一种自荷叶中分离制备2羟基1甲氧基阿朴啡的方法.pdf

本发明公开了一种自荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的方法。荷叶用乙醇加热回流提取得荷叶提取物浸膏；浸膏用1％HCl水溶液超声分散，取上清液调pH，氯仿萃取得氯仿萃取物；萃取物采用硅胶干柱色谱法分离得到2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品；粗品采用氧化铝柱色谱法纯化得到2-羟基-1-甲氧基阿朴啡白色针状结晶。经高效液相色谱法及差示扫描量热法测定其纯度均大于98％。

1.  一种自荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的方法，其特征在于荷叶用乙醇加热回流提取得荷叶提取物浸膏；浸膏用1％HCl水溶液超声分散，取上清液调pH，氯仿萃取得氯仿萃取物；萃取物采用硅胶干柱色谱法分离得到2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品；粗品采用氧化铝柱色谱法纯化得到2-羟基-1-甲氧基阿朴啡白色针状结晶。

2.  如权利要求1所述的自荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的方法，其特征在于取荷叶药材，加入10～16倍体积份的70～90％乙醇，加热回流提取0.5～2小时，静置，过滤；药渣用同样的方法再提取2～4次，提取液合并，水浴(60～70℃)减压回收溶剂至无醇味，得荷叶提取物浸膏。

3.  如权利要求1所述的自荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的方法，其特征在于取荷叶提取物浸膏，加药材2～5倍体积份的1％HCl水溶液超声分散(30min，100kHz)，离心(30min，3000rpm)，上清液用1mol/LNaOH溶液调pH值至6～8，用氯仿萃取至水层无生物碱成分(改良碘化铋钾试液显色为阴性)，氯仿萃取液回收溶剂，得氯仿萃取物。

4.  如权利要求1所述的自荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的方法，其特征在于取氯仿萃取物用5～10倍体积份甲醇溶解，按质量比1∶1～3拌入硅胶(200～300目)，自然干燥，得到拌样硅胶，另按药材与硅胶质量比为1～2∶1取硅胶(200～300目)干法装柱，色谱柱径高比1∶5～10；将拌样硅胶装于柱顶，以石油醚-丙酮(1～4∶1)混合溶剂为展开剂，下行法进行干柱层析，洗脱1～3倍柱体积，色谱柱挥干展开剂，自上而下平均切割为20～25份，各份用甲醇洗脱，洗脱液减压回收溶剂，得各洗脱物；各洗脱物用薄层色谱检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(1～4∶1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液；合并含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的4～7至9～16份甲醇洗脱液，回收溶剂得2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品。

5.  如权利要求1所述的自荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的方法，其特征在于取2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品用5～10倍体积份甲醇溶解，按质量比1∶1～3拌入氧化铝(100～200目)，自然干燥，得到拌样氧化铝，另按2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品与氧化铝质量比为20～50∶1取氧化铝(100～200目)湿法装柱，色谱柱径高比1∶5～10；将拌样氧化铝加于柱顶，洗脱，洗脱剂为石油醚-丙酮(1～4∶1)，分份收集，每份20～100mL，减压浓缩至小体积(约5～15mL)后，用薄层色谱检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(1～4∶1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液；合并含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的流份，避光自然结晶，得2-羟基-1-甲氧基阿朴啡白色针状结晶。

6.  如权利要求1所述的自荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的方法，其特征在于分离制备的2-羟基-1-甲氧基阿朴啡白色针状结晶经高效液相色谱法及差示扫描量热法测定其纯度均大于98％。

7.  如权利要求6所述的采用高效液相色谱法测定2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的纯度，其特征在于该方法是：色谱柱为Hypersil C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％三乙胺(40～50∶60～50)；流速为1.0～1.2mL/min；柱温为30～35℃；检测波长为254nm、272nm和300nm；进样量为0.5～5μg。

8.  如权利要求6所述的采用差示扫描量热法测定2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的纯度，其特征在于该方法是：测试温度范围为150～250℃；升温速度为0.5～5℃·min^-1；测试样品用量为2～4mg。

