组织蛋白酶类抑制剂.pdf

本发明提供式(I)化合物和其药物组合物，更特别是用作组织蛋白酶抑制剂的二环氨基甲酸酯类，并提供使用此类化合物或其可药用盐的方法，其中，X是O或S；R1是OR2、卤素、(CR2)nR3、硝基、氰基、氨基、酰氨基、氨磺酰，或者是任选取代的C1-6烷基、C2-6烯基或C3-6炔基；R2是H、(CR2)nR3，或者是任选取代的C1-6烷基、C2-6烯基或C3-6炔基；R3是任选取代的芳基、杂芳基、碳环或杂环；m是1-3；并且n是0-4。

1.  式(1)化合物或其可药用盐：

其中：
X是O或S；
R¹是OR²、卤素、(CR₂)_nR³、硝基、氰基、氨基、酰氨基、氨磺酰，或者是任选取代的C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_3-6炔基；
R²是H、(CR₂)_nR³，或者是任选取代的C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_3-6炔基；
R³是任选取代的芳基、杂芳基、碳环或杂环；
m是1-3；并且
n是0-4。

2.  权利要求1的化合物，其中m是1。

3.  权利要求2的化合物，其中R¹是卤素。

4.  权利要求2的化合物，其中R¹是OR²；并且R²是任选取代的C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_3-6炔基；或任选取代的芳基、杂芳基、碳环或杂环。

5.  权利要求4的化合物，其中R²是任选取代的苯基、苄基或C_1-6烷基。

6.  权利要求1-5中任意一项的化合物，其中所述化合物具有顺式或反式立体构象。

7.  药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的权利要求1-6中任意一项的化合物和可药用载体。

8.  权利要求1-6中任意一项的化合物或其可药用盐或药物组合物用于制备治疗由组织蛋白酶活性介导的状况的药物从而治疗所述组织蛋白酶-介导的状况或疾病的用途，其中所述状况或疾病是细胞自动调节、凋亡、肿瘤侵袭和转移、骨吸收或抗原表达。

9.  权利要求8的用途，其中所述组织蛋白酶是类木瓜蛋白酶的组织蛋白酶。

10.  权利要求1-6中任意一项的化合物或其可药用盐或药物组合物在制备抑制组织蛋白酶活性的药物中的用途。

组织蛋白酶类抑制剂
相关申请的交叉参考
本申请要求于2006年10月23日提交的美国临时专利申请号60/862,500的优先权，将其在此整体引入作为参考。
背景技术
大多数组织蛋白酶是属于类木瓜蛋白酶的(papain-like)半胱氨酸蛋白酶家族的内肽酶。组织蛋白酶通常高度集中于溶酶体隔室和内体隔室中并在大量生理过程中起作用。在它们中有非特异性功能如内化蛋白和细胞蛋白的降解，还有在酶和激素的加工中的较特异性功能。多种疾病与某些蛋白酶的过表达有关。例如，抑制特定的组织蛋白酶被认为对与细胞自动调节、凋亡、肿瘤侵袭和转移、骨吸收及抗原表达有关的病理学状况具有治疗作用。
大多数小分子蛋白酶抑制剂，包括组织蛋白酶的那些小分子蛋白酶抑制剂，由识别酶内特异性口袋并定义底物选择性的拟肽(peptidomimetic)和与催化区域具有重要联系的亲电子“弹头”组成。所述亲电子基团的性质决定了这些小分子分类为可逆和不可逆抑制剂。一些亲电子基团已被常规地用于蛋白酶的抑制(通过酶与抑制剂的共价作用)中。例如，醛类、缩氨基脲、腈类和酮类通常导致可逆的抑制，而卤甲基酮类、环氧化物类和迈克尔受体(Michael acceptors)属于用于不可逆抑制的官能物(functionality)。
迄今为止，相对而言几乎没有蛋白酶抑制剂已成功通过临床试验。主要问题包括抑制剂的肽部分的非类药性质和/或缺乏选择性，缺乏选择性通常归因于亲电子官能物与内源的亲核物质在体内的非特异性相互作用。为了避开这些在基于底物药物设计的经典方法中常见的缺点，需要寻找新的分子概念。
发明内容
本发明提供了可用作组织蛋白酶抑制剂的化合物和其药物组合物。在一方面，本发明提供式(1)化合物或其可药用盐：

