一种江蓠属养殖龙须菜的深加工方法 【技术领域】
本发明涉及海洋生物的深加工，具体地说是一种养殖龙须菜的深加工工艺，可同时得到琼脂、试剂纯藻红蛋白、卤素过氧化物酶及微量元素饲料添加剂和微量元素肥料。
背景技术
龙须菜，作为江蓠属的一个特有品种，因其适应性快、生长率高等优点，已成为中国产量第三的养殖大型海藻。养殖龙须菜能够大量吸收海水中的氮、磷和二氧化碳，改善近海海洋的生态环境，促进鱼贝类繁衍生长，使养殖生态环境达到良性循环。最重要的是，龙须菜具有很重要的经济价值：为琼脂的重要原料之一，琼脂含量占其干重的20％～30％，龙须菜的琼胶质量好而且含量高，还有抗肿瘤效果。藻体中含有丰富的藻红蛋白及功能性酶组分，如卤素过氧化物酶。藻红蛋白广泛用于食品和化妆品工业，在荧光免疫学、诊断用荧光标记和生物医学等方面有很大的应用前景，此外，在医药上的应用前景也正在被人们所认识；卤素过氧化物酶，具有催化硫氧化、环氧化、吲哚氧化及其它反应的作用，在药物合成和高附加值化合物合成方面越来越引起重视。综合利用工艺后的残渣仍含有丰富的微量元素，如钠、镁、铝、硅、磷、硫、钾、钙、锰、铁、镍、锌、锶、氯、溴、碘等，可用于家畜的微量元素饲料添加剂辅料及农业生产中微量元素肥料。因此，龙须菜无论是大宗商品琼脂的生产原料，还是作为高附加值的藻红蛋白和功能酶的原料等都具有很好的经济价值，对龙须菜的综合利用和高品质产品的开发非常必要。
【发明内容】
本发明的目的是建立一种从养殖龙须菜中同时得到琼脂、藻红蛋白、卤素过氧化物酶及微量元素饲料添加剂和微量元素肥料的深加工方法，实现养殖龙须菜资源的深度开发利用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
按工艺和产品集成，实现龙须菜的全利用的思想，本发明采用了一种从养殖龙须菜中得到琼脂、藻红蛋白、卤素过氧化物酶及微量元素饲料添加剂和微量元素肥料的深加工方法，具体操作过程如下：
一种江蓠属养殖龙须菜的深加工方法，以中国海域养殖江蓠属龙须菜为原料，
A.提取试剂纯藻红蛋白
(1)预处理：清洗并除去龙须菜中的泥沙及其它杂物，控净水分，冷冻干燥，液氮研磨成龙须菜粉末；
(2)粗提液制备：于龙须菜粉末中加入龙须菜藻体干重10～30倍的0.01～0.2M的磷酸盐缓冲液，0～4℃，浸泡24～72h，纱布过滤得藻渣和滤液；滤液于0～4℃，3000g～8000g离心10～50min，上清液即蛋白粗提液；
(3)硫酸铵分级沉淀：粗提液加固体硫酸铵使硫酸铵于粗提液中的质量浓度为15～40％，0～4℃，6000～15000g离心10～50min；弃沉淀，上清再次加固体硫酸铵使硫酸铵于溶液中的质量浓度为55～80％，0～4℃，6000～15000g离心10～50min；收集沉淀，离心取沉淀物，用0.01～0.2M磷酸缓冲液透析10～48小时，得到蛋白溶液A；透析膜截留分子量为14000；
(4)阴离子交换柱层析分离：用含NaCl的0.01～0.2M磷酸缓冲液线性梯度洗脱蛋白溶液A，洗脱时NaCl于磷酸缓冲液中的浓度从0.05～2.0M线性变化，蛋白溶液A与洗脱液的总体积比为1∶20～40，洗脱组份按时间间隔收集，每3～10分钟收集一管，分别测定每管收集液于280nm和565nm处的吸光值，根据洗脱峰和OD565/OD280比值大小，收集比值≥1的较纯收集管内的蛋白溶液B；
