一种经修饰的鲑鱼鱼精蛋白.pdf

本发明涉及一种经修饰的鲑鱼鱼精蛋白，其抑制革兰氏阳性菌活性提高，同时具有抑制革兰氏阴性据能力，可以进一步减少酸性条件下酪蛋白沉淀。本发明氨基酸序列为：PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSSSRRRRGGRRRR。氨基酸序列合成的方法包括化学、生物从头合成以及化学、生物法的部分切割后获得。经修饰后的鲑鱼鱼精蛋白用于增加抑制革兰氏阳性菌的能力；用于抑制革兰氏阴性菌；用于增加防止和减少酸性条件下酪蛋白沉淀的能力。应用包括用作抗菌肽、防腐剂或增稠剂以及疫苗、抗体或试剂。

1、  一种经修饰的鲑鱼鱼精蛋白，其特征在于：氨基酸序列为：PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSSSRRRRGGRRRR。

2、  根据权利要求1所述的一种经修饰的鲑鱼鱼精蛋白，其特征在于：氨基酸序列合成的方法包括化学、生物从头合成以及化学、生物法的部分切割后获得。

3、  根据权利要求1所述的一种经修饰的鲑鱼鱼精蛋白，其特征在于：经修饰后的鲑鱼鱼精蛋白用于增加抑制革兰氏阳性菌的能力；用于抑制革兰氏阴性菌；用于增加防止和减少酸性条件下酪蛋白沉淀的能力。