其中：
X是O或S；
R¹是OR²、卤素、(CR₂)_nR³、硝基、氰基、氨基、酰氨基、氨磺酰，或者是任选取代的C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_3-6炔基；
R²是H、(CR₂)_nR³，或者是任选取代的C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_3-6炔基；
R³是任选取代的芳基、杂芳基、碳环或杂环；
m是1-3；并且
n是0-4。
在一个实施方案中，m是1。例如，R¹是卤素或OR²，其中R²可以是任选取代的苯基、苄基或C_1-6烷基。在一些实例中，式(1)化合物具有顺式立体构象。在另一些实例中，式(1)化合物具有反式立体构象。
在另一方面，本发明提供包含式(1)化合物和可药用赋形剂的药物组合物。
在又一方面，本发明提供抑制组织蛋白酶的方法，该方法包括对有其需要的系统或个体施用治疗有效量的式(1)化合物或其可药用盐或药物组合物，从而抑制所述组织蛋白酶。
本发明还提供治疗由组织蛋白酶活性介导的状况或疾病的方法，该方法包括对有其需要的系统或个体施用治疗有效量的式(1)化合物或其可药用盐或药物组合物，从而治疗所述组织蛋白酶-介导的状况或疾病。在一个实施方案中，本发明提供治疗由类木瓜蛋白酶的组织蛋白酶介导的状况或疾病的方法，所述状况或疾病包括但不限于细胞自动调节、凋亡、肿瘤侵袭和转移、骨吸收及抗原表达。例如，本发明化合物可用于治疗骨质疏松症、关节炎、哮喘、自身免疫疾病及肿瘤。
在又一方面，本发明提供式(1)化合物在制备治疗由组织蛋白酶更特别是类木瓜蛋白酶的组织蛋白酶介导的疾病的药物中的用途。
在使用本发明化合物的上述方法中，可以对包括细胞或组织的系统施用式(1)化合物。在其它实施方案中，可以对人类或动物个体施用式(1)化合物。
定义
“烷基”指基团和作为其它基团的结构组件，例如卤素取代的烷基和烷氧基，并且可以是直链或支链的。文中所用的任选取代的烷基、烯基或炔基可以任选地被卤化(如CF₃)，或者可以具有一个或多个被杂原子如NR、O或S取代或替换的碳原子(如-OCH₂CH₂O-、烷基硫醇、硫代烷氧基、烷基胺等等)。
“芳基”指包含碳原子的单环或稠合的二环的芳族环。例如，芳基可以是苯基或萘基。“亚芳基”是指衍生自芳基基团的二价基团。
文中使用的“杂芳基”如上面对芳基所定义，其中一个或多个环成员是杂原子。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、呋喃基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。
文中使用的“碳环”指饱和的或部分不饱和的包含碳原子的单环、稠合的二环或桥连的多环，其可以任选地被取代，例如，被＝O取代。碳环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环丙烯、环己酮等。
文中使用的“杂环”如上面对碳环所定义，其中一个或多个环碳是杂原子。例如，杂环可包含N、O、S、-N＝、-S-、-S(O)、-S(O)₂-或-NR-，其中R可以是氢、C_1-4烷基或保护基团。杂环的实例包括但不限于吗啉代、吡咯烷基、吡咯烷-2-酮、哌嗪基、哌啶基、哌啶基酮、1，4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-8-基等。
除非另有说明，当认为取代基是“任选取代的”时，这意味着该取代基是可以被一个或多个基团取代的基团，上述一个或多个基团单独地或独立地选自例如任选卤化的烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷硫基、炔基、酰胺、氨基包括单-和二-取代的氨基基团、芳基、芳氧基、芳硫基、羰基、碳环、氰基、环烷基、卤素、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂芳基、杂环、羟基、异氰酸基、异硫氰酸基、巯基、硝基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、全卤代烷基、全氟代烷基、甲硅烷基、磺酰基、硫代羰基、硫氰酸基、三卤甲烷磺酰基及其保护的化合物。可形成上述取代基的保护的化合物的保护基团是本领域技术人员熟知的那些且可见于参考文献如Greene和Wuts，有机合成中的保护基团(Protective Groups in Organic Synthesis)，第三版，John Wiley & Sons，纽约，NY，1999，和Kocienski，保护基团(Protective Groups)，Thieme Verlag，纽约，NY，1994中，其以全部内容引入文中作为参考。
文中使用的术语“共同施用”或“联合施用”或类似术语意指包括将所选治疗剂施用于单个病人，并且旨在包括治疗方案，在所述治疗方案中所述治疗剂不必须以相同的施用途径施用或同时施用。
文中使用的术语“药物组合”指由混合或组合活性成分而得到的产品，并且包括活性成分的固定组合和非固定组合。术语“固定组合”指活性成分如式(1)化合物和共同物质(co-agent)以单一实体或剂量的形式同时施用至患者。术语“非固定组合”指活性成分如式(1)化合物和共同物质作为独立的实体同时、并存或依次(没有特定的时间限制)施用至患者，其中这样的施用在患者体内提供治疗有效水平的活性成分。后者还适用于鸡尾酒治疗，例如施用三种或更多活性成分。
术语“治疗有效量”指在细胞、组织、器官、系统、动物或人中引发正被研究人员、兽医、医生或其他临床人员寻求的生物学或医学反应的受试化合物的量。
术语受试化合物的“施用”和/或“给药”应当被理解为意指提供本发明化合物(包括本发明化合物的前药)至需要治疗的个体。
发明详述
本发明提供用于抑制组织蛋白酶、更特别是抑制类木瓜蛋白酶的组织蛋白酶的化合物和组合物。本发明还提供治疗由组织蛋白酶活性介导的状况或疾病(特别是由类木瓜蛋白酶的组织蛋白酶介导的状况或疾病)的方法，该方法包括对有其需要的系统或个体施用治疗有效量的式(1)化合物或其可药用盐或药物组合物，从而治疗所述类木瓜蛋白酶的组织蛋白酶介导的状况或疾病。
类木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶被确认在变性的、侵袭性和免疫系统相关的病症中具有关键的蛋白水解活性。(Lecaille等人，化学综述(Chem.Rev.)2002，102：4459-4488；等人，当前药物设计(Curr.Pharm.Des.)2002，8：1639-1658)。例如，组织蛋白酶K是破骨细胞中的主要的骨降解活性，并且它的选择性抑制可以有益于治疗骨质疏松症和某些形式的关节炎。组织蛋白酶S在MHC II类依赖性抗原表达中起着重要的作用；组织蛋白酶S的抑制显著降低对抗原的响应，致使组织蛋白酶S成为哮喘和某些自身免疫疾病的药物靶标。(Riese等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)1998，101：2351-2363)。组织蛋白酶还与肿瘤侵袭和转移、以及中枢神经系统肿瘤如星形细胞瘤、成胶质细胞瘤和脑膜瘤有关。(Berquin等人，药物发现和设计的远景(Perspect.Drug Discovery Design)1995，2：371-388；Levicar等人，神经肿瘤学杂志(J.Neurooncol.)2002，58：21-32)。
一方面，本发明化合物是式(1)化合物或其可药用盐：

其中：
X是O或S；
R¹是OR²、卤素、(CR₂)_nR³、硝基、氰基、氨基、酰氨基、氨磺酰，或者是任选取代的C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_3-6炔基；
R²是H、(CR₂)_nR³，或者是任选取代的C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_3-6炔基；
R³是任选取代的芳基、杂芳基、碳环或杂环；
m是1-3；并且
n是0-4。
在一个实施方案中，本发明的化合物可以用于抑制类木瓜蛋白酶的组织蛋白酶。表1显示了各种本发明化合物的抑制不同组织蛋白酶的表观抑制常数(K_i(app)，μM)，St_rel＝相对立体构象。



