一种三疣梭子蟹抗病品系的构建方法 【技术领域】
本发明涉及水产遗传育种领域，具体说是一种三疣梭子蟹抗病品系的构建方法。
背景技术
水产动物的遗传育种传统上采用群体选育或杂交的方法进行，目前也有尝试借鉴在蓄禽中采用的家系选育的方法。由于一般水产动物产卵量大、后代数量多，使家系选育非常繁琐，操作困难。群体选育耗时长，收效慢。近年来，国内外学者一直非常关注分子标记辅助育种，但在实际应用中尤其在水产动物蟹类的遗传育种上还未见成效。
本发明在充分考虑各种育种方法、育种途径特点的情况下，通过大量实践和科学实验，成功研制出适合三疣梭子蟹抗病品系培育的一种育种方法。经过三年的实施，证明此方法大大减少了选育环节，加快了育种进程，同时有效避免了小群体繁殖造成的近交衰退现象。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种快速、有效并且操作简便的三疣梭子蟹抗病品系的构建方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
三疣梭子蟹抗病品系的构建方法：以选育材料的线粒体控制区序列的信息作为分子标记，根据分子标记得到遗传变异丰富的群体作为群体选育的基础群体，同时得到以遗传上相互独立的群体作为家系选育的补充材料；首先将基础群体行群体选育所得群体与家系选育的补充材料进行家系选育，而后将家系选育所得抗病性状稳定的群体之间进行家系间杂交组合，所得抗病性状稳定的家系即为抗病品系，其中每一步骤选育材料均为经感染源浸泡感染后半致死浓度存活的个体。
所述选育材料的线粒体控制区序列的信息作为分子标记为以选育材料的基因组DNA为模板采用引物上游引物序列5’-AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT-3’和下游引物序列5’-GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG-3’进行PCR扩增获得线粒体控制区的序列片段，所述选育材料为各地区蟹的群体。所述PCR扩增时PCR总反应体积为25uL，其中含10mM dNTP 0.5ul，每个引物5uM 1ul，0.4U Taq酶，10×PCR Buffer2.5ul，25mM Mgcl2 1.5ul；PCR反应程序：95度3min；然后95度30s，55度30s，72度1min，循环29次；最后72度7min。所述遗传变异丰富的群体为将各地区蟹的群体的线粒体控制区序列作为分子标记中筛选出的丹东群体、青岛群体、营口群体、连云港群体或宁波群体。所述遗传上相互独立的群体为将各地区蟹的群体的线粒体控制区序列作为分子标记中筛选出的莱州湾群体和广西北海群体。所述每一步骤选育材料均为经溶藻弧菌72小时半致死浓度浸泡感染后的剩余个体。
本发明所具有的优点：
1.育种的遗传背景清晰，避免了传统育种的盲目性。利用线粒体控制区序列作为分子标记，区分了我国野生三疣梭子蟹群体的遗传结构，明确了各地理种群间的遗传关系以及各地理种群的遗传多样性，使育种材料的选择具有更强的目的性。
2.以遗传变异丰富的当地蟹为群体选育的基本材料，有利于保留其适应性的遗传因素，增强选择的抗病品系的适应力，培养适合当地养殖的优良品系。
3.以遗传上相互独立的群体作为家系选育的补充遗传材料，在有效利用遗传资源地同时，也有效缓解了由于小群体繁殖造成的近交衰退现象。
4.采用分子标记选育、群体选育与家系选育并行的方法构建三疣梭子蟹抗病品系，加快了育种进程，也提高了育种的有效性。
【附图说明】
图1为利用线粒体控制区信息分析我国沿海的三疣梭子蟹群体的遗传结构和遗传多样性图谱。(其利用MEGA3.1软件(Kumar et al.1994)构建基于Kimura双参数模型的系统发育树，节点支持率使用1000次bootstrap检验，其中，DD指丹东群体，YK指营口群体，LZ指莱州群体，QD指青岛群体，LYG指连云港群体，NB指宁波群体，BH指北海群体。大写字母后面的数字是指群体取样时标记的个体排列号码。)
图2为溶藻弧菌感染浓度与死亡率的关系图。
【具体实施方式】
实施例1
