茜草提取物及其制备方法和应用.pdf

本发明涉及一种茜草提取物及其制备方法和应用，其中茜草提取物由以下方法制备获得：将茜草根茎经粉碎，用乙醇在室温下渗漉提取；回收乙醇，得到浸膏；将浸膏溶于水中，加热使其完全溶解；然后用乙酸乙酯萃取，浓缩得到茜草乙酸乙酯提取物。实验表明：茜草乙酸乙酯提取物及化合物茜素能有效降低四氧嘧啶致高血糖小鼠的血糖值、GSP值、TG值和组织匀浆中的MDA含量，且能显著的升高小鼠肝细胞的SOD活力值以及增加组织肝糖原含量。证明茜草乙酸乙酯提取物和茜素具有很好的降血糖作用。

1、  一种茜草提取物，其特征在于：由以下方法制备获得：将茜草根茎经粉碎，用乙醇在室温下渗漉提取；回收乙醇，得到浸膏；将浸膏溶于水中，加热使其完全溶解；然后用乙酸乙酯萃取，浓缩得到茜草乙酸乙酯提取物。

2、  根据权利要求1所述的茜草提取物，其特征在于：所述的茜草根茎经干燥处理。

3、  根据权利要求1所述的茜草提取物，其特征在于：所述的乙醇体积分数为95％。

4、  一种茜草提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将茜草根茎干燥，粉碎，用体积分数为95％的乙醇在室温下渗漉提取，回收乙醇，得到浸膏；将浸膏溶于水中，加热使其完全溶解；然后用乙酸乙酯萃取，浓缩得到乙酸乙酯提取物。

5、  根据权利要求4所述的茜草提取物的制备方法，其特征在于：将制得的乙酸乙酯提取物进行分离得到化合物茜素。

6、  根据权利要求5所述的茜草提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：乙酸乙酯提取物经过200～300目硅胶柱色谱，石油醚-丙酮梯度洗脱(95∶5～9∶1)，然后经硅胶H柱色谱，石油醚-丙酮(15∶1)洗脱，以TLC检测合并，经Sephadex LH-20柱色谱，丙酮洗脱，得到化合物茜素。