表1
环氨基甲酸酯8和12-16显示了对所有类木瓜蛋白酶的组织蛋白酶的抑制活性。在所述蛋白酶家族中，对组织蛋白酶B的表观K_i值最低，接着是对组织蛋白酶S、C、L、和K的。观察到对组织蛋白酶V、X、F和H具有中等活性。所述化合物对半胱氨酸蛋白酶的其他家族如胱天蛋白酶以及丝氨酸蛋白酶家族成员如hepsin、凝血酶、MT-SP1或胰蛋白酶无活性。
通常地，将反式与顺式形式的立体异构体相比时K_i值有降低(参考：8对12)。当与苯基取代的类似物14相比时，包含更疏水的二甲基苯基基团的类似物12似乎在组织蛋白酶组中一致地更有活性。当与氧代-氨基甲酸酯类相比时，硫代氨基甲酸酯13具有显著更低的抑制作用。烷基取代的类似物15(R＝苄基)和16(R＝异丙基)通常具有比12或14高约10-倍的K_i值。例外的是苄基取代的类似物15对于组织蛋白酶B的低纳摩尔活性，其代表了本系列中对组织蛋白酶B最有选择性的抑制剂(100倍)。
尽管作用机制对实现本发明而言不是必须的，但还是在透析研究中对本发明的二环氨基甲酸酯类的抑制机制进行考察。简单来讲，首先在37℃将组织蛋白酶B与0.2μM的化合物12(200×K_i)一起孵育以完全抑制催化活性(抑制剂处理的为2.9rfu/秒，而溶媒对照的为121rfu/秒)。然后将混合物于4℃彻底地透析以除去非结合的抑制剂，而后在37℃再次测量组织蛋白酶活性(抑制剂处理的为51rfu/秒，而溶媒对照的为71rfu/秒)。化合物12处理的样品中的组织蛋白酶B活性经透析后的明显恢复表明化合物12是部分可逆的抑制剂。然而，对进展曲线的仔细考察揭示出底物转化在分析过程中是加速的(用虚线箭头指示)。这种速率的增加可能是由共价结合的化合物12从活性位点的温度敏感性释放引起的。
在胰蛋白酶/糜蛋白酶消化后用质谱分析了组织蛋白酶B和抑制剂(化合物12)间可能的加合物形成。从未处理的组织蛋白酶B样品鉴定受试酶(组织蛋白酶B)的两个活性位点片段为¹⁹EIRDQGSCGSC^＊W³⁰和²²DQGSCGSC^＊W³⁰。对于抑制剂处理过的组织蛋白酶B而言，两个片段都获得了247的质量，相应于12与催化的半胱氨酸残基(C^＊)的单共价结合。所述加合物的稳定性对温度增加敏感。与保持在冰上的对照相比，37℃下2小时的孵育促进了所述酶-抑制剂加合物的解离，导致代谢物的丰度增加4倍。代谢物的多反应监测(MRM)特征与提出的解离产物11相同。
总之，本发明提供了对组织蛋白酶家族具有选择性的式(1)化合物，其对亚型的选择性按B＞S＞C、L、K＞V、X、F、H的顺序。观察到优选相对于氨基甲酸酯的氧为顺式构型的疏水的R-基团，其对组织蛋白酶B的表观K_i值在单位数纳摩尔范围内。架构中的氨基甲酸酯官能团实质上是不稳定的，并为被活性位点半胱氨酸硫醇亲核进攻提供了薄弱的点。接着双环进行开环并共价键合到催化的半胱氨酸上，导致所述酶的抑制。这种假设与消化酶的质谱分析相一致。在用化合物12孵育后，包含催化半胱氨酸的片段共价携带所述抑制剂。透析研究中所见的非线性恢复速率和经MRM所得代谢物特征表明抑制剂在环境温度下以其开环合成前体11的形式缓慢水解离开所述酶。
施用和药物组合物
通常，本发明的化合物以治疗有效量通过本领域已知的任何普通和可接受的方式单独或与一种或多种治疗剂联合施用。治疗有效量可根据疾病的严重程度、个体的年龄和相关健康状况、所用化合物的效能及其它因素而宽泛地变化。通常，显示约0.03至2.5mg/kg体重的日剂量可系统地获得满意效果。在较大的哺乳动物如人中推荐的日剂量为约0.5mg至约100mg，便利地施用，如以每天高达4次的分开的剂量或以缓释的形式施用。口服施用的适当的单位剂量形式包含约1至50mg活性成分。
本发明化合物可以作为药物组合物通过任何常规途径施用，尤其是胃肠道施用，例如口服，例如以片剂或胶囊形式；或胃肠外施用，例如以可注射溶液剂或混悬剂形式；局部施用，例如以洗剂、凝胶剂、软膏剂或乳膏剂形式；或以鼻用或栓剂形式施用。
包含游离形式或可药用盐形式的本发明化合物以及至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物可以通过混合、制粒或包衣方法以常规方式制造。例如，口服组合物可以是片剂或明胶胶囊，其包含活性成分和a)稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸的镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；对片剂而言，还包含c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羰甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；并且如果需要的话，还包含d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐、或泡腾剂混合物；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。可注射组合物可以是含水等渗溶液或混悬液，以及栓剂可以由脂肪乳液或混悬液制备。
组合物可以是灭菌的和/或含有辅助剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。另外，它们还可以含有其它有治疗价值的物质。用于透皮应用的适宜制剂包含有效量的本发明化合物和载体。载体可以包括有助于通过宿主皮肤的可吸收的药理学可接受的溶剂。例如，透皮装置是绷带的形式，该绷带包含背衬膜、含有化合物和任选的载体的贮库、任选的速率控制屏障(以便在延长的时期内以受控和预定的速率递送化合物至宿主皮肤)和将该装置固定于皮肤的手段。还可以应用基质透皮制剂。适于局部应用(例如用于皮肤和眼)的制剂可以是本领域众所周知的水溶液剂、软膏剂、乳膏剂或凝胶剂。这类制剂可以包含增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
本发明化合物可以以治疗有效量与一种或多种治疗剂联合施用(药物组合)。本发明化合物与其它治疗联合施用时，共同施用的化合物的剂量将理所当然地根据所使用的共同药物的类型、所使用的具体药物、要治疗的病症等而变化。
例如，本发明化合物可以与化疗剂组合用于治疗细胞增殖性病症和肿瘤。可以用于本发明的组合物和方法的化疗剂的实例包括但不限于蒽环类、烷化剂(如丝裂霉素C)、烷基磺酸酯类、氮丙啶类、乙烯亚胺类、甲基蜜胺类(methylmelamines)、氮芥类、亚硝基脲类、抗生素类、抗代谢物类、叶酸类似物(例如二氢叶酸还原酶抑制剂，如甲氨喋呤)、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶类、鬼臼毒素类、含铂物质、干扰素类和白细胞介素类。可以用于本发明的组合物和方法的已知化疗剂的具体实例包括但不限于白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、美妥替哌、乌瑞替派、六甲密胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、三羟甲密胺(trimethylolomelamine)、苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、阿克拉霉素、放线菌素F(1)、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、道诺霉素、6-重氮基-5-氧代-1-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、普卡霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星、二甲叶酸、甲氨喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、氟脲嘧啶、替加氟、L-门冬酰胺酶、阿法链道酶、醋葡醛内酯、醛磷酰胺苷(aldophosphamide glycoside)、5-氨基乙酰丙酸、安吖啶、bestrabucil、比生群、卡铂、顺铂、defofamide、秋水仙胺、地吖醌、elfornithine、依利醋铵、依托格鲁、依托泊苷、氟他胺、硝酸镓、羟基脲、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白细胞介素-2、香菇多糖、氯尼达明、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、硝氨丙吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、鬼臼酸、2-乙基酰肼、丙卡巴肼、雷佐生、西佐喃、锗螺胺、紫杉醇、他莫昔芬、替尼泊苷、替奴佐酸、三亚胺醌、2，2′，2″-三氯三乙基胺、乌拉坦、长春碱、长春新碱和长春地辛。
协同效应也可以与其他免疫调节物质或抗炎物质产生，例如当与以下物质联合使用时：环孢素、雷帕霉素或子囊霉素或其免疫抑制类似物，例如环孢素A(CsA)、环孢素G、FK-506、雷帕霉素或相当的化合物、皮质类固醇类、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、布喹那、来氟米特、咪唑立宾、麦考酚酸、吗替麦考酚酸、15-脱氧精胍菌素、免疫抑制剂抗体，尤其是白细胞受体例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45、CD58或它们的配体的单克隆抗体，或其它免疫调节的化合物，如CTLA41g。
本发明还提供药物组合，例如药盒，所述药盒包含a)第一种物质，其为游离形式或可药用盐形式的文中公开的本发明化合物；和b)至少一种共同物质。所述药盒可以包括其施用说明书。
本发明化合物的制备方法
本发明化合物可以依照流程图1制备。

