的成熟、分化和增殖，改善宿主机体平衡，达到恢复和提高宿主细胞对淋巴因子、激素及其他生理因子的反应性。以此为基础，多糖表现出与免疫力相关的多种活性功能，如抗肿瘤、降血糖、抗衰老、促进肝脏和骨髓细胞的蛋白质和核酸的合成、抗炎及抗辐射作用等。0004近年来，我们通过分离、筛选和纯化，从肉灵芝中分离得到了一株高产胞外多糖的细菌菌株阴沟肠杆菌Z0206。所谓肉灵芝，在民间被称之为“太岁”，据本草纲目记载，肉灵芝为本。
9、草上品，它是在我国发现的一种天然珍稀物种，即被我国科学界早已认定的一种原生质生命体，确切定名应为“特大型粘菌复合体”。研究表明，菌株阴沟肠杆菌Z0206具有高产多糖的特性，这种细菌多糖以分泌的形式到达胞外，具有产量高、安全、无毒副作用等优点。阴沟肠杆菌Z0206细菌多糖具有一定的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等活性。因此，阴沟肠杆菌Z0206细菌多糖制备在抗氧化和抗肿瘤药物及添加剂开发和应用上具有重要的意义和广阔的前景。发明内容0005本发明要解决的技术问题是提供一种肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法及应用。0006为了解决上述技术问题，本发明提供一种肠杆菌Z0206多糖的制备方法，1斜面种。
10、子培养取保藏号为CGMCCNO2279的肠杆菌Z0206；种肠杆菌Z0206多糖的制备方法接种到灭菌PDA加富固体培养基上，2832培养3648H，再次转接到PDA加富固体培养基上，2832培养3648H，得到活化菌种；2发酵罐培养将步骤1所得到的活化菌种接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，温度2832摇床振荡培养1820H，得到发酵种子液；发酵罐内加入70发酵培养基，121蒸汽灭菌20MIN，接种发酵种子液，发酵时间4872H，得到含有肠杆菌Z0206胞外多糖的发酵液；3将步骤2所得的发酵液于6070条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/10，加入35倍体积预冷的95乙醇，分离取沉淀，依次。
11、用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤，真空干燥，得到粗多糖粉末；4将步骤3所得的粗多糖粉末溶解于20倍体积热的蒸馏水中，用NA2CO3调PH至7090，加入质量为说明书CN104046664A2/7页4多糖质量1/401/20的胰蛋白酶，55水解12H后，用草酸调PH至5057，加质量为多糖质量1/401/20的木瓜蛋白酶，6570水解23H后，于100水浴加热56MIN，以终止酶反应；5将步骤4所得的蛋白酶处理液用草酸调PH值至70，加入3的三氯乙酸，室温下180200R/MIN搅拌1H后，11000RPM离心1015MIN，取上清；6向步骤5所得的清液中加入1/3体积的SEVAG试剂，充分振荡脱。
12、去蛋白，制得多糖溶液；7将步骤6所得的多糖溶液用氨水调PH至80，在50下滴加20的H2O2，至溶液为淡黄色，保温2H，然后用稀盐酸中和PH值至70；自来水透析12D，蒸馏水透析23D后，经真空冷冻干燥得多糖精品。0007作为对本发明所述的肠杆菌Z0206多糖的制备方法的改进所述步骤1和2中，PDA加富固体培养基的配方如下马铃薯20，蛋白胨0205，酵母浸膏03，葡萄糖2，琼脂粉16；PDA加富液体培养基配方如下马铃薯20，蛋白胨0205G，酵母浸膏03，葡萄糖2；发酵培养基的配方如下玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403，CACL201。0008。
13、作为对本发明所述的肠杆菌Z0206多糖的制备方法的进一步改进所述步骤2中，摇瓶发酵条件为接种量3环，往复振荡冲程410CM，振荡频率200250RPM。0009作为对本发明所述的肠杆菌Z0206多糖的制备方法的进一步改进所述步骤2中，发酵罐发酵条件为接种量4，PH为75，温度32，通气量为025075VVM，机械搅拌转速200300RPM。0010作为对本发明所述的肠杆菌Z0206多糖的制备方法的进一步改进所述步骤6中的SEVAG试剂由氯仿和正丁醇组成；所述氯仿和正丁醇的体积比为41。0011一种肠杆菌Z0206细菌多糖在制备增强机体抗氧化功能和免疫调节功能的保健品或添加剂中的应用。0012本。
14、发明所用的肠杆菌Z0206是保藏号为CGMCCNO2279的肠杆菌Z0206。0013本发明的优点0014本发明采用苯酚硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量分别为7036、2933；多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为998和001；结果表明，上述提取富硒多糖的生产过程简单，产品纯度较高，富硒量较高。0015本发明制备的肠杆菌Z0206多糖对免疫低下小鼠T细胞亚群和NK细胞活性的影响明显；能增强免疫低下的小鼠体液免疫能力。具体实施方式0016以下结合具体实例对本发明的技术方案做进一步说明以下实施例中所用肠杆菌Z0206是保藏号为CGMCCNO2279的肠杆菌Z0206001。
