抗岩藻多糖抗体 【技术领域】
本发明涉及一种抗体，所述抗体可以识别具有生理活性的多糖，岩藻多糖，对于岩藻多糖的功能研究和结构分析非常有用。技术背景
岩藻多糖是一种多糖，在其分子中含有硫酸岩藻糖。众所周知，一种岩藻多糖基本不含糖醛酸，并且含有的岩藻糖是其组成糖类的主要成分；一种岩藻多糖含有糖醛酸，并且含有的岩藻糖和甘露糖是其组成糖类的主要成分。
本发明的发明者从Kjellmaniella crassifolia中制备了基本不含糖醛酸，并且含有的岩藻糖是其组成糖类的主要成分的岩藻多糖，即含硫酸岩藻糖多糖-F(以下称为F-岩藻多糖)，以及含有糖醛酸的岩藻多糖，即含硫酸岩藻糖多糖-U(以下称为U-岩藻多糖)(见WO 97/26896)。
岩藻多糖的已知生理活性包括凋亡诱导活性，针对肿瘤的抗增殖活性，抑制肿瘤转移的活性，抗凝血剂活性以及抗病毒活性。因此，将岩藻多糖开发为具有医用价值的产品备受期待。此外，岩藻多糖作为化妆品中的一种物质，也具有卓越的功能。
因此，希望进一步分析岩藻多糖的结构和生理功能。发明目的
本发明的主要目的是提供一种可以特异识别岩藻多糖结构的抗体，所述抗体对于岩藻多糖的结构分析和结构与生理功能之间关系的研究非常有用。发明概述
本发明的发明者通过应用从Kjellmaniella crassifolia获得的岩藻多糖作为抗原免疫宿主，成功创建了一种可以产生识别岩藻多糖结构地抗体的细胞。这样，本发明就全部完成了。
因此，本发明提供了能够识别式(I)或(II)代表的化合物的抗岩藻多糖抗体：
而且，本发明还提供了一种载体，所述抗岩藻多糖抗体在该载体上固定。附图简述
图1：附图显示了从Kjellmaniella crassifolia中获得的岩藻多糖通过DEAE-Cellulofine A-800柱洗脱的图形。发明详述
从Kjellmaniella crassifolia中获得的岩藻多糖可以按照WO97/26896描述的方法制备，所述岩藻多糖将用作制备本发明抗体的抗原。特别地，还可按照参考实施例1-(1)所述方法制备。而且，U-岩藻多糖和F-岩藻多糖还可按照本发明所述方法制备。特别地，还可按照参考实施例1-(2)所述方法制备。
式(I)的化合物可按照WO 99/41288所述方法制备。特别地，还可按照参考实施例2所述方法制备。
式(II)的化合物可按照WO 96/34004所述方法制备。特别地，还可按照参考实施例3所述方法制备。
式(I)的化合物是通过交替单胞菌属sp.SN-1009(FERMBP-5747)产生的F-岩藻多糖降解酶的作用，从F-岩藻多糖产生的较小分子。F-岩藻多糖具有式(I)的化合物作为组成单位重复出现的结构。
式(II)的化合物是通过黄杆菌属sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的岩藻多糖降解酶的作用，从岩藻多糖产生的较小分子。
本发明的抗岩藻多糖抗体可能是一种多克隆抗体，也可以制备成一种单克隆抗体，只要它能识别式(I)或(II)的化合物。这种单克隆抗体可按照所谓的细胞融合法制备。特别地，单克隆抗体可按照下述方法制备。通过将产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合生成杂交瘤。然后克隆杂交瘤。然后筛选可以产生针对式(I)或(II)化合物的特异性抗体克隆。
例如，来自从Kjellmaniella crassifolia获得的岩藻多糖免疫动物的脾或淋巴结的B淋巴细胞就可作为抗体产生细胞。可用于免疫的动物如小鼠，大鼠，马，山羊和兔。
从Kjellmaniella crassifolia获得的岩藻多糖，U-岩藻多糖，F-岩藻多糖等可以作为抗原应用。所述抗原可与弗氏佐剂混和，然后用于免疫动物。
免疫可以通过给动物皮下、肌内或腹腔内注射每剂20-200ug抗原实现，2-3周1次，共3-7周。末次免疫后3-5天收集免疫动物的抗体产生细胞。
应用来自小鼠、大鼠、人类或其他动物的骨髓瘤细胞。细胞融合可以按照，如Nature，256：495(1975)所述方法或其改良法进行。在所述方法中，细胞融合通过应用分子量为1000-4000的30-50％的聚乙烯二醇在温度30-40℃反应1-3分钟实现。