流程图1
在流程图1中，试剂和反应条件是：(a)CbzCl，0.5M Na₂CO₃/二氧六环，5∶2，室温，5h；(b)mCPBA，DCM，0℃-室温，7h；(c)ROH，2MNaOH/MeCN 1∶4，回流，48h；(d)1 atm H₂，Pd/C(催化量)，EtOH，室温，3h；(e)三光气，NEt₃，DCM，0℃，1h；(f)NaH，室温，18h；(g)PPh₃，DEAD，对硝基苯甲酸，THF，50℃，48h；(h)NaOH，MeOH，室温，1h；(i)1 atm H₂，Pd/C(催化量)，EtOH，室温，3h；(j)OsO₄，NMO，柠檬酸，tBuOH/H₂O 1∶1，50℃，12h；(k)HBr，HOAc，0℃-室温，3h；(l)2，3-二甲基苯酚，K₂CO₃，MeCN，60℃，12h；(m)MeNH₂，MeOH，50℃，2h；(n)CDI，DMAP，苯，回流，4h。化合物3-21是外消旋混合物。
根据Paioni描述的合成方法(U.S.专利号4,160,837，整体引入文中作为参考)，将四氢吡啶2经两步转化为外消旋的Cbz-保护的环氧化物3。环氧化物3在碱水条件下开环(ROH＝2，3-二甲基苯酚)提供区域异构体的混合物。如有利的反-双轴开环所预期，4-芳氧基哌啶4与3-芳氧基哌啶5的比率是约5∶1。所述区域异构体经色谱分离和氢解去保护，得到开环形式6和7。6的环化需要两步步骤。首先用三光气和三乙胺使哌啶-氮选择性地羰基化为相应的氯甲酸酯，然后用氢化钠使3-羟基基团去质子化，其导致自发的分子内环化作用，而得到外消旋的反-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-6-氧杂-1-氮杂-二环[3.2.1]辛-7-酮8。将7的氯甲酸酯中间体环化成二环9的尝试没有成功，很可能是由于分子内闭环所需的哌啶环的不利的船式构象导致的。
采用对硝基苯甲酸作为亲核试剂的Mitsunobu反应被用于转化化合物4的3位处的立构中心。或者，所述转化可以用使用Pyr·SO₃和Red-Al的氧化/还原反应序列完成。在甲醇碱中皂化中间体10，随后去保护得到哌啶11。类似于上述步骤的分子内环化提供顺-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-6-氧杂-1-氮杂-二环[3.2.1]辛-7-酮12。
立体异构体8和12都作为白色、稳定的固体被分离得到。所述化合物在含水的碱性或中性溶液中也是稳定的，然而在相当程度的酸性条件下(pH＜2)观察到自发的开环。以与合成12相似的方式合成类似物13-16(表1，前面)。在类似物13的情况下，在环化步骤中用硫光气代替光气；对于类似物15和16而言，在环氧化物3开环中使用相应的醇(对于15用苯甲醇，对于16用异丙醇)作为溶剂并使用NaH。经由二羟基化的另一合成路线导致得到保护的四氢吡啶17。选择性环化和烷化去保护的二醇未能提供期望的二环氨基甲酸酯类似物。用HBr处理环氧化物3选择性地提供溴化物18，其可环化为氨基甲酸酯19，但是任何置换溴化物的尝试都没有成功。以1-溴-2，3-环氧丙烷20为原料经3步合成对照化合物21。
另外，本发明化合物可以以游离形式或其盐(如果存在成盐基团)或酯(如果存在成酯基团)获得。具有酸性基团的本发明化合物可以与可药用碱(如含水的碱金属氢氧化物)有利地在醚或醇溶剂例如低级烷醇存在下转化成盐。所得盐可以转化为游离化合物，例如通过用酸处理。这些盐或其它盐还可以用于纯化获得的化合物。通过与适当的胺例如二乙胺等反应可以获得铵盐。
在某些方面，具有碱性基团的本发明化合物可以转化成酸加成盐，特别是可药用盐。所述盐例如可以与下列酸形成：无机酸，例如矿物酸(例如硫酸、磷酸或氢卤酸)；有机羧酸(例如C₁-C₄烷基羧酸如乙酸，其可以是未取代的或被卤素取代的；饱和或不饱和的二羧酸，例如草酸、琥珀酸、马来酸或反丁烯二酸；羟基羧酸，例如乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸)；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸)；有机磺酸(例如C₁-C₄烷基磺酸，例如甲磺酸)；或芳基磺酸，其可以是未取代的或取代的(例如被卤素)。优选的是与盐酸、甲磺酸和马来酸形成的盐。
鉴于游离化合物和其盐或酯形式的化合物之间的密切关系，在本文中当提及化合物时，也意指相应的盐或酯，前提是其在所述情况下是可能的或适当的。所述化合物，包括它们的盐，也可以以其水合物形式获得，或含有用于它们的结晶的其他溶剂。
包含游离羟基的本发明化合物也可以以可药用的、生理可裂解的酯的形式存在，且其可包括在本发明的范围内。此类可药用酯可以优选是前药酯衍生物，其在生理条件下通过溶剂解或裂解可转化成相应的包含游离羟基的本发明化合物。适宜的可药用前药酯可以是衍生自羧酸、碳酸单酯或氨基甲酸的那些，优选的酯衍生自任选取代的低级烷酸或芳基羧酸。
对本领域技术人员来讲显而易见，本发明的某些化合物可能具有不对称碳原子(手性中心)或双键；外消旋物、非对映异构体、对映体、几何异构体和单独的异构体都可以包括在本发明的范围内。
式(1)化合物的合成的详细实例可见于以下实施例，以举例说明但不用于限制本发明。
实施例1
反-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-6-氧杂-1-氮杂-二环[3.2.1]辛-7-酮(8)3，6-二氢-2H-吡啶-1-甲酸苄酯(2)
将1，2，3，6-四氢吡啶(1.1mL，12mmol)溶解于二噁烷(10mL)中。加入0.5M碳酸钠的水溶液(25mL，12.5mmol)，随后加入氯甲酸苄酯(1.8mL，12mmol)。在室温下搅拌混合物3h，然后用乙酸乙酯(50mL)稀释。分离有机层，用水洗涤并用硫酸镁干燥。真空除去溶剂，得到3，6-二氢-2H-吡啶-1-甲酸苄酯，为无色液体。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.40-7.33(m，5H)，5.85(m，1H)，5.68(m，1H)，5.19(s，2H)，4.00(t，J＝2Hz，2H)，3.60(t，J＝5.7Hz，2H)，1.72(m，2H)。C₁₃H₁₆NO₂(M+H⁺)的MS计算值为218.1，实测值218.3。
7-氧杂-3-氮杂-二环[4.1.0]庚烷-3-甲酸苄酯(3)
将3，6-二氢-2H-吡啶-1-甲酸苄酯2(2.6g，12mmol)溶解于二氯甲烷(100mL)中。历经20分钟逐滴加入溶解于二氯甲烷(40mL)中的间氯过氧苯甲酸(4.5g，18mmol)。将混合物在室温下搅拌7h，然后用1M碳酸钠水溶液将上述溶液洗涤三次，用盐水洗涤一次。分离有机相，干燥(MgSO₄)并真空浓缩，得到外消旋环氧化物7-氧杂-3-氮杂-二环[4.1.0]庚烷-3-甲酸苄酯(3)，为无色油状物。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.40-7.32(m，5H)，5.14(s，2H)，3.99(m，1H)，3.80(m，1H)，3.53(m，1H)，3.31(m，1H)，3.24(m，1H)，2.10(m，1H)，1.96(m，1H)。C₁₃H₁₆NO₃(M+H⁺)的MS计算值为234.1，实测值234.3。
