抗幽门螺杆菌细胞毒素鸡卵黄抗体其制备及其应用 (一)、技术领域
本发明涉及了一种具有抗体活性的卵黄抗体产品-抗幽门螺杆菌细胞毒素鸡卵黄抗体，并涉及其准备工艺及在药学上的应用。(二)、技术背景
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)是近二十年来发现的与慢性胃炎、消化性溃疡和非溃疡性消化不良的发生密切相关的致病菌。WHO将其列为I类致癌因子，HP可产生多种具有细胞毒活性的蛋白分子，它在胃黏膜粘附定植后，释放出VacA(空泡毒素)、CagA(细胞毒素样蛋白)等毒素使胃黏膜上皮坏死和引起炎症反应。故细胞毒素分子在HP致病过程中起着重要的作用。目前，因HP感染的相关疾病，例如：慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等。
HP的治疗措施一直是人们关注的领域，目前，临床上预防和治疗幽门螺杆菌感染的方法，一般多采用联合药物方案，常用的如：铋剂+硝基咪唑类抗生素+四环素，质子泵阻滞剂+新大环内脂类抗生素，长期使用会产生抗生素耐药菌株及变异株给进一步治疗造成困难并且抗生素的长期使用会给予病人带来其它的副作用。而且，在我国因动物模型的限制，HP菌苗研究进展缓慢。因此采用被动免疫保护是防治HP感染的一条新途径。
现有技术中未见有通过采用幽门螺杆菌细胞毒素抗原，免疫健康母鸡，收集其所产的卵，再从卵中提取抗—HPTxIgY方法的报道。(三)、发明的内容
本发明所要解决的技术问题之一是：针对现有技术存在的上述不足，提供一种具有抗体活性的抗幽门螺杆菌细胞毒素鸡卵黄抗体(抗—HPTxIgY)。
本发明所要解决的技术问题之二是：提供上述抗幽门螺杆菌鸡卵黄抗体的制备方法。
本发明所要解决地技术问题之三是：提供上述抗幽门螺杆菌细胞毒素卵黄抗体在制备用于因感染幽门螺杆菌引起的相关疾病，如慢性胃炎、消化性溃疡和非溃疡性消化不良及胃癌等疾病的预防或治疗的药物制剂或保健品应用，以及在制备用于幽门螺杆菌的临床诊断或检测的检测试剂的应用。
本发明解决上述技术问题之一所提供的抗幽门螺杆菌细胞毒素卵黄抗体即抗—HPTxIgY，其特征在于：所述抗—HPTxIg按YSDS-PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western-blotting检测中高分子量带处出现清晰单一的特异性酶染条带；用紫外分光光度计进行双波长测定以计算出蛋白浓度(mg/ml)为：(1.45×OD80nm-0.74×OD60nm)×稀释倍数。
本发明解决上述技术问题之二是通过采用这样的技术方案实现的，即一种制备抗幽门螺杆菌毒素卵黄抗体的方法，其特征在于采用如下的步骤完成：
1、制备HP细胞毒素抗原
(1)提取法：分离得到产毒素的HP菌株，涂布于布氏琼脂上，37℃微需氧培养72h，得纯菌种后，在布氏肉汤培养基中扩大培养T2h。收集培养上清，通过超滤和层析分离得到毒素，按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得HP毒素抗原。
或(2)合成法：构建含有HP细胞毒素结构基因VacA或CagA的表达质粒，在大肠杆菌系统中进行表达，表达产物经分离纯化，制备HP空泡毒素(VacA)和细胞毒毒素(CagA)，按重量比1∶1混合作为免疫抗原，加入等体积的福氏佐剂，乳化混匀得HP毒素抗原。
2、将HP毒素抗原按以下的步骤制备抗体：
(1).对产卵母鸡的免疫：
选用产卵母鸡(健康)隔离饲养。进行鸡皮下多点注射，如五点，毒素蛋白量相当于1010CFU/ml细菌所产生。以后每两周加强免疫一次，共计免疫8次；于7天后开始收集鸡蛋，4℃储存备用。
(2).卵黄抗体的提取
①.采用水溶法提取卵黄抗体。从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗—HPTxIgY。
或②采用膜过滤法提取卵黄抗体。分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD—200KD的蛋白物质，冷冻干燥得到抗—HPTxIgY。
本发明所提供的上述抗—HPTxIgY产品由幽门螺杆菌细胞毒素免疫产卵母鸡而得，具有特异性，对防治幽门螺杆菌感染引起的相关疾病具有良好的效果。本发明采用母鸡所产鸡卵为载体，安全无毒，易于产业化。
(四)、附图的说明
附图给出了本发明制备方法的工艺流程图。
(五)、具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作进一步的说明本：