(5)羟基磷灰石柱层析分离：采用浓度从0.01～0.4M变化的磷酸缓冲液作线性梯度洗脱蛋白溶液B，蛋白溶液B与洗脱液的总体积比为1∶10～30，洗脱组份按时间间隔收集，每4～12分钟收集一管，分别测定每管收集液280nm和565nm处的吸光值，根据洗脱峰和OD565/OD280比值大小，收集比值≥2.6的较纯收集管内的蛋白溶液C；
(6)凝胶过滤分子筛柱层析：采用含0.05～0.5M NaCl的0.01～0.2M磷酸缓冲液洗脱液洗脱蛋白溶液C，洗脱组份按时间间隔收集，每4～10分钟收集一管，分别测定每管收集液的280nm和565nm处的吸光值，根据OD565/OD280比值大小，收集纯度≥4.0的试剂纯藻红蛋白；
B.提取电泳纯卤素过氧化物酶：
测定步骤A(4)中每管收集蛋白溶液B的卤素过氧化物酶活力及280nm处的吸光值，收集合并有酶活力的溶液，得到卤素过氧化物酶；将收集的溶液经0.01～0.1M、pH7～9Tris-Cl缓冲液透析过夜，透析膜截留分子量为14000，提高酶活力；
C.琼脂提取：
将步骤A(2)中浸提得粗蛋白之后的藻渣，于质量浓度0.5～9％NaOH溶液中处理，体系固液质量体积比为1∶10～50，处理温度为50～100℃，时间是0.5～6小时；反应后用淡水冲洗藻体至中性；藻体浸泡于水中，水面没过藻体，松散分布，充分接触光照，光照强度为0.5万～15万勒克司条件2～72小时，棕黄色藻体变成类白色，完成漂白过程；
加藻体干重的30～40倍水量，常压沸水提胶或于表压0.05～0.07MPa下提胶，时间为1～4小时，80～500目筛网过滤；
滤渣再次提胶，加藻体干重的15～20倍水量，常压沸水提胶或于表压0.05～0.07MPa下提胶，时间为0.5～2小时，80～500目筛网过滤，两次滤液合并，并收集废渣；滤液自然冷却凝固后得产品；
凝固后产品切成细长方条，放于2～6℃预冷，时间为4～6小时；再放入-20～-25℃下冻结24～36小时；脱水，浸泡、清洗胶条、干燥即得条状琼脂；经干燥，粉碎，过100～300目筛可制成粉状产品；
D.微量元素饲料添加剂和微量元素肥料制备：
步骤C琼脂提取后的废渣，置40～80℃烘干，称重，粉碎，过60～120目筛即得产品；
以上示程所获得的产品为高品质琼脂、试剂纯藻红蛋白、卤素过氧化物酶及微量元素饲料添加剂和微量元素肥料，具体过程见图1。
所述阴离子交换填料为DE52或DEAE Sepharose；所述凝胶过滤分子筛填料为Sephacryl S-300或Sephadex G-200。
所述地磷酸缓冲液的pH＝7.0。
所述的Tris-Cl缓冲液含1mM VO43-。
本发明的优点：
1.本发明可同时从养殖龙须菜中得到藻红蛋白、卤素过氧化物酶、琼脂和微量元素饲料添加剂和微量元素肥料，且纯化后的藻红蛋白纯度大于4.0，产率为4.03mg/g藻红蛋白(干重)；卤素过氧化物酶产率为5.67U/克(干重)；所得琼脂产率为19.1％(干重)，质量优良，与直接提取琼脂方法产率相当；微量元素添加剂和微量元素肥料的产率为48.2％。通过本发明可大大提高龙须菜的利用率，实现龙须菜的低成本高产出。
2.分离提取的多种海藻生物产品的应用范围广。
3.本发明的方法适用于所有江蓠属及石花菜属海藻。
总之，本发明是一种环境污染低、高效可行的江蓠属养殖龙须菜深加工方法，具有广泛应用前景。
【附图说明】