反-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-3-羟基-哌啶-1-甲酸苄酯(4)和反-3-(2，3-二甲基-苯氧基)-4-羟基-哌啶-1-甲酸苄酯(5)
将2，3-二甲基苯酚和7-氧杂-3-氮杂-二环[4.1.0]庚烷-3-甲酸苄酯(3)(1.0g，4.3mmol)溶解于乙腈(20mL)中。加入2N氢氧化钠水溶液(5mL)，并将混合物加热回流48h。真空除去乙腈，用水(20mL)稀释含水残留物并用二氯甲烷(50mL)萃取两次。用水和盐水洗涤合并的有机层，用MgSO₄干燥并浓缩。将粗产物通过快速色谱法(己烷/乙酸乙酯梯度)分离，得到反-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-3-羟基-哌啶-1-甲酸苄酯4和区域异构体反-3-(2，3-二甲基-苯氧基)-4-羟基-哌啶-1-甲酸苄酯5，为白色固体。4：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.58-7.50(m，5H)，7.24(t，J＝7.9Hz，1H)，7.01(d，J＝7.5Hz，1H)，6.97(d，J＝8.2Hz，1H)，5.35(s，2H)，4.44(m，1H)，4.26(m，1H)，4.08(m，1H)，4.01(m，1H)，3.50(m，2H)，2.47(s，3H)，2.35(s，3H)，2.28(m，1H)，1.85(m，1H)。C₂₁H₂₆NO₄(M+H⁺)的MS计算值为356.2，实测值356.3。5：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.53-7.46(m，5H)，7.15(t，br，1H)，7.01(d，J＝7.5Hz，1H)，6.95(d，br，1H)，5.35(br，2H)，4.28-4.15(m，4H)，3.28-3.22(m，2H)，2.46(s，3H)，2.34(m，1H)，2.33(s，3H)，1.84(m，1H)。C₂₁H₂₆NO₄(M+H⁺)的MS计算值为356.2，实测值356.3。
反-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-哌啶-3-醇(6)
将反-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-3-羟基-哌啶-1-甲酸苄酯4(700mg，2.0mmol)溶解于EtOH(10mL)中，并加入催化量的钯(10％，在炭上)。在1 atm的氢气下室温搅拌3h后，将混合物经过滤并用EtOH洗涤。真空浓缩滤液，得到哌啶醇6，为白色固体：¹H-NMR(400MHz，MeOD)δ＝7.04(t，J＝7.9Hz，1H)，6.85(d，J＝6.0Hz，1H)，6.80(d，J＝7.7Hz，1H)，4.38(m，1H)，3.96(m，1H)，3.34(m，1H)，3.16(m，1H)，2.97(m，2H)，2.28(s，3H)，2.27(m，1H)，2.21(s，3H)，1.83(m，1H)。C₁₃H₂₀NO₂(M+H⁺)的MS计算值为222.1，实测值222.3。
反-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-6-氧杂-1-氮杂-二环[3.2.1]辛-7-酮(8)
将哌啶醇6(50mg，0.23mmol)溶解于DCM(10mL)中。加入三光气(45mg，0.15mmol)，并将混合物冷却至0℃。然后经50分钟缓慢增加地加入三乙胺(96μL，0.69mmol)。加入氢化钠(30mg，0.75mmol)，将混合物升至室温并在室温下搅拌18h。用0.25M磷酸盐缓冲液(pH6.2)洗涤混合物，分离有机层，干燥(MgSO₄)并浓缩。将粗产物经反相HPLC(MeCN/H₂O梯度，无酸性添加剂)纯化，得到为白色固体的8：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.06(t，J＝7.9Hz，1H)，6.85(d，J＝7.5Hz，1H)，6.66(d，J＝8.2Hz，1H)，4.80(t，J＝4.3Hz，1H)，4.73(t，J＝4.3Hz，1H)，3.70(d，J＝11.9Hz，1H)，3.47-3.38(m，2H)，3.30(m，1H)，2.31(m，1H)，2.29(s，3H)，2.19(s，3H)，2.00(m，1H)。C₁₄H₁₈NO₃(M+H⁺)的MS计算值为248.1，实测值248.3。
实施例2
反-3-(2，3-二甲基-苯氧基)-哌啶-4-醇(7)
按照实施例1中对哌啶醇6所述的方法用5代替4作为反应物，获得为白色固体的反-3-(2，3-二甲基-苯氧基)-哌啶-4-醇(7)。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.03(t，J＝7.9Hz，1H)，6.82(d，J＝6.2Hz，1H)，6.81(d，J＝7.5Hz，1H)，4.08(m，1H)，3.88(m，1H)，3.34(m，1H)，3.12(m，1H)，2.73(m，1H)，2.59(m，1H)，2.27(s，3H)，2.16(s，3H)，2.12(m，1H)，1.64(m，1H)。C₁₃H₂₀NO₂(M+H⁺)的MS计算值为222.1，实测值222.3。
实施3
顺-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-6-氧杂-1-氮杂-二环[3.2.1]辛-7-酮(12)
将氨基甲酸苄酯4(0.93g，2.6mmol)、三苯基膦(2.07g，7.9mmol)和对硝基苯甲酸(1.32g，7.9mmol)溶解于THF(50mL)中。将混合物冷却至0℃，然后缓慢加入DEAD(1.24mL，7.9mmol)。于50℃将混合物搅拌48h，浓缩并通过快速色谱法(己烷/乙酸乙酯梯度)纯化，得到顺-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-3-(4-硝基-苯甲酰基氧基)-哌啶-1-甲酸苄酯，为白色固体：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝8.21(d，J＝8.8Hz，2H)，8.03(d，J＝8.0Hz，2H)，7.37-7.24(m，5H)，6.99(t，J＝7.8Hz，1H)，6.79(d，J＝7.4Hz，1H)，6.73(d，J＝8.2Hz，1H)，5.36(m，1H)，5.14(m，1H)，5.03(m，1H)，4.69(m，1H)，4.16(m，1H)，3.96-3.46(m，3H)，2.24(s，3H)，2.19(m，1H)，2.05(s，3H)，2.02(m，1H)。C₂₈H₂₉N₂O₇(M+H⁺)的MS计算值为505.2，实测值505.3。