15、7实施例1、肠杆菌Z0206多糖的制备方法00181斜面种子培养PDA加富固体培养基配方如下马铃薯汁1000ML，蛋白胨3G，酵母浸膏3G，葡萄糖20G，琼脂粉16G；PDA加富液体培养基配方如下马铃薯汁1000ML，蛋白胨3G，酵母浸膏3G，葡萄糖20G。培养用的平板及PDA加富培养基121灭菌20MIN，在无菌室倒平板，待培养基冷却凝固之后，取冷冻保存的阴沟肠杆菌Z0206菌种保藏号为CGMCCNO2279的肠杆菌Z0206，用接种环接种于PDA加富培养基平板上，30培养2D，重说明书CN104046664A3/7页5复操作一次，得到活化的阴沟肠杆菌Z0206菌种。00192发酵罐培养向2。
16、50ML三角瓶中加入70ML上述PDA加富液体培养基，121灭菌20MIN，向培养基中接种3活化菌种后放置于摇床中30振荡培养，往复振荡的冲程410CM，振荡频率200RPM，培养18H后得到发酵罐种子液。发酵罐内加入70发酵培养基加入的发酵培养基的体积为发酵罐体积的70；发酵培养基配方为玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403，CACL201；发酵培养基配置方法为玉米淀粉200G、豆粕粉16G，玉米浆干粉6G，K2HPO43H2O3G,KH2PO43G以及CACL21G，取蒸馏水定容至1000ML，121蒸汽灭菌20MIN，接种种子液，接种量4，发。
17、酵条件为PH75、温度32、通气量为045VVM、机械搅拌转速250RPM，发酵时间48H，得到含有阴沟肠杆菌Z0206多糖的发酵液。00203阴沟肠杆菌Z0206多糖的分离提取0021A粗多糖的提取0022发酵液用旋转蒸发仪，于60将其浓缩为原体积的1/10,90水浴1H，5000RPM离心15MIN，收集上清液，用磁力搅拌器边搅拌边向上清液中缓缓加入3倍体积的冷无水乙醇，放入4冰箱沉淀过夜，然后5000RPM离心15MIN，沉淀再依次用预冷的丙酮和无水乙醚洗涤，离心，最后将沉淀置于真空干燥器中干燥，得到粗多糖粉末。0023B蛋白酶处理0024取粗多糖粉末10G溶于200ML蒸馏水中稍加热促。
18、溶，用NA2CO3调PH值至80，加胰蛋白酶05G，55水解2H后，用草酸调PH值至55，加木瓜蛋白酶05G，70水解3H后，加热至100，5MIN终止酶反应。0025CTCA三氯乙酸法脱蛋白0026取200ML的蛋白酶处理液，用草酸调PH值至70，加入6G三氯乙酸，用磁力搅拌器搅拌1H，11000RPM离心10MIN，取上清。0027DSEVAG法脱蛋白0028向上述步骤C所得的上清液中加入1/3体积的SEVAG试剂SEVAG试剂配置方法如下氯仿和氯正丁醇的体积比为41，置于250ML的分液漏斗中剧烈振荡20MIN，打开活塞，放出下层氯仿及中间层变性蛋白，重复数次直至无变性蛋白出现为止。然后。
19、用3倍体积的冷无水乙醇醇析，所得的沉淀用丙酮洗涤后，将沉淀冷冻干燥，得多糖。0029E脱色0030将步骤D所得脱蛋白后的多糖配成05的多糖溶液，用氨水调PH值至80，在50下滴加20的H2O2，至溶液为淡黄色，保温2H，然后用稀盐酸中和至70。自来水透析48H，蒸馏水透析48H后，加入3倍体积的冷无水乙醇沉淀，依次用冷的无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤沉淀，重复2次。真空干燥，得多糖精品。0031实施例2、应用苯酚硫酸法检测肠杆菌Z0206多糖含量0032方法如下精确称取标准葡糖糖20MG于500ML容量瓶中，加水至刻度，分别吸取02ML、04ML、06ML、08ML、10ML、12ML、14ML。
20、、16ML及18ML，各以蒸馏水补至20ML，然后加入6苯酚10ML及浓硫酸50ML，静止10MIN，摇匀，室温放置20MIN以后于490NM测光密度，以20ML水按同样显色操作作为空白，以多糖微克数为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。吸取样品液10ML相当于40G左右的多糖，按照上述步骤操作，测说明书CN104046664A4/7页6光密度值，以标准曲线计算多糖含量。0033实施例3、应用凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中蛋白质含量0034采用国家标准规定的凯式定氮法GB/T500951985测定肠杆菌Z0206多糖中蛋白质含量。0035实施例2和实施例3采用苯酚硫酸法和凯式定氮法测。