图1为江蓠属养殖龙须菜综合利用工艺流程图。
图2为龙须菜原料及其综合利用后残渣的无机元素分析结果。
图3为藻红蛋白的吸收和荧光发射光谱谱图
【具体实施方式】
下面通过具体实施例对本发明的方法与结果进行说明：
实施例1
清洗并除去龙须菜中的泥沙及其它杂物，控净水分，冷冻干燥，液氮研磨成粉末；取10克藻粉，加入100ml磷酸钾盐缓冲液(0.01M，pH7.0)，2℃，浸泡30h，纱布过滤。2℃，4000g离心15min，取上清液。粗提液加固体(NH4)2SO4至最终质量浓度的25％，2℃，7000g离心20min。弃沉淀，上清再次用(NH4)2SO4沉淀(质量浓度的60％)，2℃，9000g离心30min。收集沉淀，用0.02M、pH7.0磷酸钾盐缓冲液进行透析15小时，得到蛋白粗提液A；透析膜截留分子量为14000；
透析后的蛋白溶液A上DEAE-sepharose柱分离，用含NaCl的0.02M、pH7.0磷酸钾盐缓冲液线性梯度洗脱，洗脱时NaCl于磷酸缓冲液中的浓度从0.1～1.0M线性变化，蛋白溶液A与洗脱液的总体积比为1∶35，洗脱组份按时间间隔收集，每5分钟收集一管，分别测定每管收集液的酶活及280、565nm处的吸光值，合并有酶活的组分，得到卤素过氧化物酶；同时收集OD565/OD280比值≥1的较纯收集管内的蛋白溶液B，蛋白溶液B经0.02M、pH7.0Tris-Cl缓冲液透析过夜，透析膜截留分子量为14000，提高酶活力。
蛋白溶液B，上羟基磷灰石柱层析分离，采用浓度从0.01～0.2M变化的磷酸钾盐缓冲液作线性梯度洗脱，蛋白溶液B与洗脱液的总体积比为1∶15，洗脱组份按时间间隔收集，每6分钟收集一管，分别测定每管收集液280nm和565nm处的吸光值，根据洗脱峰和OD565/OD280比值大小，收集比值≥2.6的较纯收集管内的蛋白溶液C。蛋白溶液C上凝胶过滤分子筛柱层析，采用含0.1M NaCl的0.05M磷酸钾盐缓冲液洗脱液洗脱，洗脱组份按时间间隔收集，每6分钟收集一管，分别测定每管收集液的280nm和565nm处的吸光值，根据OD565/OD280比值大小，收集纯度≥4.0的试剂纯藻红蛋白。
配制9％NaOH(质量百分比)溶液，固液比为1∶50，加热至90℃，再加入浸提得粗蛋白之后的藻渣，恒温反应1h；80目筛网过滤，回收碱液，将藻体充分水洗接近中性；藻体淡水浸泡，液面没过藻体，松散分布，光照强度为12万勒克司条件下，充足光照3小时，藻体变成类白色；藻重40倍的水加到过滤清洗后的藻体中，常压水煮提胶3小时，500目筛网趁热过滤；滤渣加水进行第二次提胶，时间和用水量均减半，500目筛网趁热过滤；两次过滤的滤液合并，自然冷却凝固后，切成细长方条。将条状凝胶置于3℃预冷4小时；放入-20℃下冻结36小时，胶条完全冻结；清水解冻胶条脱水，冰晶融化，用清水浸泡、漂洗胶条，过滤并将水分甩干；将胶条排列整理均匀，于日光下晒干，得条状琼胶；干燥后的琼胶粉碎，过200目筛网，即得琼胶粉。
琼脂提取后的废渣，置45℃烘箱烘干，称重，粉碎，过100目筛，得到微量元素饲料添加剂及微量元素肥料。龙须菜综合利用工艺前后微量元素含量比较结果见图2。
卤素过氧化物酶酶活检测方法，参见文献1：Itoh N，Izumi Y，Yamada H，1986，261：5194。藻红蛋白纯度检测方法，参见文献2：Wang GC，2002，56：509。