顺-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-3-羟基-哌啶-1-甲酸苄酯(10)
将NaOH粉末(0.4g，10mmol)溶解于MeOH(20mL)中。加入顺-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-3-(4-硝基-苯甲酰基氧基)-哌啶-1-甲酸苄酯(0.5g，1mmol)，并在室温下将混合物搅拌1h。浓缩混合物，加入DCM并用水将有机层洗涤两次。将有机层用MgSO₄干燥并浓缩，得到顺-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-3-羟基-哌啶-1-甲酸苄酯，为白色固体：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.39-7.28(m，5H)，7.05(t，J＝7.9Hz，1H)，6.84(d，J＝7.5Hz，1H)，6.77(d，J＝8.2Hz，1H)，5.17(s，2H)，4.55(m，1H)，3.94(m，1H)，3.80(m，1H)，3.65(m，1H)，3.52(m，2H)，2.29(s，3H)，2.19(s，3H)，2.09(m，1H)，1.74(m，1H)。C₂₁H₂₆NO₄(M+H⁺)的MS计算值为356.2，实测值356.3。
顺-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-哌啶-3-醇(11)
将顺-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-3-羟基-哌啶-1-甲酸苄酯(300mg，0.85mmol)溶解于EtOH(20mL)中并加入催化量的钯(10％在炭上)。在1 atm的氢气下室温搅拌3h后，将混合物经过滤并用EtOH洗涤。真空浓缩滤液，得到顺-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-哌啶-3-醇(11)，为白色固体：¹H-NMR(400MHz，MeOD)δ＝6.98(t，J＝7.9Hz，1H)，6.82(d，J＝8.2Hz，1H)，6.74(d，J＝7.5Hz，1H)，4.48(m，1H)，3.90(m，1H)，3.04(m，1H)，2.91(m，1H)，2.83(m，1H)，2.64(m，1H)，2.24(s，3H)，2.20(s，3H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)。C₁₃H₂₀NO₂(M+H⁺)的MS计算值为222.1，实测值222.3。
顺-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-6-氧杂-1-氮杂-二环[3.2.1]辛-7-酮(12)
将顺-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-哌啶-3-醇11(50mg，0.23mmol)溶解于DCM(10mL)中。加入三光气(45mg，0.15mmol)并将混合物冷却至0℃。然后经50分钟缓慢增加地加入三乙胺(96μL，0.69mmol)。在升至室温后，加入氢化钠(30mg，0.75mmol)，并在室温下将混合物搅拌过夜。用DCM稀释混合物，用水洗涤，并分离有机层、干燥(MgSO₄)并浓缩。粗产物经反相HPLC(MeCN/H₂O梯度，无酸性添加剂)纯化，得到为白色固体的12：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.03(t，J＝7.9Hz，1H)，6.85(d，J＝7.5Hz，1H)，6.72(d，J＝8.2Hz，1H)，4.87(d，J＝5.1Hz，1H)，4.43(dd，J＝6.7Hz，J＝9.5Hz，1H)，3.56(dd，J＝5.1Hz，J＝12.2Hz，1H)，3.47(dd，J＝7.3Hz，J＝14.1Hz，1H)，3.47(dt，J＝4.9Hz，J＝13.7Hz，1H)，2.89(d，J＝12.1Hz，1H)，2.35(m，1H)，2.28(s，3H)，2.22(m，1H)，2.18(s，3H)。C₁₄H₁₈NO₃(M+H⁺)的MS计算值为248.1，实测值248.3。
实施例4
顺-4-(2，3-二甲基-苯氧基)-6-氧杂-1-氮杂-二环[3.2.1]辛烷-7-硫酮(13)
按照二环氨基甲酸酯12的方法，用硫光气代替三光气，制备为白色固体的标题化合物13：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.04(t，J＝7.9Hz，1H)，6.86(d，J＝7.5Hz，1H)，6.72(d，J＝8.2Hz，1H)，5.06(d，J＝5.3Hz，1H)，4.39(t，J＝8.3Hz，1H)，3.61(m，2H)，3.13(m，1H)，3.05(d，J＝12.1Hz，1H)，2.31(m，1H)，2.28(s，3H)，2.20(s，3H)，2.15(m，1H)。C₁₄H₁₈NO₂S(M+H⁺)的MS计算值为264.1，实测值264.3。
实施例5
顺-4-苯氧基-6-氧杂-1-氮杂-二环[3.2.1]辛-7-酮(14)
按照二环氨基甲酸酯12的方法，用苯酚代替2，3-二甲基苯酚，制备为白色固体的标题化合物14：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.34-7.28(m，2H)，7.05-6.94(m，3H)，4.93(d，J＝4.6Hz，1H)，4.50(m，1H)，3.63(m，1H)，3.51(m，1H)，2.99(m，1H)，2.94(d，J＝11.9Hz，1H)，2.39(m，1H)，2.20(m，1H)。C₁₂H₁₄NO₃(M+H⁺)的MS计算值为220.1，实测值220.3。
实施例6
顺-4-苄基氧基-6-氧杂-1-氮杂-二环[3.2.1]辛-7-酮(15)
将环氧化物3(1.0g，4.3mmol)溶解于苄醇(5mL)中。加入氢化钠(0.86g，21.5mmol)，并于50℃将混合物搅拌过夜。然后真空除去溶剂，将残留物通过快速色谱法(己烷/乙酸乙酯梯度)纯化，得到3-羟基-4-异丁氧基-哌啶-1-甲酸苄酯。按照二环氨基甲酸酯12的方法，制备为白色固体的标题化合物15：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.38-7.32(m，5H)，4.82(d，J＝6.1Hz，1H)，4.61(s，2H)，3.67(m，1H)，3.52(m，1H)，3.41(m，1H)，2.86(m，1H)，2.78(d，J＝12.1Hz，1H)，2.21(m，1H)，2.04(m，1H)。C₁₃H₁₆NO₃(M+H⁺)的MS计算值为234.1，实测值234.3。
实施例7
顺-4-异丁氧基-6-氧杂-1-氮杂-二环[3.2.1]辛-7-酮(16)