4、  根据权利要求3所述的一种经修饰的鲑鱼鱼精蛋白，其特征在于：上述应用包括用作抗菌肽、防腐剂或增稠剂以及疫苗、抗体或试剂。

一种经修饰的鲑鱼鱼精蛋白
一、技术领域：
本发明涉及一种人工修饰的多肽，尤其是涉及一种经修饰的鲑鱼鱼精蛋白，其为一种改变了天然鲑鱼鱼精蛋白氨基酸序列的多肽。
二、背景技术：
鱼精蛋白用作多聚阳离子型抗菌肽和胰岛素注射剂的组分，已经长期应用于食品防腐和临床。鱼精蛋白也被用作乳品添加剂，增加酪蛋白的耐酸性，减少酪蛋白在酸性条件下的沉淀，同时抑制乳品中杂菌污染。具有安全、无残留和营养保健价值。应用最多的是鲑鱼鱼精蛋白。鲑鱼鱼精蛋白对革兰氏阳性菌有抑制作用，但和常用的防腐剂相比其抑制作用比较弱，特别是缺少对革兰氏阴性菌的抑制作用，而革兰氏阴性细菌又是食品加工业中最需杀灭和抑制的有害菌。酸性条件下通过添加鱼精蛋白减少酪蛋白沉淀的能力较弱。
长期以来试图提高鱼精蛋白抗菌活性的研究不断，采用的方法包括添加其它组分，结合其它组分，修饰其中的氨基酸残基，替换其中的氨基酸残基等。
对于抗菌肽，例如来自昆虫、蜘蛛等动物的抗菌肽，大都因为抗菌能力低下而无法推广使用。如何用人工的方法，特别是通过氨基酸残基序列的改变提高这些抗菌肽的抗菌能力是当务之急。目前的难点在于无法确定抗菌肽抗菌能力和它们的氨基酸残基序列之间的对应关系。如果找到或者确立天然抗菌肽的氨基酸残基序列和它们抗菌能力关系，实际的合成，包括化学、生物合成方法已经不是困难的事情，例如化学合成中的固相合成，不仅做到了仪器自动化，手工化学合成也比较容易。通过对天然多肽，例如抗菌肽原有氨基酸残基序列的不断改变并提高它们的生物活性，一旦取得突破，随之可以获得用于生物合成的新基因，如此生物合成不仅降低合成成本，而且生物和活性更强。
鱼精蛋白历经几十年临床和食品工业使用，安全性基础好，氨基酸残基序列长度较小、其中组成的氨基酸种类较少，化学合成容易，成本低，容易应用推广。
三、发明内容：
本发明的目的在于提供一种经修饰的鲑鱼鱼精蛋白，其抑制革兰氏阳性菌活性提高，同时具有抑制革兰氏阴性菌能力，可以进一步减少酸性条件下酪蛋白沉淀。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种经修饰的鲑鱼鱼精蛋白，其特征在于：氨基酸序列为：PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSSSRRRRGGRRRR。
上述氨基酸序列合成的方法包括化学、生物从头合成以及化学、生物法的部分切割后获得。
一种经修饰的鲑鱼鱼精蛋白，其特征在于：经修饰后的鲑鱼鱼精蛋白用于增加抑制革兰氏阳性菌的能力；用于抑制革兰氏阴性菌；用于增加防止和减少酸性条件下酪蛋白沉淀的能力。
上述应用包括用作抗菌肽、防腐剂或增稠剂以及疫苗、抗体或试剂。
与现有天然鲑鱼鱼精蛋白和其它鱼精蛋白改造相比，本发明具有的优点和效果如下：
1、本发明没有额外添加其它物质；
2、本发明没有对原有的氨基酸残基进行化学修饰，例如添加其它化学基团；
3、本发明没有改变天然鱼精蛋白的氨基酸序列长度；
4、本发明没有增加鱼精蛋白的正净电荷，反而减少了两个正电荷；
5、经修饰后的鲑鱼鱼精蛋白抑制革兰氏阳性菌的能力增加；
6、对革兰氏阴性菌也有抑制作用。
7、防止和减少酸性条件下酪蛋白的沉淀的能力增加。
四、附图说明：
图1为质谱分析结果图；
图2为纯度检测结果图。
五、具体实施方式：
本发明替换了天然鲑鱼鱼精蛋白氨基酸序列中的两个氨基酸：将原来的序列PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSR改变成为PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSSSRRRRGGRRRR。即将原来第21、22位的两个精氨酸(RR)替换为两个丝氨酸(SS)。如此修改后，在鱼精蛋白羧基末端新产生一个紧邻连续精氨酸区域的丝氨酸簇。减少鱼精蛋白序列中的精氨酸残基数量等于减少了鱼精蛋白的正电荷。替换后的丝氨酸增加了鱼精蛋白的疏水性。在连续出现的精氨酸(精氨酸簇)一侧或两侧集中出现数个丝氨酸(丝氨酸簇)的现象同样存在于天然酪蛋白中。这样的结构被认为是酪蛋白携带钙离子的内在机制。也被认为是数种酪蛋白之间形成酪蛋白胶粒的分子基础。对于多聚阳离子抗菌肽，通常认为增加正电荷有利于提高抗菌能力。但本发明证实，这种认识不完全正确。革兰氏阳性和阴性菌的细胞壁结构不同。
本发明采用现有的化学固相合成法，仪器自动合成，按照“PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSSSRRRRGGRRRR”序列合成、纯化和检测，获得修饰后的鲑鱼鱼精蛋白。合成后的分子量和纯度检测结果见图1、图2。
试验时，用无菌蒸馏水稀释成不同浓度的梯度；培养革兰氏阳性菌和阴性菌，用作抑菌圈试验；购置鲜牛奶，用柠檬酸调酸
实施例1：抑菌试验。
分别取3株革兰氏阳性菌和1株革兰氏阴性菌的稀释菌悬液0.3ml，在营养琼脂培养基的培养皿中涂布成平板。在培养皿底面划区备用。将蘸有不同浓度的修饰后的鲑鱼鱼精蛋白溶液的滤纸片放到相应的位置，并用鲑鱼鱼精蛋白硫酸盐做对照，用无菌水做空白对照。细菌平皿置37℃恒温培养48小时后，观察抑菌圈的有无与大小，测出MIC(抑菌最低浓度)。MIC越低，表示鱼精蛋白对该菌的抑菌力越强。(见表1)
表1

实施例2：减少酸性条件下酪蛋白沉淀试验
将1000μg/ml、800μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml五种不同浓度梯度的修饰后的鲑鱼鱼精蛋白和天然鲑鱼鱼精蛋白硫酸盐溶液各0.3ml添加到35ml新鲜牛奶中，用8％柠檬酸在低于20℃条件下调酸，查看牛奶产生沉淀时的pH值，并设置一个不添加鱼精蛋白的做空白对照。结果如下：(见表2)
表2

氨基酸序列表：
<120>Title：经修饰的鲑鱼鱼精蛋白
<130>AppFileReference：发明专利
<140>CurrentAppNumber：
<141>CurrentFilingDate：____-__-___
Sequence
--------
<213>OrganismName：人工序列
<400>PreSequenceString：
<212>Type：PRT
<211>Length：0
SequenceName：Pro Arg Arg Arg Arg Ser Ser Ser Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg ProArg Val Ser Ser Ser Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg
SequenceDescription：