以干重计算，从养殖龙须菜中提取各种产品的提取量见表1。深加工方法纯化得到的藻红蛋白表现出极好的光谱学性质，其吸收和荧光发射光谱见图3。
表1从养殖龙须菜中提取各种产品的提取量(实施例1)
产品 提取量(干重) 试剂纯藻红蛋白 4.03mg/g 卤素过氧化物酶 5.67U/g 琼脂 19.1％ 微量元素饲料添加剂和微量元素肥料 48.2％
该工艺提取的琼脂，表现出优良的物理化学性质，见表2。
表2龙须菜综合利用工艺中琼脂的物理化学件质(实施例1)
物理化学性质 数值 凝胶强度(g/cm2) 1860 凝固温度(℃) 41.3 3，6-内酰半乳糖含量(％) 40.8
物理化学性质 数值 硫酸基团含量(％) 0.81
实施例2
清洗并除去龙须菜中的泥沙及其它杂物，控净水分，冷冻干燥，液氮研磨成粉末；取15克藻粉，加入300ml 0.1M磷酸钠盐缓冲液，4℃浸泡72，纱布过滤。4℃，6000g离心25min，取上清液。粗提液加固体(NH4)2SO4至最终质量浓度的30％，4℃，13000g离心15min。弃沉淀，上清再次用(NH4)2SO4沉淀(质量浓度的70％)，6℃，12000g离心25min。收集沉淀，用0.1M磷酸钠盐缓冲液进行透析36小时，得蛋白粗提液A；透析膜截留分子量为14000。
透析后的蛋白溶液A上DEAE-52柱分离，用含NaCl的0.05M、pH8.0磷酸钠盐缓冲液线性梯度洗脱，洗脱时NaCl于磷酸钠盐缓冲液中的浓度从0.1～2.0M线性变化，蛋白溶液A与洗脱液的总体积比为1∶20，洗脱组份按8分钟的间隔收集，测定每管收集液的酶活及280、565nm处的吸光值，合并有酶活的组分，得卤素过氧化物酶；同时收集OD565/OD280比值≥1的较纯收集管内的蛋白溶液B，蛋白溶液B经0.1M、pH9.0Tris-Cl缓冲液透析过夜，透析膜截留分子量为14000。
收集的蛋白溶液B，上羟基磷灰石柱层析分离，采用浓度从0.05～0.3M变化的磷酸钠盐缓冲液作线性梯度洗脱，蛋白溶液B与洗脱液的总体积比为1∶30，洗脱组份按时间间隔收集，每8分钟收集一管，分别测定每管收集液280nm和565nm处的吸光值，根据洗脱峰和OD565/OD280比值大小，收集比值≥2.6的较纯收集管内的蛋白溶液C。收集的蛋白溶液C上Sephadex G-200分子筛：用含0.4M NaCl的0.1M磷酸钠盐缓冲液洗脱，洗脱组份按8min的间隔收集，测定每管收集液的280、565nm处的吸光值，收集纯度≥4.0的试剂纯藻红蛋白。
配制3％NaOH(质量百分比)溶液加热至75℃，再加入粗蛋白浸提后的藻渣，固液比1∶20，恒温反应3h；80目筛网过滤，回收碱液，藻体充分水洗接近中性；5万勒克司光照强度条件下，光照24小时，藻体变成类白色；藻体及藻重30倍的水，在0.06MPa表压下提胶1小时，80目筛网趁热过滤；滤渣加水进行第二次提胶，时间和用水量均减半，80目筛网趁热过滤；两次过滤的滤液合并，自然冷却凝固后，切成细长方条。将条状凝胶置于5℃预冷6小时；再放入-25℃下冻结24小时，胶条完全冻结；清水解冻浸泡，反复清洗胶条，直至发亮发白；将胶条排整均匀，于60℃的烘箱中烘干，得条状琼胶；干燥后的琼胶粉碎，过200目筛网，即得琼脂粉。
琼脂提取后的废渣，置80℃烘箱烘干，称重，粉碎，过60目筛，得微量元素饲料添加剂和微量元素肥料。