按照二环氨基甲酸酯15的方法，用异丁醇代替苄醇，制备为白色固体的标题化合物16：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝4.83(d，J＝5.1Hz，1H)，3.56(m，2H)，3.43(m，1H)，3.26(m，2H)，2.89(m，1H)，2.81(d，J＝12.0Hz，1H)，2.21(m，1H)，2.00(m，1H)，1.84(m，1H)，0.92(d，J＝6.7Hz，6H)。C₁₀H₁₈NO₃(M+H⁺)的MS计算值为200.1，实测值200.3。
实施例8
反-4-溴-6-氧杂-1-氮杂-二环[3.2.1]辛-7-酮(19)
将7-氧杂-3-氮杂-二环[4.1.0]庚烷-3-甲酸苄酯(3)(1.0g，4.3mmol)溶解于DCM(32mL)中。将溶液冷却至0℃，然后逐滴加入氢溴酸(30％的乙酸溶液，8mL，30mmol)，并于室温将混合物搅拌3h。产物沉淀，并将其过滤，得到4-溴-哌啶-3-醇氢溴酸盐(18)，为白色固体：¹H-NMR(400MHz，MeOD)δ＝4.46(m，1H)，4.25(m，1H)，3.77(m，1H)，3.51(m，1H)，3.36(m，2H)，2.88(m，1H)，2.28(m，1H)。C₅H₁₁BrNO(M+H⁺)的MS计算值为180.0，实测值180.3。
将4-溴-哌啶-3-醇氢溴酸盐(18)(100mg，0.4mmol)和三光气(80mg，0.27mmol)混悬于DCM(20mL)中并冷却至0℃。然后经60分钟缓慢增加地加入三乙胺(332μL，2.4mmol)。在升至室温后，于室温将混合物搅拌过夜。通过快速色谱法(己烷/乙酸乙酯梯度)纯化，得到为白色固体的19：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝4.71(t，J＝4.2Hz，1H)，4.42(m，1H)，3.76(d，J＝12.3Hz，1H)，3.46-3.24(m，3H)，2.75(m，1H)，2.07(m，1H)。C₆H₉BrNO₂(M+H⁺)的MS计算值为206.0，实测值206.3。
实施例9
5-(2，3-二甲基-苯氧基甲基)-3-甲基-噁唑烷-2-酮(21)
将1-溴-2，3-环氧丙烷20(0.7mL，8.2mmol)、2，3-二甲基苯酚(1.0g，8.2mmol)和K₂CO₃(1.13g，8.2mmol)混悬于MeCN(25mL)中并于60℃搅拌过夜。浓缩混合物，将残留物用DCM稀释并用水洗涤两次。干燥有机层，浓缩，并通过快速色谱法(己烷/乙酸乙酯梯度)纯化，得到2-(2，3-二甲基-苯氧基甲基)-环氧乙烷，为无色油状物：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.05(t，J＝7.9Hz，1H)，6.81(d，J＝7.5Hz，1H)，6.70(d，J＝8.2Hz，1H)，4.21(dd，J＝3.1Hz，J＝11.0Hz，1H)，3.97(dd，J＝5.4Hz，J＝11.0Hz，1H)，3.38(m，1H)，2.91(t，J＝4.5Hz，1H)，2.79(dd，J＝2.7Hz，J＝5.0Hz，1H)，2.28(s，3H)，2.18(s，3H)。C₁₁H₁₅O₂(M+H⁺)的MS计算值为179.1，实测值179.1。
1-(2，3-二甲基-苯氧基)-3-甲基氨基-丙-2-醇
将2-(2，3-二甲基-苯氧基甲基)-环氧乙烷(0.3g，1.7mmol)溶解于MeOH(2mL)中。加入甲胺(40％的水溶液，0.3mL，3.4mmol)，并于50℃将混合物搅拌2h。真空除去溶剂，将残留物经反相HPLC(MeCN/H₂O梯度)纯化，得到1-(2，3-二甲基-苯氧基)-3-甲基氨基-丙-2-醇，为无色油状物：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.02(t，J＝7.9Hz，1H)，6.80(d，J＝7.5Hz，1H)，6.61(d，J＝8.1Hz，1H)，4.42(m，1H)，3.98(m，2H)，3.26(m，2H)，2.80(br，3H)，2.24(s，3H)，2.10(s，3H)。C₁₂H₂₀NO₂(M+H⁺)的MS计算值为210.1，实测值210.1。
5-(2，3-二甲基-苯氧基甲基)-3-甲基-噁唑烷-2-酮(21)
将1-(2，3-二甲基-苯氧基)-3-甲基氨基-丙-2-醇(180mg，0.86mmol)溶于苯(10mL)中。加入羰基二咪唑(167mg，1.03mmol)，随后加入催化量的DMAP。将混合物加热回流4h。真空除去溶剂，将残留物经反相HPLC(MeCN/H₂O梯度)纯化，得到为无色油状物的21：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.05(t，J＝7.9Hz，1H)，6.82(d，J＝7.5Hz，1H)，6.67(d，J＝8.2Hz，1H)，4.84(m，1H)，4.11(d，J＝4.5Hz，2H)，3.74(t，J＝8.7Hz，1H)，3.58(t，J＝5.7Hz，J＝8.6Hz，1H)，2.94(s，3H)，2.27(s，3H)，2.12(s，3H)。C₁₃H₁₈NO₃(M+H⁺)的MS计算值为236.1，实测值236.1。
实施例10
组织蛋白酶B消化物的质谱分析
使用LCQ Deca XP Plus质谱仪进行样品的LC-MS分析，所述质谱仪用为在线脱盐而配置的自制纳米喷雾源改进，其如Licklider等人，Anal.Chem.74：3076-3083(2002)中所述。将肽消化物上载到内径100μm的预柱中，所述预柱填装有2cm的Monitor，5μm，C18(Column Engineering，Ontario，加拿大)，并用0.1M HOAc以5μL/min脱盐5分钟。脱盐后，将预柱与内径75μm的拉制尖头(Pulled tip)(5μm开口)在线连接，所述拉制尖头填装有8cm的与上相同的填装材料，并且ACN浓度经90分钟从0％增加至50％。然后在回到0％前用95％ACN冲洗所述柱。来自HPLC泵的流体(flow)在到预柱之前被动分开，以达到250nL/min。以数据依赖的扫描模式，进行一次全扫描随后对最强的三个前体离子进行三个MS-MS扫描，获得MS-MS。先前选择的前体的动态排除设为1分钟。用TurboSequest(Thermo Electron)分析串联MS数据。用下列参数搜索包含8种蛋白质的定制数据库：可变的甲硫氨酸氧化、半胱氨酸上的甲酰氨基甲基(arboxamidomethyl)加合物、以及半胱氨酸上的氨基甲酸酯加合物(+247)或组氨酸上的氨基甲酸酯加合物(+247)。
实施例11
通过LC-MS/MS从抑制剂处理的组织蛋白酶B中鉴定肽
用胰蛋白酶和糜蛋白酶消化组织蛋白酶B。如方法部分描述那样通过nano-LC-MS/MS鉴定肽。“^”表示羧甲基化的半胱氨酸，并且“#”表示被张紧的(strained)氨基甲酸酯化合物修饰。当控制注射物质的量时，未修饰肽以比经修饰肽小118倍的量存在。如通过完整蛋白的Q-Tof分析所测定，存在自体活化后酶原的额外的裂解，其致使产生具有其它N-末端序列起始点的活性酶。表2指明了与预期的主要裂解产物相关的4-位裂解。