通过细胞融合法获得的杂交瘤应用酶免疫试验或其他方法进行筛选。由此获得的抗体产生杂交瘤进行克隆。特别地，通过克隆杂交瘤，如通过有限稀释法，获得很多克隆。这些克隆再通过酶免疫试验或其他方法筛选能够产生令人感兴趣的单克隆抗体的克隆。例如，将备选克隆植入BALB/c鼠的腹腔内，所述鼠业已接受朴日斯烷(2，6，10，14-四甲基十五烷)处理。植入10-14天后，收集含有高浓度单克隆抗体的腹水。通过应用众所周知的纯化抗体的方法，如硫酸铵分级法，聚乙烯二醇分级法，离子交换层析及凝胶色谱法，可以从腹水中再次提取单克隆抗体。
本发明的抗体并不限制到具体的一种，只要它能应用上述方法制备。抗体通过下述两种抗体示例，即通过杂交瘤GFD G-28(FERMBP-7173)产生的抗岩藻多糖抗体，所述抗体能够识别式(I)的化合物，而不能识别式(II)的化合物(该抗体以下称为GFDG-28)，或者通过杂交瘤GFD 2-9C(FERM BP-7174)产生的抗岩藻多糖抗体，所述抗体不能识别式(I)的化合物，而能识别式(II)的化合物(该抗体以下称为GFD2-9C)。
而且，通过将本发明抗体固定到载体上，并应用它作为吸附载体，可以分辩下述物质：式(I)或(II)的化合物，含有式(I)或(II)化合物的多糖，或以式(I)或(II)化合物作为构成单位的多糖。可以应用已知的方法将本发明抗体固定到载体上。用于固定的载体物质可以根据目的或方法适当选择，例如，含有多糖如琼脂糖、纤维素和葡聚糖的物质，合成聚合物如聚丙烯酰胺、丙烯酸聚合物、stylene二乙烯苯聚合物和聚丙烯酸甲酯，以及无机聚合物如硅胶和玻璃。
GFDG-28识别F-岩藻多糖。因此，它可用来检测F-岩藻多糖。因此，在夹心方法中，它可被用来检测式(I)化合物。认为识别部位是岩藻糖-2-硫酸位点。
这一抗体在检测岩藻多糖并分辨其类型时非常有用。例如，它可被用来检测从Kjellmaniella crassifolia中获得的岩藻多糖。
按照上述方法获得的抗体在研究岩藻多糖结构与生理活性之间关系的研究中非常有用。而且，所述抗体在活体获得性岩藻多糖物质浓度的特异和准确测定中非常有用，如测定血清、血浆或尿液。
为了这些目的，可以应用单克隆抗体本身，或其片段，所述片段具有相应免疫特性，如Fab片段。本发明抗体包括通过基因工程生产的抗体或其片段。
实施例
下面的实施例旨在更详尽的阐释本发明，并不是为了限制本发明的范围。
参考实施例1
(1)将Kjellmaniella crassifolia彻底干燥。应用Jiyu Mill(Nara Machinery)粉碎机将20kg干燥的产品碾碎。
将7.3kg二水合氯化钙(Nippon Soda)溶于900升自来水中。然后将碾碎的20kg Kjellmaniella crassifolia与该溶液混和。通过将水蒸气吹入混合物，使混合物的温度40分钟内从12℃提高到90℃。搅拌混合物，在90-95℃孵育1小时，然后冷却，获得1100升冷却的产品。
冷却后的产品应用固体-液体分离器(CAN型，WestfalierSeparator)进行固体-液体分离，以制备大约900升的上清。
应用FE10-FC-FUS0382(分馏分子量30,000，Daicel)将360升的上清浓缩到体积为20升。然后，将20升自来水加入浓缩液中。得到的混合物再用FE10-FC-FUS0382浓缩到体积为20升。这一过程重复5次，以去除混合物中的盐分。这样，从Kjellmaniellacrassifolia中制备得到了25升提取物。
将1升提取物冻干获得13g来自Kjellmaniella crassifolia的干燥岩藻多糖。
(2)将如参考实施例1-(1)所述获得的7g干燥岩藻多糖溶解于700ml 20mM咪唑缓冲液(pH8.0)中，所述咪唑缓冲液含有50mM氯化钠和10％乙醇。不能溶解的物质通过离心去除。应用相同的缓冲液平衡DEAE-Cellulofine A-800柱(11.4cm×48cm)(SeikagakuCorporation)。将离心后获得的上清液上柱。应用相同的缓冲液洗柱。应用氯化钠浓度梯度为50mM-1.95M进行洗脱。洗脱液以每一级分250ml的速率收集。糖和糖醛酸的总含量根据苯酚硫酸法和咔唑硫酸法测定。收集级分编号为43-55和56-67的洗脱液。这些级分通过电透析去脱盐分，然后冻干。这样，就从级分编号为43-55和级分编号为56-67的洗脱液中分别制备了含有1.21g U-岩藻多糖和2.64g F-岩藻多糖的级分。
