一种血管内皮生长因子单克隆抗体Avastin壳聚糖纳米粒制剂 【技术领域】
本发明涉及医药技术领域，是一种血管内皮生长因子VEGF的单克隆抗体Avastin的纳米粒制剂。
背景技术
脉络膜新生血管和视网膜新生血管分别是年龄相关性黄斑变性(age-relatedmacular degeneration，AMD)和增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabeticretinopathy，PDR)等难治性眼底病最具特征和危害最大的病理改变，也是致盲的重要原因，至今没有好的治疗方法，药物治疗更是几近空白。脉络膜和视网膜新生血管的形成机制复杂，近年来国内外的多项研究表明其发生发展主要与缺氧、血管内皮生长因子(VEGF)表达水平增高诱发新生血管有关，且VEGF含量与其病理过程密切相关；以VEGF为治疗靶点，玻璃体腔注射VEGF的单克隆抗体(Avastin)能有效抑制脉络膜和视网膜新生血管的生成。但治疗时需进行多次玻璃体腔注射，这是一种侵入性治疗方法，不仅操作不便，给患者带来痛苦，而且治疗费用也较昂贵，特别是需要反复多次注射，有引起眼内容炎等的风险，因此不是理想的给药方式。开发安全有效的眼部抗新生血管生成的新制剂，对眼部新生血管性病变的治疗具有十分重要的意义。
由高分子材料制备的纳米粒载体对所包载的蛋白类药物具有靶向和保护作用，能抵御内环境酶、pH等因素的影响，还有缓释作用，提高生物利用度，可以减少给药次数。壳聚糖(Chitson，CS)是自然界来源第二大丰富的亲水性多糖，其良好的生物相容性、无毒和可生物降解特性，赋予其广阔的医药应用前景。但至今未见有关将Avastin制备成壳聚糖纳米粒制剂的报道。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种血管内皮生长因子单克隆抗体Avastin壳聚糖纳米粒制剂，可用于玻璃体注射或进一步制成滴眼液，治疗AMD、PDR等眼部新生血管性病变。
由于壳聚糖可打开上皮细胞的紧密连接，以该材料制备成纳米粒，除有靶向性和缓释作用外，亦具有良好的穿透性，可穿越黏膜和上皮细胞等形态学屏障，将包载的单克隆抗体Avastin运送至眼内，因此可抑制眼内新生血管形成。
本发明采用离子胶联法制备Avastin壳聚糖纳米粒制剂。步骤如下：
1)制备壳聚糖溶液：将一定量的壳聚糖溶解于稀醋酸，壳聚糖溶液的浓度为0.1％～10％(w/v)；
2)制备胶联剂溶液：以蒸馏水为溶剂，将胶联剂溶解于蒸馏水，所用胶联剂为多聚磷酸钠，胶联剂溶液的浓度为0.1％～5％(w/v)；
3)制备Avastin溶液：将适量Avastin原液分散于上述2)制备的胶联剂溶液中或1)制备的壳聚糖溶液中，Avastin溶液的浓度为：1μg/ml～1g/ml；
4)制备Avastin壳聚糖纳米粒：将上述2)制备的胶联剂溶液缓慢滴加于3)制备的Avastin壳聚糖溶液，或将上述1)制备的壳聚糖溶液缓慢滴加于3)制备的Avastin胶联剂溶液，在滴加过程中持续搅拌，反应8～15分钟，即得Avastin的壳聚糖纳米粒溶液；
5)Avastin壳聚糖纳米粒的匀化：将4)中所得的Avastin壳聚糖纳米粒溶液放入高压乳匀机，在100～1000Bar压力下进行匀化，经检测，本发明制备的Avastin壳聚糖纳米粒外观形态较为圆整，粒径在100nm以下，平均粒径为80～90nm。
本发明制备的Avastin纳米粒制剂可制成注射剂通过玻璃体腔注射，由于纳米粒制剂具有缓释作用，可减少给药次数，从而降低治疗风险、减轻患者痛苦。也可进一步制成滴眼剂，使用更为方便、安全，患者无痛苦，费用低，便于推广应用。
本发明制备方法快速简便、成本低廉、可重复性好，还可用于其他蛋白类药物的壳聚糖纳米粒的制备。
【附图说明】
图1为本发明Avastin壳聚糖纳米粒的透射电镜图(X 20,000)。
图2为本发明Avastin壳聚糖纳米粒的粒径分布曲线图。
【具体实施方式】
实施例1.制备Avastin壳聚糖纳米粒
取壳聚糖200mg，溶于100mL 0.5％的稀醋酸中，得0.2％的壳聚糖溶液；以蒸馏水配制0.2％的多聚磷酸钠溶液，并向其中加入Avastin原液，Avastin的浓度为25mg/ml。在以600转/分钟速度持续搅拌下，将含Avastin的多聚磷酸钠溶液缓慢滴加于壳聚糖溶液中，滴毕，持续搅拌下反应10分钟，即得Avastin的壳聚糖纳米粒。将上述纳米粒混悬液经高压乳匀机，在660Bar压力下进行1个循环的匀化，得Avastin壳聚糖纳米粒。在透射电镜下观察，纳米粒外观形态较为圆整，分散度较好(图1)，用BECKMANCOULTERN4PLUS激光粒度仪检测粒径，粒径分布范围在80-90nm(图2)，平均粒径为88.9nm。