表2
实施例12
温度对二环氨基甲酸酯加合物的影响
用化合物12抑制组织蛋白酶B样品，随后过夜透析以除去任何非-组织蛋白酶结合的化合物。然后通过LC-MS对经透析的样品就解离产物11的存在进行分析。在LC-MS分析之前，在冰上或于37℃将样品孵育2h。用具有多反应监测(MRM)的LC-MS在Applied Biosystems/MDS SCIEX4000 Q TRAP上评估温度对氨基甲酸酯抑制的组织蛋白酶B样品的影响。通过输入合成的标准品测定氨基甲酸酯开环形式的MRM转换(transitions)。对每个选择的转化各自最优化碰撞能量和出口单元电压。将组织蛋白酶B样品上载到在2％ACN、0.1M HOAc中的Phenomenex LunaC5柱(30x2mm)上，并用5分钟线性梯度至70％ACN、0.1M HOAc洗脱，流速为300μL/min。将柱中流出物引入到采用TurboV离子源的4000QTRAP中。源参数为：Cur，10；IS，4500；TEM，450；GS1，30；GS2，15。
用化合物12抑制组织蛋白酶B并透析过夜。透析后(组(panel)A)、在冰上(组B)或于37℃(组C)孵育2小时后，用具有MRM的LC-MS检测化合物11。MRM转换选自化合物11的合成标准品(插入物)的碰撞活化解离。对于化合物11的检测而言，监视到5个MRM转换(222.1至100.0、71.1、69.0、81.9和55.0)，因清晰原因仅将最强的转换作图(222.1至100.0)。
实施例13
温度对张紧的氨基甲酸酯-组织蛋白酶B加合物的稳定性的影响
通过MRM监视到化合物12的代谢物的出现。用代谢物(化合物11)的合成类似物选择和优化MRM转换。于37℃孵育2小时后化合物11的丰度增加了4倍。

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