图1显示了从Kjellmaniella crassifolia获得的岩藻多糖通过DEAE-Cellulofine A-800柱洗脱的图形。图1中，纵轴代表根据咔唑硫酸法测定的530nm处的吸收值(闭合圆圈)，根据苯酚硫酸法测定的480nm处的吸收值(开放圆圈)，以及传导率(mS/cm，开放方块)。横轴代表级分编号。
参考实施例2
(1)将交替单胞菌属sp.SN-1009(FERM BP-5747)接种到600ml培养基中，所述培养基包括含有0.25％葡萄糖、1.0％蛋白胨和0.05％酵母提取物(pH8.2)的人工海水(Jamarin Laboratory)，所述培养基在2升的烧瓶中120℃灭菌20分钟，并在25℃孵育26小时，制备种子培养物。将20升培养基置于30升广口发酵桶中，120℃灭菌20分钟，所述培养基包括含有1.0％蛋白胨、0.02％酵母提取物、0.2％如实施例2-(2)所述制备的岩藻多糖和0.01％防沫剂(KM70，Shin-Etsu Chemical)(pH8.0)的人工海水(Jamarin Laboratory)。冷却后，将600ml种子培养物接种到培养基中，并在24℃孵育24小时，通风10升/分钟，搅拌速度250rpm。孵育后，将培养物离心收获培养上清。培养上清应用超滤装置浓缩，所述超滤装置装备了排除分子量为10,000的中空纤维，并用85％的饱和硫酸铵去脱盐分。离心收集得到的沉淀物，并应用含有浓度为1/10人工海水的20mMTris-盐酸缓冲液(pH8.2)彻底透析，以制备600ml F-岩藻多糖降解酶溶液，所述酶可以选择性作用于岩藻多糖。
(2)将2kg干燥的Kjellmaniella crassifolia应用装备有筛眼直径为1mm的切割机(Masuko Sangyo)切碎。将获得的Kjellmaniella crassifolia碎片悬浮于20升80％乙醇中。悬浮液在25℃搅拌3小时，并通过滤纸过滤。获得的残留物清洗后悬浮于40升20mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，所述缓冲液含有50mM氯化钠，并在95℃加热。悬浮液在95℃处理2小时，间隔搅拌以提取岩藻多糖。
过滤提取物中的悬浮物质以制备滤过液。残留物应用3.5升100mM氯化钠清洗，以获得另外的滤过液。
将滤过液合并在一起并冷却到30℃。然后加入3000U藻酸盐裂解酶(Nagase Biochemicals)。然后再加入4升乙醇。混合物在25℃搅拌24小时。应用超滤装置将离心混合物获得的上清浓缩到4升，所述超滤装置装备有排除分子量为100,000的中空纤维。应用含有10％乙醇的100mM氯化钠持续超滤，直至在滤过液中检测不到无颜色物质。
在滤过保留物中产生的沉淀物可通过离心除去。上清冷却至5℃。应用0.5N的盐酸调整pH值至2.0。含有蛋白质及其类似物的沉淀物通过离心去除。这样获得的上清立即应用1N的氢氧化钠调整pH值至8.0。
应用20mM氯化钠(pH8.0)采取超滤装置通过超滤将溶剂完全置换，所述超滤装置装备有排除分子量为100,000的中空纤维。将pH值再次调整到8.0。离心后进行冻干，可以制备大约95g岩藻多糖。
(3)将2kg干燥的Kjellmaniella crassifolia应用装备有筛眼直径为1mm的切割机切碎。将获得的Kjellmaniella crassifolia碎片悬浮于20升80％乙醇中。悬浮液在25℃搅拌3小时，并通过滤纸过滤。获得的残留物清洗后悬浮于20升20mM缓冲液(pH8.2)中，所述缓冲液含有30ml在参考实施例2-(1)中制备的F-岩藻多糖降解酶溶液、10％乙醇、100mM氯化钠、50mM氯化钙和50mM咪唑。悬浮液在25℃搅拌48小时。将悬浮液通过32um的不锈钢筛网过滤。残留物应用含有50mM氯化钙的10％乙醇清洗。将残留物悬浮于10升的含有50mM氯化钙的10％乙醇中。将悬浮液搅拌3小时，通过不锈钢筛网过滤，然后清洗。残留物以相同的方式悬浮。将悬浮液搅拌16小时，通过32um不锈钢筛网过滤，并清洗。