21、定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量。测定结果显示粗多糖中多糖、蛋白质含量分别为7036、2933；多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为998和001。结果表明，上述提取多糖的生产过程简单，产品纯度较高。0036实施例4、肠杆菌Z0206多糖的免疫调节活性研究0037取ICR小鼠可够自浙江大学医学院实验动物中心40只雌雄各半，随机分为对照组，环磷酰胺组，环磷酞胺多糖组和多糖组。、组在第12天腹腔注射环磷酞胺50MG/KG体重诱导免疫低下，、组每天灌胃生理盐水04ML，、组每天灌胃多糖04ML400MG/KG体重，试验期14D。在试验的第10天，所有的试验鼠腹腔注射02ML10的SRBC进行免疫。
22、。于最后1次给药后12H禁食不禁水，从试验组中随机取6只小鼠眼眶放血后，颈椎脱臼处死，取样进行以下指标分析。00381、采集抗凝血，通过流式细胞仪测定T细胞亚群和自然杀伤细胞NK细胞活性0039T细胞亚群试验结束后，取部分血样肝素抗凝后，取两组试管，分为试验管和阴性对照管。每支试验管中均加入FITGCD4、PECD3、PECY6CDS，其阴性对照管中均加入相应的同型对照抗体FITGIGGZB、PEIGG、PECY6IGGZA之后，每份抗凝全血分别加入试验管和阴性对照管各50L，混匀机混匀后，避光保存25MIN，加入流式细胞检测剂2ML，混匀机混匀后，避光保存15MIN后，1500R/MIN离心。
23、5MIN，弃上清，加入磷酸盐缓冲液PBSLML，混匀，1500R/MIN离心5MIN，弃上清，反复23次后，加PBS至05ML，混匀，流式细胞仪进行检测，经CELLQUEST软件进行分析，记录结果。0040NK细胞活性取流式管1支，依次加入NK细胞PE及CD3FITC三色直标单抗各5L及EDTA抗凝血50L混匀置暗处2025孵育15MIN，每管加溶血素2ML，充分混匀，准确放置暗处10MIN，1200R/MIN离心5MIN，倾弃上清液，每管加PBS2ML充分混匀，1200R/MIN离心5MIN，弃上清加少许PBS2ML混匀，上机检测分析。00412、血清溶血素含量的测定0042分离血清，用生理。
24、盐水将血清稀释300倍。取用生理盐水稀释好的血清样品LML加至反应管中，再加入10SRBC05ML，置冰浴中，并于试管中加入LML以生理盐水110稀释的豚鼠血清，随即移至37恒温水浴锅中，保温10MIN。孵育完毕即放入冰浴中以终止反应，以2000RPM离心10MIN。取上清液1ML加3ML都氏试剂，混匀，放置10MIN后，于540NM处，以不加血清的空白管作对照，测各样品的吸光度值OD。取025ML的SRBC用都氏试剂稀释至4ML，摇匀，放置10MIN，以2000RPM离心10MIN，取上清液，测吸光度值。溶血素的量以半数溶血值HC50表示，样品半数溶血值HC50样品吸光度值/SRBC半数溶血。
25、时的吸光度值稀释倍数。00433、脾细胞抗体生成测定0044试验结束后，将各小组眼眶放血，颈椎脱臼处死后，迅速取脾脏，用生理盐水制成1107CELL/ML的脾细胞悬液。另取试管，每管加入脾细胞悬液空白对照管用生理盐水代说明书CN104046664A5/7页7替、02SRBC悬液和110稀释的新鲜的豚鼠血清各LML，混匀后置37水浴温育LH，300ORPM离心10MIN，取上清液，在分光光度计上于413NM处测定光密度值A413。0045试验结果如下表所示0046表1为肠杆菌Z0206多糖对免疫低下小鼠T细胞亚群和NK细胞活性的影响；0047表2为肠杆菌Z0206多糖对免疫低下小鼠体液免疫的影响。
26、；0048表100490050注同列上标字母不同表示差异显著P0050051与生理盐水对照组相比，小鼠注射环磷酞胺后，T淋巴细胞亚群紊乱，比例失调，CD4显著降低P005，CD8显著升高P005，CD4/CD8显著降低P005，NK细胞活性显著下降P005。与环磷酰胺组相比，小鼠经400MG/KG多糖预防性灌胃在注射环磷酰胺，CD4、CD4/CD8和NK细胞活性分别提高了1993P005、2491P005和5504P005。0052表200530054与生理盐水对照组相比，小鼠注射环磷酞胺后，血清溶血素半数溶血值HC50和抗体形成细胞数目PFC分别降低了6231P005和5296P005。与环。
27、磷酰胺组相比，小鼠经400MG/KG多糖预防性灌胃在注射环磷酰胺，血清溶血素半数溶血值增加了4076，脾细胞抗体形成数目升高了2179。0055对比例1、专利号为2008101213122的专利中，采用的发酵培养基配方如下蔗糖25，酵母浸膏03，蛋白胨5，K2HPO402，KH2PO401，MGSO4005；加入0251胰蛋白酶，加入0251木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量分别为6802、2841；多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为996和003。说明书CN104046664A6/7页80056本发明中，采用的发酵培养基配方如下玉米淀粉20。