一种自荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的方法
技术领域
本发明属中药技术领域，涉及一种中药化学成分的提取纯化方法，特别是涉及自中药荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的方法。
背景技术
中药化学对照品是中国药典、部(局)颁标准所收载的，在中药检定时为求得鉴别、含量测定、杂质和相关物质检查等项的准确一致，用以与被测样品对比，判定其质量的实物标准。中药化学对照品是制定中药材、中药提取物、中药饮片、中药配方颗粒、中成药质量标准必不可少的物质基础；是指导GAP基地建设，实现中药原料生产、产地加工规范化和质量控制的重要保证；是进行GMP建设，实现中药饮片生产、中成药生产规范化，确保临床用药安全、有效、质量稳定可控的重要保证；是加快中药新药研制，提高中药新药研制水平，加速中药现代化和国际化进程的关键。因此，中药化学对照品的制备是中药标准化、现代化、国际化规范建立的关键和基础，常常是一个对照品的出现，即带动一批含此种成分中药检验方法及质量标准的建立。2-羟基-1-甲氧基阿朴啡是荷叶的主要活性成分之一，开发简便实用、经济可行、稳定可控的2-羟基-1-甲氧基阿朴啡对照品制备技术，确保该对照品的质量稳定和供应充足，满足荷叶药材在生产、加工、流通、使用中的质量检测，确保荷叶药材、提取物、饮片、炮制品、配方颗粒和含荷叶制剂的质量能够得到有效控制和合理评价，具有重要意义。目前未见有关自中药荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡方法的报道和专利申请。
技术方案
本发明的目的在于提供一种从荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
1.荷叶提取物的制备
取荷叶药材，加入10～16倍体积份的70～90％乙醇，加热回流提取0.5～2小时，静置，过滤。药渣用同样的方法再提取2～4次，提取液合并，水浴(60～70℃)减压回收溶剂至无醇味，得荷叶提取物浸膏。
2.2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品的分离
2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品的分离采用硅胶干柱层析方法。
取上述荷叶提取物浸膏，加药材2～5倍体积份的1％HCl水溶液超声分散(30min，100kHz)，离心(30min，3000rpm)，上清液用1mol/LNaOH溶液调pH值至6～8，用氯仿萃取至水层无生物碱成分(改良碘化铋钾试液显色为阴性)，氯仿萃取液回收溶剂，得氯仿萃取物。
氯仿萃取物采用硅胶(200～300目)干柱色谱法分离，方法为：取萃取物用5～10倍体积份甲醇溶解，按质量比1∶1～3拌入硅胶(上海五四化学试剂有限公司，200～300目)，自然干燥，得到拌样硅胶；另按药材与硅胶质量比为1～2∶1取硅胶(上海五四化学试剂有限公司，200～300目)干法装柱，色谱柱径高比1∶5～10。将拌样硅胶装于柱顶，以石油醚-丙酮(1～4∶1)混合溶剂为展开剂，下行法进行干柱层析，洗脱1～3倍柱体积。色谱柱挥干展开剂，自上而下平均切割为20～25份，各份用甲醇洗脱，洗脱液减压回收溶剂，得各洗脱物。各洗脱物用薄层色谱检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板(青岛海洋化工厂)，展开剂为石油醚-丙酮(1～4∶1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。合并含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的4～7至9～16份甲醇洗脱液，回收溶剂得2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品。
3.2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的纯化
2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品采用氧化铝(100～200目)柱色谱法纯化，方法为：取2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品用5～10倍体积份甲醇溶解，按质量比1∶1～3拌入氧化铝(上海五四化学试剂有限公司，100～200目)，自然干燥，得到拌样氧化铝；另按2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品与氧化铝质量比为20～50∶1取氧化铝(上海五四化学试剂有限公司，100～200目)湿法装柱，色谱柱径高比1∶5～10。将拌样氧化铝加于柱顶，洗脱，洗脱剂为石油醚-丙酮(1～4∶1)，分份收集，每份20～100mL，减压浓缩至小体积(约5～15mL)后，用薄层色谱检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板(青岛海洋化工厂)，展开剂为石油醚-丙酮(1～4∶1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。合并含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的流份，避光自然结晶，得2-羟基-1-甲氧基阿朴啡白色针状结晶。
4.纯度检查
(1)差示扫描量热法(DSC)检查纯度。仪器：岛津公司DSC-60型差示扫描量热仪。测试温度范围：150～250℃；升温速度：0.5～5℃·min^-1；测试样品用量：2～4mg。测定2-羟基-1-甲氧基阿朴啡纯度大于98.00％。
(2)高效液相色谱法(HPLC)检查纯度。仪器：美国Waters公司Waters 1525高效液相色谱仪，Waters2996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站，Waters公司25μL可调进样器。色谱柱：Hypersil C₁₈，250mm×4.6mm，5μm(美国Thermo公司)。流动相：乙腈-0.1％三乙胺(40～50∶60～50)；流速：1.0～1.2mL/min；柱温：30～35℃；检测波长：254nm、272nm、300nm；进样量：0.5～5μg。归一化法测定2-羟基-1-甲氧基阿朴啡纯度均大于98.00％。
5.结构测定
2-羟基-1-甲氧基阿朴啡为白色针状结晶(石油醚-丙酮)，分子式为C₁₈H₁₉NO₂，分子量为281，熔点195～197℃，易溶于氯仿、甲醇。365nm紫外灯下呈淡紫色荧光，改良碘化铋钾试液显色为橙红色。UVλ_max(nm)：272(MeOH)。EI-MS：m/z 281[M]⁺，266[M-CH₃]⁺，251[M-2CH₃]⁺，250，178；¹H-NMR(CDCl₃，500MHz)：δ8.27(H，d，J＝8.0Hz，OH)，7.25，7.26，6.60，3.56(3H，s，O-CH₃)，3.11(2H，t，H-5)，3.01(2H，t，H-7)，2.68(2H，t，H-4)，2.55(3H，s，N-CH₃)，2.48(1H，d，J＝4.0，8.0Hz，H-6a)；¹³C-NMR(CD₃OD，125MHz)：δ147.9(C-2)，143.0(C-1)，136.3(C-7a)，131.8(C-11a)，128.0(C-8)，127.3(C-1a)，127.2(C-9)，127.2(C-1b)，127.3(C-11)，127.3(C-4a)，125.8(C-10)，114.1(C-3)，62.4(C-6a)，60.3(OCH₃)，53.3(C-5)，43.8(N-CH₃)，34.8(C-7)，28.7(C-4)。2-羟基-1-甲氧基阿朴啡结构式如下：