将上述获得的滤过液和洗涤液合并，并应用超滤装置超滤，从滤过保留物中分离滤过液，所述超滤装置装备有排除分子量为3000的中空纤维。
应用旋转脱水器将滤过液浓缩至体积大约为3升。然后离心浓缩液获得上清。应用电渗透装置使上清液去脱盐分，所述电渗透装置装备有排除分子量为300的渗透膜。往溶液中加入醋酸钙使终浓度为0.1M。离心去除沉淀物。将这样获得的上清加到应用50mM醋酸钙平衡的DEAE-Cellulofin柱(树脂体积4升)上。用50mM醋酸钙和50mM氯化钠彻底清洗，然后应用氯化钠浓度梯度为50mM-800mM进行洗脱。洗脱液以每一级分500ml的速率收集。将收集的级分应用醋酸纤维素薄膜电泳(Analytical Biochemistry，37：197-202(1970))分析时发现，应用浓度大约为0.4M氯化钠洗脱的岩藻多糖(级分编号大约为63)是同质的。
因此，将级分编号为63的溶液浓缩到体积150ml。然后加入氯化钠使终浓度为4M。将混合物加到应用4M氯化钠平衡的Phenyl-Cellulofine柱(树脂体积200ml)上。应用4M氯化钠彻底洗柱。收集含有岩藻多糖非吸附降解产物的级分，并应用电渗透装置去脱盐分并获得505ml的脱盐溶液。所述电渗透装置制备有排除分子量为300的渗透膜。
将40ml脱盐溶液加到应用0.2M氯化钠平衡并含有10％乙醇的GCL-90柱(4.1cm×87cm)(Seikagaku Corporation)上进行凝胶过滤。洗脱液以每一级分9.2ml的速率收集。
根据苯酚硫酸法(Analytical Chemistry，28：350(1956))对所有级分进行总糖量分析。
结果是，岩藻多糖降解产物形成一个单峰。收集靠近峰值的级分编号为63-70的洗脱液，并应用装备有排除分子量为300的渗透膜的电渗透装置除去盐分，并冻干获得112mg式(I)化合物的干燥产品(以下简称为7-12s)。
参考实施例3
(1)将黄杆菌属sp.SA-0082(FERM BP-5402)接种到600ml培养基中，所述培养基包括含有0.1％葡萄糖、1.0％蛋白胨和0.05％酵母提取物(pH7.5)的人工海水(Jamarin Laboratory)，所述培养基在2升的烧瓶中120℃灭菌20分钟，并在24℃孵育20小时，制备种子培养物。将20升培养基置于30升广口发酵桶中，120℃灭菌20分钟，所述培养基包括含有0.3％如实施例2-(2)所述从Kjellmaniella crassifolia中制备的岩藻多糖、0.5％蛋白胨、0.01％酵母提取物和0.01％防沫剂(KM70，Shin-Etsu Chemical)(pH7.5)的人工海水(Jamarin Laboratory)。冷却后，将600ml接种培养物接种到培养基中，并在24℃孵育20小时，通风10升/分钟，搅拌速度250rpm。孵育后，将培养物离心收获培养上清。培养上清应用超滤装置浓缩至体积400ml，以获得岩藻多糖降解酶溶液。所述超滤装置装备了排除分子量为10,000的中空纤维。
(2)将含有从Kjellmaniella crassifolia中获得的岩藻多糖浓度为5％的溶液600ml，100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)750ml，4M氯化钠溶液150ml和参考实施例3-(1)制备的岩藻多糖降解酶溶液120ml混和，在25℃反应144小时。
应用透析孔大小为3500的透析膜透析反应混合物，收集含有分子量小于或等于3500物质的级分。该级分应用微量分析器G3(AsahiKasei)去脱盐分，获得500ml脱盐溶液。将脱盐溶液加到应用10mM醋酸铵平衡的DEAE-Sepharose FF柱(5cm×26cm)上。应用10mM醋酸铵溶液1升，浓度梯度为10mM-1M的醋酸铵溶液1升，1M醋酸铵溶液1升，浓度梯度为1M-5M的醋酸铵溶液1升，以所述顺序进行洗脱。洗脱液以每一级分50ml的速率收集。收集级分编号为64-78的洗脱液，浓缩至体积200ml，脱盐后加到应用500mM醋酸铵平衡的DEAE-Sepharose FF柱(2.4cm×22cm)上。应用500mM醋酸铵溶液100ml，浓度梯度为500mM-2M的醋酸铵溶液900ml，以所述顺序进行洗脱。洗脱液以每一级分9.7ml的速率收集。收集级分编号为92-96的洗脱液，浓缩脱盐后获得式(II)化合物(以下简称为6-5s)。