实施例1：具有抗体活性的幽门螺杆菌细胞毒素卵黄抗体的产品，可以通过以下步骤获得：制备幽门螺杆菌(HP)细胞毒素抗原，将HP毒素抗菌素抗原免疫健康母鸡，然后收集其所产卵，再从其所产卵中提取抗—HPTxIgY。
实施例2：HP细胞毒素抗原的制备，分离得到产毒素的HP菌株，涂布于布氏琼脂上，37℃微需氧培养72h，得纯菌种后，在布氏肉汤培养基中扩大培养T2h。收集培养上清，通过超滤和层析分离得到毒素，按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得HP毒素抗原。
实施例3：构建含有HP细胞毒素结构基因VacA或CagA的表达质粒，在大肠杆菌系统中进行表达，表达产物经分离纯化，制备HP空泡毒素(VacA)和细胞毒毒素(CagA)，按重量比1∶1混合作为免疫抗原，加入等体积的福氏佐剂，乳化混匀得HP毒素抗原。
实施例4：采用如下方式分离提取抗—HPTxIgY：从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗—HPTxIgY。
实施例5：分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD—200KD的蛋白物质，冷冻干燥得到抗—HPTxIgY。
实施例6：取实施例1、4、5中的产品进行IgY纯度检查：用PAGE电泳检测纯化的卵黄抗体的纯度，电泳中只出现一条电泳带，即为提纯的卵黄抗体。
实施例7：取实施例1、4、5中的产品进行IgY浓度检查：将提取的用PBS作5-10倍的稀释，然后用紫外分光光度计进行测定以计算出蛋白浓度。
蛋白浓度(mg/ml)＝(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×稀释倍数
实施例8：取实施例1、4、5中任何一种产品进行IgY效价测定：采用奥氏双扩散方法进行IgY效价测定，IgY效价为1∶640-1∶25600。
实施例9：采集抗—HPTxIgY免疫蛋50个，分离得到800ml蛋黄，加水稀释至5000ml，离心得到清液4000ml，采用中空纤维超滤提取，最后浓缩至400ml待用，其中含有精提，(即指纯度在99.5％以上的IgY抗—HPTxIgY)8克。将异麦芽糖10克加入5ml水溶解，100℃灭菌30分钟，将处理过的辅料与50ml超滤液混合均匀，冷冻干燥，无菌粉碎包装成袋，每小袋内含0.5克，用于治疗因HP感染引起的慢性胃炎以及消化性溃疡。
实施例10：采集抗—HPTxIgY免疫蛋100个，得到1600ml蛋黄，加2倍PBS稀释液，并加入3.5％PEG6000搅拌静置2小时，离心得到清液3500ml，再加PEG6000至终浓度为12％，静置2小时，离心收集沉淀。以100ml蒸馏水溶解IgY沉淀，通过细菌过滤器除菌，冷冻干燥，以每个普通胶囊装200mg粗提抗—HPTxIgY进行灌装，所得产品用于预防HP感染，人体服用方法每天2-3次，每次3粒胶囊。
实施例11：抗—HPTxIgY体外拮抗毒素生物活性实验：抗—HPTxIgY(10ug～200ug/ml)与HP毒素(30～90ug/ml)在无菌条件下1∶1混合。37℃2h后，取0.1ml上清加入Hela细胞培养中，发现IgY浓度在100～200ug/ml可完全阻断HP毒素对Hela细胞的毒性作用，细胞LDH(乳酸脱氢酶)的活性不增加；其后的系列稀释，其保护活性亦随之减低，显微镜形态学观察亦获得相同结果：正常Hela细胞呈贴壁的多形性生长，细胞内无颗粒，且折光良好。HP毒素作用后，细胞球形变，胞浆内出现多颗粒，当浓度＞50ug/ml时，Hela细胞多以裂解，残余细胞体积明显皱缩。拮抗毒素后，细胞的形态改变减轻。
实施例12：抗—HPTxIgY在体生物学活性观察：参照相关文献建立啮齿类动物HP感染的模型，试验分为治疗组(低剂量(10mg/Kg)、中剂量(25mg/Kg)、高剂量(50mg/Kg)抗—HPTxIgY)，对照组；治疗10、20、30天后，观察动物的大体情况，胃粘膜病理学检查，快速尿素酶试验和毒素含量等指标。结果发现：中、高剂量组在治疗10天后，胃粘膜毒素含量明显下降，20天后动物的胃粘膜病理学检查指标有明显改善，毒素含量为阴性。
实施例13：抗—HPTxIgY与抗生素联合应用生物学活性观察：参照相关文献建立啮齿类动物HP感染的模型，试验分为单纯抗—HPTxIgY治疗组、单纯抗生素(枸橼酸铋钾、克拉霉素、替硝唑)治疗组、联合组。治疗5、10、15天后，观察动物胃粘膜病理学检查，快速尿素酶试验和毒素含量等指标。结果发现：联合组较两单纯组在治疗5天后，动物的胃粘膜病理学改善、胃粘膜毒素含量和HP数量均有明显下降；单纯抗—HPTxIgY治疗组的胃粘膜毒素含量小于单纯抗生素治疗组。