附图说明：
图1差示扫描量热法测定2-羟基-1-甲氧基阿朴啡熔融曲线
图2不同检测波长下2-羟基-1-甲氧基阿朴啡HPLC图谱
实施例1：
取荷叶药材200g，用16倍体积份的90％乙醇回流加热提取3次，每次1小时。合并3次提取液，水浴(60℃)减压回收溶剂至无醇味，得荷叶提取物浸膏40g。
荷叶提取物浸膏40g加1000mL 1％HCl水溶液超声分散(30min，100kHz)，离心(30min，3000rpm)，上清液用1mol/L NaOH溶液调pH值至7.5，用氯仿萃取至水层无生物碱成分(改良碘化铋钾试液显色为阴性)，氯仿萃取液回收溶剂，得氯仿萃取物1.2g。
氯仿萃取物1.2g用8mL甲醇溶解，拌入2g硅胶(200～300目)，自然干燥，得到拌样硅胶；另取硅胶(200-300目)200g，干法装柱(直径2.5cm，高17.5cm)。将拌样硅胶装于柱顶，以石油醚-丙酮(2∶1)混合溶剂为展开剂，下行法进行干柱层析，洗脱1倍柱体积，色谱柱挥干展开剂，自上而下平均切割为20份，各份用甲醇洗脱，洗脱液减压回收溶剂，得各洗脱物。各洗脱物用薄层色谱检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(3∶1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。其中第6～12份含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡，合并，减压回收溶剂，得到2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品0.56g。
取2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品0.56g，用5mL甲醇溶解，加到1g氧化铝(100～200目)中，拌匀，挥干溶剂；另取氧化铝20g(100～200目)湿法装柱(色谱柱直径2cm，高10cm)。将拌样氧化铝加于柱顶，洗脱，洗脱剂为石油醚-丙酮(2.5∶1)，分份收集，每份20mL，减压浓缩至约8mL后，用薄层色谱检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(1∶1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。合并含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的流份，避光自然结晶，得白色针状结晶2-羟基-1-甲氧基阿朴啡56.4mg。高效液相色谱法及差示扫描量热法测定其纯度大于98％。
实施例2：
取荷叶药材500g，用75％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，溶剂用量第一次为16倍体积份，第二次为14倍体积份。合并2次提取液，水浴(60℃)减压回收溶剂至无醇味，得荷叶提取物浸膏105g。
荷叶提取物浸膏105g加1500mL 1％HCl水溶液超声分散(30min，100kHz)，离心(30min，3000rpm)，上清液用1mol/LNaOH溶液调pH值至7.0，用氯仿萃取至水层无生物碱成分(改良碘化铋钾试液显色为阴性)，氯仿萃取液回收溶剂，得氯仿萃取物2.8g。
氯仿萃取物2.8g用15mL甲醇溶解，拌入4.5g硅胶(200～300目)，自然干燥，得到拌样硅胶；另取硅胶(200～300目)330g，干法装柱(直径3cm，高30cm)。将拌样硅胶装于柱顶，以石油醚-丙酮(3∶1)混合溶剂为展开剂，下行法进行干柱层析，洗脱1.5倍柱体积，色谱柱挥干展开剂，自上而下平均切割为25份，各份用甲醇洗脱，洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物。各洗脱物用薄层色谱检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(1.5∶1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。其中第6～15份含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡，合并，减压回收溶剂，得到2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品1.8g。
取2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品1.8g，用10mL甲醇溶解，加到4g氧化铝(100～200目)中，拌匀，挥干溶剂；另取氧化铝40g(100～200目)湿法装柱(色谱柱直径2.5cm，高13cm)。将拌样氧化铝加于柱顶，洗脱，洗脱剂为石油醚-丙酮(4∶1)，分份收集，每份30mL，减压浓缩至约10mL后，用薄层色谱检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(1∶1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。合并含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的流份，避光自然结晶，得白色针状结晶2-羟基-1-甲氧基阿朴啡146mg。高效液相色谱法及差示扫描量热法测定其纯度大于98％。