实施例1
制备并克隆产抗岩藻多糖单克隆抗体的杂交瘤
(1)将100ug如参考实施例1-(1)所述从Kjellmaniellacrassifolia中制备的岩藻多糖作为抗原与弗氏完全佐剂混和并乳化至体积100ul，然后将其注入4只6周龄Balb/c雌性小鼠(CleaJapan)的腹腔内。
首次注射21天后，将与首次注射相同的100ug岩藻多糖与弗氏不完全佐剂混和并乳化至体积100ul，然后将其注射到每只小鼠的腹腔内，加强免疫。
加强免疫后14天，将与首次注射相同的100ug岩藻多糖100ul注射到每只小鼠腹腔内，辅助免疫。
辅助免疫后3天，取出每只小鼠的脾脏，应用不锈钢筛网将脾脏缓慢均匀地分散于10ml RPMI 1640培养基(Bio Whittaker)中。通过以1500rpm反复离心、清洗3次，分离脾脏细胞。
这样获得的脾脏细胞离心后与已经洗涤的鼠骨髓瘤细胞P3U1(P3X63AgU.1)混和。将1ml PEG 1500溶液(含有聚乙烯二醇(PEG)的RPMI 1640培养基，浓度为50％(v/v))在1分钟内逐滴加入混和细胞中。进一步混和1分钟后，应用RPMI 1640培养基缓慢稀释混合物，使PEG浓度变为5％(v/v)。
离心分离细胞，并将其缓慢加入增殖培养基(含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基)，分散均匀。将0.1ml 106细胞接种到96孔培养板(Falcon)的每孔中。将培养板在5％ CO2培养箱中37℃孵育过夜。
第二天，每孔加入100ul选择性培养基，所述选择性培养基(以下称为HAT培养基)是在增殖培养基中加入0.1mM次黄嘌呤，0.4um氨基喋呤和16um胸腺嘧啶脱氧核苷制备的。继续孵育，并以1或2天的间隔应用100ul新鲜HAT培养基置换培养液，即在选择性条件下，未融合的细胞被杀死，而只有融合细胞可以存活。
另外，为了在存活的融合细胞中选择抗体产生阳性细胞系，在细胞集落变大时，应用酶免疫试验检测培养上清中含有的抗岩藻多糖单克隆抗体。
用于免疫抗原的岩藻多糖浓度应用磷酸盐缓冲液(PBS)调整到10ug/ml。在96孔微量滴定板(Nunc)的每孔中加入50ul稀释液。滴定板4℃过夜固定。
固定后，弃置固定液，每孔加入200ul可以通过商业渠道购买的封闭液(Block Ace，Dainippon Pharmaceutical)。封闭平板37℃孵育2小时，就制备了抗原已经固定的平板。
将50ul不同融合细胞的培养上清加入平板。平板37℃孵育1小时，使抗原抗体充分反应。
应用PBS洗板。然后每孔加入50ul应用封闭液稀释1000倍的马过氧化物辣根酶(HRP)标记的抗鼠IgG抗体(Zymed)。平板37℃孵育1小时。
应用PBS洗板。每孔加入50ul ABTS/0.02％过氧化氢溶液(含有浓度为0.55mg/ml的2，2’-连氮基-二(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS，Nacalai Tesque)和0.02％过氧化氢的0.1M氢氧化柠檬酸钠缓冲液(pH4.0))。平板室温孵育15分钟，等待产生颜色。
产生绿色的孔判断为阳性。将阳性细胞系集落在HT培养基中(不含氨基喋呤的HAT培养基)从96孔板转移到24孔板，然后再转移到6孔板扩增。如下述进行有限稀释克隆。待扩增的细胞应用可以通过商业渠道购买的克隆培养基(S-Clone，Sanko Junyaku)稀释，使96孔培养板中每孔含有一个细胞。然后将稀释液接种到96孔板中，孵育细胞。
为了检测阳性细胞系，应用酶免疫试验检测单集落生长的培养上清，所述酶免疫试验应用岩藻多糖作为抗原，并固定在平板上。