以选育材料的线粒体控制区序列的信息作为分子标记，所述选育材料为各地区蟹的群体。使用特异性引物(上游引物序列5’-AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT-3’，下游引物序列5’-GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG-3’)，模板为以选育材料基因组DNA进行PCR体外扩增。PCR总反应体积为25uL，其中含dNTP(10mM)0.5ul，每个引物5uM 1ul，0.4U Taq酶，10×PCR Buffer2.5ul，25mM Mgcl2 1.5ul。PCR反应在Bio-rad MyCycler PCR仪上进行。PCR反应程序：95度3min；然后95度30s，55度30s，72度1min，循环29次；最后72度7min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳、胶回收试剂盒纯化。使用ABI Prism 3100 DNAAnalyzer进行单向测序，得选育材料的线粒体控制区序列的信息；利用MEGA 3.1软件(Kumar et al.1994)构建基于Kimura双参数模型的系统发育树，遗传变异丰富的选育群体将作为群体选育的基础群体，如丹东群体或青岛群体或营口群体或连云港群体或宁波群体(参见图1)；遗传上相互独立的广西北海群体和山东莱州湾群体(参见图1)作为家系选育的补充材料。首先，第一代选育的基础群体为培育地当地蟹，采用的方法为群体选育；其次，得到F1代后，补充北海群体和莱州群体，采用的方法为家系选育；最后，得到F2代后，将抗病性状稳定的家系间进行杂交组合构建新的家系，仍然具有稳定的抗病性状的家系组成抗病品系。所有选育材料都选择以溶藻弧菌为感染源进行浸泡感染，72小时半致死浓度(1.0-2.0×1010)存活的个体作为选育的亲本。
具体为将当地蟹亲本经感染处理存活的群体包括♀、♂各50只进行随机交配，将其后代养殖至成体即为子一代；然后，子一代经同样的感染处理，同时，广西北海群体和山东莱州湾群体也经同样的感染处理，按照以下方式进行杂交组合构建家系：A1-5，♀大×♂大，B1-5，♀大×♂小，C1-5，♀小×♂大，D1-5，♀大×♂广西大，E1-5，♀大×♂广西小，F1-5，大×♂山东大，G1-5，♀大×♂山东小，其中1-5指每组5个重复，共计35个家系，将其后代养殖至成体即为子二代；最后，从子二代中抗病性状稳定的家系中挑选大个体进行家系间杂交组合，构建新的家系，其中仍然表现稳定的抗病性状的家系即为三疣梭子蟹抗病品系。
从图1可知丹东群体或青岛群体或营口群体或连云港群体或宁波群体都为遗传变异丰富的地理群体，而广西北海群体(BH)与山东莱州湾群体(LZ)形成了遗传上相互独立的两个群体。
实施例2
地点：浙江省宁海县。
2005年8月，在浙江省宁波市宁海县双盘涂水产苗种场进宁波象山港东海海区性腺发育成熟的雌性和雄性梭子蟹各50只，用1.0×1010浓度的溶藻弧菌菌液浸泡梭子蟹亲体，72小时后存活个体用清水洗净，放回暂养池暂养。随机交配产生的后代养殖至成体。
2006年10月，在浙江省宁波市宁海县得水水产苗种场将上一年养殖至成体的抗病候选群体经同样的感染处理，同时，将经实施例筛选出的山东莱州湾群体和广西北海群体遗传上相互独立的两个群体经同样病源感染处理后，进行杂交，杂交组合同上一个实施例，共计35组。其中，当地蟹指宁波群体。各杂交组合单独暂养，并陆续孵化，经常规人工育苗，2007年6月共出苗种C1-C2期2.4-3.12万只/kg，共计4.45kg，放养在1个池塘，各家系之间用围隔隔开进行养殖。
2007年10月，在浙江省宁波市宁海县得水水产苗种场，选择前一年养殖的家系中养殖成活率高即抗病力强的家系作为亲本，以2.0×1010浓度的溶藻弧菌为感染源进行与上一年同样的处理，存活的大个体进行各家系间的杂交组合，构建新的家系。然后，新的家系经与上一年同样的暂养、交配、产卵，经常规人工育苗，2008年6月共出苗种C1-C2期2.4-3.12万只/kg，共计10.26kg，放养在1个池塘，各家系之间用围隔隔开进行养殖。其中一个家系即为抗病品系，与野生群体的苗种相比，表现出了明显的抗病力如图2所示。其中蓝色代表野生群体，粉色代表抗病品系，不同浓度的溶藻弧菌感染源为3.2×104，1.8×105，1.0×106和5.6×106cfu·ml-1.
从图2可知抗病品系与野生群体的抗病力实验，结果证明，在不同浓度的溶藻弧菌感染下，抗病品系比野生群体的存活率提高20％以上。