实施例3：
取荷叶药材1kg，用70％乙醇加热回流提取2次，每次1.5小时，溶剂用量为14倍体积份。合并2次提取液，水浴(70℃)减压回收溶剂至无醇味，得荷叶提取物浸膏220g。
荷叶提取物浸膏220g加2000mL 1％HCl水溶液超声分散(30min，100kHz)，离心(30min，3000rpm)，上清液用1mol/LNaOH溶液调pH值至6.5，用氯仿萃取至水层无生物碱成分(改良碘化铋钾试液显色为阴性)，氯仿萃取液回收溶剂，得氯仿萃取物7.2g。
氯仿萃取物7.2g用40mL甲醇溶解，拌入10g硅胶(200～300目)，自然干燥，得到拌样硅胶；另取硅胶(200～300目)625g，干法装柱(直径8.5cm，高43cm)。将拌样硅胶装于柱顶，以石油醚-丙酮(1.5∶1)混合溶剂为展开剂，下行法进行干柱层析，洗脱2倍柱体积，色谱柱挥干展开剂，自上而下平均切割为20份，各份用甲醇洗脱，洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物。各洗脱物用薄层色谱检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(2∶1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。其中第7～13份含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡，合并，减压回收溶剂，得到2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品5.0g。
取2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品5.0g，用25mL甲醇溶解，加到5g氧化铝(100～200目)中，拌匀，挥干溶剂；另取氧化铝100g(100～200目)湿法装柱(色谱柱直径3cm，高22cm)。将拌样氧化铝加于柱顶，洗脱，洗脱剂为石油醚-丙酮(3∶1)，分份收集，每份50mL，减压浓缩至约10mL后，用薄层色谱检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(2∶1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。合并含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的流份，避光自然结晶，得白色针状结晶2-羟基-1-甲氧基阿朴啡286mg。高效液相色谱法及差示扫描量热法测定其纯度大于98％。
实施例4：
取荷叶药材2kg，用85％乙醇加热回流提取3次，每次1小时，溶剂用量为12倍体积份。合并3次提取液，水浴(60℃)减压回收溶剂至无醇味，得荷叶提取物浸膏450g。
荷叶提取物浸膏450g加5000mL 1％HCl水溶液超声分散(30min，100kHz)，离心(30min，3000rpm)，上清液用1mol/L NaOH溶液调pH值至7.5，用氯仿萃取至水层无生物碱成分(改良碘化铋钾试液显色为阴性)，氯仿萃取液回收溶剂，得氯仿萃取物14.5g。
氯仿萃取物14.5g用100mL甲醇溶解，拌入25g硅胶(200～300目)，自然干燥，得到拌样硅胶；另取硅胶(200～300目)1kg，干法装柱(直径9cm，高63cm)。将拌样硅胶装于柱顶，以石油醚-丙酮(2.5∶1)混合溶剂为展开剂，下行法进行干柱层析，洗脱2.5倍柱体积，色谱柱挥干展开剂，自上而下平均切割为25份，各份用甲醇洗脱，洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物。各洗脱物用薄层色谱检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(1∶1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。其中第5～11份含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡，合并，减压回收溶剂，得到2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品11g。
取2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品11g，用70mL甲醇溶解，加到20g氧化铝(100～200目)中，拌匀，挥干溶剂；另取氧化铝240g(100～200目)湿法装柱(色谱柱直径4cm，高30cm)。将拌样氧化铝加于柱顶，洗脱，洗脱剂为石油醚-丙酮(2.5∶1)，每份100mL，减压浓缩至约15mL后，用薄层色谱检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(2∶1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。合并含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的流份，避光自然结晶，得白色针状结晶2-羟基-1-甲氧基阿朴啡565mg。高效液相色谱法及差示扫描量热法的定其纯度大于98％。