结果获得了两个单克隆抗体产生细胞克隆，GFD 2-9C和GFD G-28。这些细胞在1996年10月29日(首次保藏日期)保藏日本1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken通产省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM BP-7174(GFD 2-9C)和FERM BP-7173(GFD G-28)。
(2)在增殖培养基(含10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基)中生长每种克隆的单克隆抗体生产细胞，然后将106-107细胞腹腔植入Balb/c小鼠，所述小鼠在3周前接受0.5ml免疫抑制剂，朴日斯烷(2，6，10，14-四甲基十五烷，Wako Pure ChemicalIndustries)。2周后从收集的累积腹水中纯化单克隆抗体。
(3)从每只小鼠腹腔收集的腹水以3000rpm离心10分钟以去除沉淀物。上清液应用PBS稀释两次并通过棉花过滤。这样获得的滤过液应用50％硫酸铵盐析以沉淀抗体，然后离心。
将获得的沉淀物溶解于PBS中。溶液用PBS透析以去除硫酸铵，然后按照传统方法应用蛋白A柱(Pharmacia)亲和处理该溶液。
所述层析柱应用蛋白A吸附缓冲液(3M NaCl，1.5M氨基乙酸，pH8.9)平衡。应用蛋白A柱处理通过溶解沉淀物制备的含有抗体的透析溶液。吸附的级分应用蛋白A吸附缓冲液清洗，然后用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)洗脱。
洗脱的级分应用PBS透析。将这样获得的透析液应用十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝胶电泳(以下称为SDS-PAGE)，确认产生一条单独的带。这样，就获得了纯化抗体。
通过杂交瘤GFD 2-9C和GFD G-28产生的抗岩藻多糖抗体分别被命名为GFD 2-9C和GFD G-28。
(4)应用可以通过商业渠道购买的兔抗鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgGM多克隆抗体(Zymed)，采用酶免疫试验来测定抗岩藻多糖抗体的亚型。
用作免疫抗原的纯化岩藻多糖浓度应用PBS调整到10ug/ml。将50ul稀释液加到96孔微量滴定板(Nunc)的每个孔中。平板在4℃吸附过夜。
将平板中的液体弃置，然后应用PBS洗板，再在每孔中加入200ul可以通过商业渠道购买的封闭试剂(Block Ace，DainipponPharmaceutical)以制备抗原平板。
每种纯化的抗岩藻多糖抗体GFD 2-9C和GFD G-28应用可以通过商业渠道购买的封闭试剂(Block Ace，Dainippon Pharmaceutical)将浓度调整到10ug/ml。将每种稀释液50ul加入平板。平板在37℃孵育反应1小时。
应用PBS洗板。应用可以通过商业渠道购买的封闭试剂(BlockAce，Dainippon Pharmaceutical)1000倍稀释可以通过商业渠道购买的兔抗鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgGM多克隆抗体(Zymed)，然后将50ul每种稀释液加入每孔。平板在37℃孵育反应1小时。
应用PBS洗板。然后每孔加入50ul ABTS/0.02％过氧化氢溶液。平板在室温孵育15分钟等待颜色产生。
结果显示，两种抗体都是IgG1亚型。
(5)应用岩藻多糖衍生化合物7-12s和6-5s与从Kjellmaniella crassifolia中获得的岩藻多糖进行竞争性试验。
应用PBS将从Kjellmaniella crassifolia中获得的纯化岩藻多糖浓度调整到10ug/ml。将50ul溶液加到96孔微量滴定板(Nunc)的每个孔中。平板在4℃过夜固定。然后应用200ul可以通过商业渠道购买的封闭试剂(Block Ace，Dainippon Pharmaceutical)进行封闭以制备抗原平板。