实施例2.制备Avastin壳聚糖纳米粒
壳聚糖用量为300mg，多聚磷酸钠溶液的浓度为0.5％，其余同实施例1。
平均粒径为156.8nm。
实施例3.制备Avastin壳聚糖纳米粒
壳聚糖用量为100mg，多聚磷酸钠溶液的浓度为0.2％，其余同实施例1。
平均粒径为127.5nm。
实施例4.制备Avastin壳聚糖纳米粒
壳聚糖用量为100mg，多聚磷酸钠溶液的浓度为0.1％，其余同实施例1。
平均粒径为167.6nm。
实施例5.制备Avastin壳聚糖纳米粒
多聚磷酸钠溶液的浓度为0.1％。Avastin原液加入壳聚糖溶液中，然后以多聚磷酸钠溶液进行胶联，其余同实施例1。平均粒径为238.9nm。
动物实验
(一)SD大鼠实验性糖尿病视网膜新生血管模型的建立
1)动物准备：选20周龄的SD大鼠35只(购于第二军医大学实验动物中心)，雌雄不限，体重150-180克。静脉注射链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)建立大鼠糖尿病视网膜新生血管模型。注射后在标准化饲养室常规饲养。
(二)Avastin纳米粒玻璃体腔内注射药效学观察
1.Avastin-CS-NPs的体内治疗：
实验分组：注射40周后SD大鼠视网膜可见增殖性改变。实验期间所有SD大鼠生长状态良好，均未经胰岛素治疗。将成模SD大鼠随机分成8组，每组5只。8组分别为：
Avastin-CS-NPs组：注射Avastin-CS-NPs水溶液(25mg/ml)；
注射Avastin-CS-NPs水溶液(10mg/ml)；
注射Avastin-CS-NPs水溶液(5mg/ml)；
单纯Avastin组：注射单纯Avastin溶液(25mg/ml)；
注射单纯Avastin溶液(10mg/ml)；
注射单纯Avastin溶液(5mg/ml)；
VEGI组：注射单纯VEGI溶液；
空白CS组：注射与上六组等量的CS溶液。
2、在玻璃体腔注射组分别将实施例1制得的Avastin-壳聚糖纳米粒制剂(25mg/ml、10mg/ml、5mg/ml)、未作纳米包裹地药物Avastin(25mg/ml、10mg/ml、5mg/ml)及空白纳米粒注射入各组SD大鼠的玻璃体内。设空白壳聚糖组为阴性对照组，VEGI组为阳性对照组。
注射方法：实验采用单盲法，即动物实验人员预先不知道每组动物的具体治疗药物，给药途径为直接玻璃体腔内注射，给药剂量均为0.1ml，1/日，隔两周注药1次，共治疗12周。PBS对照组给药时刻同其他各组，每次玻璃体腔内注射与上三组等量的PBS水溶液。测量从第一次注药起，记为0d。
3、疗效观察：每日观察SD大鼠的生活状态，各组大鼠开始治疗后分别于注药前后的不同时段(0、2w、4w、8w、12w)用眼底照相机、FFA技术动态追踪SD大鼠视网膜新生血管生成、消退的形态学改变并对病情变化做初步判断。
4、组织标本取材：在给药后不同时段取出SD大鼠的眼球和视网膜，置10％福尔马林溶液中进行形态学观察(HE染色)、免疫组化VEGF/CD34染色显示微血管密度。通过组织病理检查、电镜、免疫组化和荧光RT-PCR等方法和技术对微血管密度(MVD)、VEGF mRNA表达水平、循环血管内皮细胞(CECs)及其祖细胞(CEPs)进行检测，对视网膜新生血管进行定量、定性的观察和评价，并与对照组做疗效对比分析。
(三)Avastin眼表局部给药药效学观察
1.在眼表局部给药组，将实施例1制得的Avastin-壳聚糖纳米粒制剂制成2％的滴眼液剂型，并用玫瑰精荧光标记后滴入各组SD大鼠结膜囊内。
2.在给药前后的不同时段用眼底照相机、FFA技术动态追踪SD大鼠视网膜新生血管生成情况及病情变化。
3.在不同时段取出SD大鼠的眼球和视网膜，用组织病理检查、电镜、免疫组化和荧光RT-PCR等方法和技术对微血管密度(MVD)、VEGF mRNA表达水平、循环血管内皮细胞及(CECs)及其祖细胞(CEPs)进行检测，观察和评价视网膜新生血管量，并与对照组做疗效对比分析。
(四)数据统计处理：各组数据描述均以均数±标准差(X±s)，重复测量数据应用SPSS13.0统计软件处理，进行多元方差分析、组间t检验，检验水准α＝0.05。
(五)结果：各组大鼠在实验期间生存状态良好；各组大鼠视网膜病理染色示网膜厚度均较治疗前明显变薄；VEGF/CD34染色、MVD计数示微血管密度较治疗前明显减少；VEGF mRNA表达水平、CECs及CEPs检测示其表达水平降低，各组间差异显著，其中纳米粒组均较未做纳米包裹的各组疗效显著，具有明显的缓释作用。
实验结果说明Avastin-壳聚糖纳米粒制剂可有效抑制眼部新生血管的形成，具有明显的缓释作用。