28、，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403，CACL201；加入255胰蛋白酶，加入255木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量分别为7036、2933；多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为998和001。0057从以上数据可以看出，在本发明经过对发酵培养基配方以及胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的加入量进行改变后，与专利号为2008101213122的专利中对比，产品纯度有明显的提高。0058对比例2、采用的发酵培养基配方如下玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403，CACL201；加。
29、入0251胰蛋白酶，加入0251木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量分别为6809、2855；多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为997和002。0059本发明中，采用相同的发酵培养基配方，加入255胰蛋白酶，加入255木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量分别为7036、2933；多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为998和001。0060对比例3、采用的发酵培养基配方如下玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403，CACL201；加入0251胰蛋白酶，加入。
30、255木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量分别为6902、2901；多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为997和003。0061本发明中，采用相同的发酵培养基配方，加入255胰蛋白酶，加入255木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量分别为7036、2933；多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为998和001。0062对比例4、采用的发酵培养基配方如下玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403，CACL201；加入255胰蛋白酶，加入0251木瓜蛋白酶的情况下，。
31、采用苯酚硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量分别为6903、2901；多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为9961和002。0063本发明中，采用相同的发酵培养基配方，加入255胰蛋白酶，加入255木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量分别为7036、2933；多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为998和001。0064对比例5、采用的发酵培养基配方如下蔗糖25，酵母浸膏03，蛋白胨5，K2HPO402，KH2PO401，MGSO4005；加入255胰蛋白酶，加入255木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0。
32、206多糖中多糖和蛋白质含量分别为6908、2888；多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为9958和025。说明书CN104046664A7/7页90065本发明中，采用的发酵培养基配方如下玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403，CACL201；加入255胰蛋白酶，加入255木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量分别为7036、2933；多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为998和001。0066最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。说明书CN104046664A。