应用蒸馏水将酶解糖片段溶液的浓度调整到1mg/ml。将上述每种溶液应用可以通过商业渠道购买的封闭试剂(Block Ace，Dainippon Pharmaceutical)制备3种3倍比稀释液(3倍，9倍和27倍)。将竞争溶液分装到1.5ml Eppendorf管(Eppendorf)中，所述竞争溶液包括这些稀释液以及只含有封闭试剂而不含7-12s或6-5s的溶液。
应用可以通过商业渠道购买的封闭试剂(Block Ace，DainipponPharmaceutical)将抗岩藻多糖抗体GFD 2-9C和GFD G-28的浓度调整到10ug/ml以制备抗体溶液。
将含有浓度为10ug/ml GFD 2-9C或GFD G-28一种抗体的溶液50ul加入一种50ul竞争溶液(含有定义浓度的7-12s或6-5s，或仅有封闭试剂)中。混合物在37℃孵育30分钟，以制备首次反应混合物。
在首次反应中，如果抗体GFD 2-9C或GFD G-28的结合位点在与竞争溶液中的7-12s或6-5s发生结合反应时被占据(即，如果抗体的结合位点是7-12s或6-5s)，那么在第二次反应中，抗体与平板固定抗原结合能力与7-12s或6-5s的浓度成正比丧失。
在第二次反应中，将每种第一次反应混合物50ul分别加入已将从Kjellmaniella crassifolia中获得的岩藻多糖作为抗原固定的平板中。平板在37℃孵育1小时。
应用PBS洗板三次后，将50ul应用可以通过商业渠道购买的封闭试剂(Block Ace，Dainippon Pharmaceutical)稀释500倍的HRP标记的抗鼠第二抗体加入每孔。平板在37℃孵育1小时。
应用PBS洗板四次后，每孔加入50ul ABTS/0.02％过氧化氢溶液。平板孵育15分钟等待颜色产生。
每孔加入50ul 150mM草酸终止反应，应用平板阅读器测定405nm处的吸收值。
也就是说，如果颜色产生与竞争溶液中的7-12s或6-5s浓度成正比降低，就认为抗体的结合位点是7-12s或6-5s。
结果显示，抗岩藻多糖抗体GFD 2-9C与6-5s结合，与7-12s不结合，而GFD G-28与7-12s结合，与6-5s不结合，如下表1所示。
表1
竞争化合物浓度(ug/ml)抗体克隆 化合物 333 111 36.7 0
405nm处测定的吸收值GFD 2-9C 6-5s 0.160 0.235 0.277 0.293
7-12s 0.294 0.281 0.318 0.305GFD G-28 6-5s 0.364 0.385 0.405 0.400
7-12s 0.194 0.345 0.376 0.418
(6)按照P.K.Nakan，“临床实验室免疫试验”pp.81，AlanR.Liss Inc.(1979)所述方法制备HRP标记的抗体。
将10mg HRP(Boehringer-Mannheim)溶解于1ml蒸馏水中。然后加入0.2ml 0.1M的高碘酸钠。混合物在室温反应20分钟，然后用1mM醋酸钠缓冲液(pH4.0)透析过夜。
通过加入0.02ml 2M碳酸钠缓冲液(pH9.5)将所得溶液pH值调整到9-9.5。将GFD 2-9C和GFD G-28单克隆抗体的一种加到透析液上，使终浓度达到10mg/ml。所述单克隆抗体应用0.01M碳酸钠缓冲液(pH9.5)透析。混合物在室温反应2小时。然后在每种混合物中加入0.1ml氢化硼钠(4mg/ml)，得到的混合物在4℃反应2小时。
反应混合物应用PBS 4℃透析过夜。这样就获得了HRP标记的GFD2-9C和HRP标记的GFD G-28。
应用PBS将抗体GFD 2-9C或GFD G-28的浓度调整到10ug/ml。将50ul一种溶液加入96孔微量滴定板(Nunc)的每个孔中。平板4℃过夜，固定抗体。
弃置平板每孔中的液体，然后在每孔中加入可以通过商业渠道购买的封闭试剂(Block Ace，Dainippon Pharmaceutical)200ul。平板在37℃孵育1小时，封闭制备固定平板。
用于GFD 2-9C测定系统的含有浓度为40ug/ml(最高(最大)浓度)6-5s的5倍比稀释液50ul，或用于GFD G-28测定系统的含有浓度为111ug/ml(最高(最大)浓度)7-12s的3倍比稀释液50ul，作为标准加入平板中(以下称为STD)。平板在37℃孵育反应1小时。
反应后，应用PBS洗板三次。每孔中加入应用可以通过商业渠道购买的封闭试剂500倍稀释的HRP标记的GFD 2-9C或HRP标记的GFDG-28 50ul。平板在37℃孵育反应1小时。
反应后，应用PBS洗板四次。每孔加入ABTS/0.02％过氧化氢溶液50ul。平板室温孵育15分钟以产生颜色。
应用平板阅读器在405nm处测定每孔的吸收值。结果如表2所示。
根据应用6-5s(GFD 2-9C)或7-12s(GFD G-28)作为STD测定的吸收值绘制标准曲线。
结果如下表2所示，测定的吸收值与6-5s或7-12s浓度成正比增加。这些结果显示夹心酶免疫试验(夹心EIA)检测系统功能良好。
表2
固定抗体 HRP标记抗体 STD
GFD 2-9C GFD 2-9C 6-5s
405nm处测定的吸收值
从最高浓度(40ug/ml)起的5倍比稀释液 高1.687 0.870 0.264 0.111 0.062 0.073 0.058
固定抗体 HRP标记抗体 STD
GFD G-28 GFD G-28 7-12s
405nm处测定的吸收值
从最高浓度(111ug/ml)起的3倍比稀释液 高1.589 0.780 0.316 0.150 0.087 0.066 0.042
从Kjellmaniella crassifolia中获得的岩藻多糖可应用夹心EIA检测系统测定，该检测系统联合应用GFD 2-9C和HRP标记的GFDG-28。结果如下表3所示。此外，还分别检测了联合应用GFD 2-9C和HRP标记的GFD 2-9C，联合应用GFD G-28和HRP标记的GFD G-28，以及联合应用GFD G-28和HRP标记的GFD 2-9C。结果发现，从Kjellmaniella crassifolia中获得的岩藻多糖可以应用这些联合方法通过夹心EIA测定。而且，F-岩藻多糖还可通过夹心EIA检测系统联合应用GFD G-28和HRP标记的GFD G-28来测定。
表3
固定抗体 HRP标记抗体 STD
GFD G-28 GFD G-28 从Kjellmaniella
crassifolia中获得的
岩藻多糖
405nm处测定的吸收值
从最高浓度(40ug/ml)起的5倍比稀释液 高0.449 0.220 0.139 0.089 0.086 0.073 0.072
实施例2
抗岩藻多糖抗体柱的制备
应用6ml 1mM盐酸清洗HiTrap NHS激活柱(Pharmacia)。将0.9ml如实施例1-(3)纯化的GFD G-28溶液上柱。室温放置1小时后，应用3ml偶联缓冲液(0.5M氯化钠，0.2M碳酸氢钠，pH8.3)洗柱。然后，应用6ml封闭缓冲液(0.5M Tris-盐酸(8.3)，0.5M氯化钠)，6ml缓冲液B(0.1M醋酸钠(pH4.0)，0.5M氯化钠)和6ml封闭缓冲液，按上述顺序洗柱，然后室温放置30分钟。再用6ml缓冲液B，6ml封闭缓冲液和6ml缓冲液B洗柱，然后应用PBS平衡柱以制备抗岩藻多糖抗体柱。
将从Kjellmaniella crassifolia中获得的纯化岩藻多糖溶解于PBS中，将得到的溶液加到抗岩藻多糖抗体柱上。当洗脱液按参考实施例1-(2)所述进行DEAE-Cellulofine A-800柱色谱分析时发现，应用梯度氯化钠洗脱的F-岩藻多糖中，没有观察到与盐浓度级分相对应的峰。这样发现，应用GFD G-28固定柱，可以从Kjellmaniella crassifolia中得到的岩藻多糖中去除F-岩藻多糖。而且，当按照参考实施例3-(2)所述方法处理从GFD 2-9C固定柱中得到的洗脱液时发现，在DEAE-Sepharose FF柱色谱分析后，不能获得6-5s。这样发现，可以去除6-5s和含6-5s的多糖。工业应用性
本发明提供了一种抗岩藻多糖抗体，所述抗体可以与岩藻多糖结构特异性结合，对于岩藻多糖的结构分析和定量非常有用。
应用抗体可以揭示岩藻多糖结构与生理功能之间的关系。因此，这样一种抗体在生物化学领域非常有用。而且，具有生理功能结构的岩藻多糖可以从多种来源物质中筛选出来。此外，所述抗体还可用于纯化感兴趣的岩藻多糖。