7、  根据权利要求6所述的茜草提取物的制备方法，其特征在于：经梯度洗脱后得到4个部分，其中第3个部位经过硅胶H柱色谱。

8、  茜草乙酸乙酯提取物在制备降血糖及用于治疗糖尿病药物方面的应用。

9、  化合物茜素在制备降血糖及用于治疗糖尿病药物方面的应用。

茜草提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及了一种茜草乙酸乙酯提取物的制备方法及其在制备降血糖和治疗糖尿病药物的应用；尤其涉及一种该部位分离化合物茜素在制备降血糖和治疗糖尿病药物方面的应用。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为特征，代谢紊乱为表现，与胰岛素分泌密切相关的全身性疾病，是由于遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织对胰岛素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱。糖尿病主要分为两种类型：I型糖尿病(即胰岛素依赖型糖尿病)和II型糖尿病(即非胰岛素依赖型糖尿病)，后者约占患者总数的99％-95％。糖尿病的临床表现为三多(多食、多饮、多尿)、一少(体重下降)、高血糖症状。糖尿病引起的并发症(如心血管、肾、视网膜和神经系统的慢性并发症、糖尿病酮症酸中毒、高渗性非酮症糖尿病昏迷等急性并发症)是导致患者死亡的主要原因。所有的糖尿病并发症可以通过严格血糖控制，从最大程度上进行预防，如果糖尿病患者能将自己的血糖水平控制在接近正常的血糖范围内，则糖尿病并发症就不会出现，或者出现得比较晚并且程度也较轻。糖尿病是世界范围最常见的流行病之一，已经成为继心血管、肿瘤之后的第三大严重威胁人类健康的非传染病。根据世界卫生组织(WHO)报道，1995年全球已确诊的糖尿病患者约1.35亿，而近期IDF 2006年报告全球糖尿病患者已达2.46亿预测到2025年糖尿病患者将达到3.88亿。2003年中国已经成为糖尿病第二大国，拥有2380万糖尿病患者，专家估计，至2010年我国发病人数将达到6000万。糖尿病成为威胁人类的第3位“健康杀手”，所以预防和治疗糖尿病已成为全球性的保健问题。
多年来糖尿病的治疗药物以西药为主，长期以来主要集中于磺脲类与双胍类药物。但这些药物存在着低血糖症和胃肠道反应等不良反应，因而寻找高效低毒的降糖药仍是医药专家追求的目标。由于传统中药及天然植物药具有相对安全和价格低廉、作用温和持久和可延缓并发症等优点，不失为寻找降糖新药的一条重要途径，因此开发中药及天然植物药作为降糖药可以提供更广泛的糖尿病治疗药物来源。
茜草即茜根，俗名血见愁、小活血、活血草、锯子草、拉拉藤、小血藤，为茜草科植物茜草(Rubia cordifolia L.)的干燥根及根茎。茜草科茜草属植物全世界有60余种，主要分布于亚洲、欧洲、美洲和非洲。我国有24种10变种，遍布全国各地，尤以西南地区种类最多。茜草分布甚广，但至今仍以陕西、山西和河南为主产区，茜草性寒味苦，归心肝经，具有凉血止血、祛风除湿、祛淤通经、活血祛瘀、止咳祛痰之功效，主治吐血、衄血、血热崩漏、闭经、跌打损伤。茜草中主要含有水溶性的环已肽系列物、脂溶性成分蒽醌及其糖苷、萘醌及其糖苷，此外还含有萜类、β-谷甾醇、脂肪酸化合物和微量元素。
茜素是从茜草(Rubia Cordifolia L.)根中提取、分离出来的蒽醌类化合物，学名1，2-二羟基蒽醌。药理研究表明茜素有显著的抑菌作用，对该化合物其它方面药理活性未见研究报道。
发明内容
本发明的目的还在于提供一种茜草提取物。
本发明的目的还在于提供一种茜草乙酸乙酯提取物的制备方法。
同时，本发明的目的还在于提供一种茜草乙酸乙酯提取物在制备治疗糖尿病药物方面的应用。
本发明的目的还在于提供一种从中药茜草中分离的化合物茜素，该化合物可用于制备降血糖药物。
为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种茜草提取物，由以下方法制备获得：将茜草根茎经粉碎，用乙醇在室温下渗漉提取；回收乙醇，得到浸膏；将浸膏溶于水中，加热使其完全溶解；然后用乙酸乙酯萃取，浓缩得到茜草乙酸乙酯提取物。
所述的茜草根茎经干燥处理。
所述的乙醇体积分数为95％。
同时，本发明的技术方案还在于采用了一种茜草乙酸乙酯提取物的制备方法，包括以下步骤：将茜草根茎干燥，粉碎，用体积分数为95％的乙醇在室温下渗漉提取，回收乙醇，得到浸膏；将浸膏溶于水中，加热使其完全溶解；然后用乙酸乙酯萃取，浓缩得到乙酸乙酯提取物。
本发明的技术方案还采用了一种从乙酸乙酯提取物进行分离得到化合物茜素德方法，具体步骤为：乙酸乙酯提取物经过200～300目硅胶柱色谱，石油醚-丙酮梯度洗脱(95∶5～9∶1)，得到4个部分，其中第3部分经硅胶H柱色谱，石油醚-丙酮(15∶1)洗脱，以TLC检测合并，经Sephadex LH-20柱色谱，丙酮洗脱，得到化合物茜素。
进一步，本发明的技术方案采用了一种茜草乙酸乙酯提取物在制备降血糖及用于治疗糖尿病药物方面的应用。
同时，还采用了一种化合物茜素在制备降血糖及用于治疗糖尿病药物方面的应用。
所述的化合物茜素来自任何含有茜素的原料药，优选来自中药茜草原料药中的乙酸乙酯部位。
茜草在自然界中分布很广泛，这就使得本发明的原料易得，成本很低。实验表明：茜草乙酸乙酯提取物以及利其经过进一步提取分离得到的茜素具有很好的降血糖作用。
以四氧嘧啶诱导小鼠β细胞损伤，造成糖尿病模型后，以茜草乙酸乙酯提取物和茜素灌胃，检测小鼠血清中的血糖值、GSP值、TG值、肝糖原含量以及肝组织匀浆中的SOD和MDA值，实验表明：茜草乙酸乙酯提取物及化合物茜素能有效降低四氧嘧啶致高血糖小鼠的血糖值、GSP值、TG值和组织匀浆中的MDA含量，且能显著的升高小鼠肝细胞的SOD活力值以及增加组织肝糖原含量。证明茜草乙酸乙酯提取物和茜素具有很好的降血糖作用。
通过采用本发明的方法处理所得的茜草乙酸乙酯提取物以及其分离产物化合物茜素，可以制成各种制剂，包括：栓剂、片剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、微囊剂、滴丸剂、气雾剂、酒剂、糖浆剂、口服液等。
具体实施方式
实施例1
本实施例为茜草提取物——乙酸乙酯部位的提取方法，具体包括以下步骤：取茜草干品，粉碎，用95％酒精室温下渗漉提取，回收乙醇，得到浸膏；将浸膏溶于水中，加热使其完全溶解；然后用乙酸乙酯萃取，浓缩得到乙酸乙酯提取物。
实施例2
本实施例为茜草乙酸乙酯提取物的分离产物——化合物茜素的分离方法，体包括以下步骤：乙酸乙酯提取物经过200～300目硅胶柱色谱，石油醚-丙酮梯度洗脱(95∶5～9∶1)，得到4个部分，其中第3部分经硅胶H柱色谱，石油醚-丙酮(15∶1)洗脱，以TLC检测合并，经Sephadex LH-20柱色谱，丙酮洗脱，得到化合物茜素。
实施例3
本实施例为茜草乙酸乙酯提取物以及化合物茜素的治疗糖尿病作用实验。
方法：小鼠四氧嘧啶糖尿病模型
原理：四氧嘧啶(Alloxan)是胰岛β细胞毒剂，可选择性的损伤多种动物的胰岛β细胞，引起糖尿病。由于其遭模方法简便，形成率高，是最常用的糖尿病动物模型。对于四氧嘧啶小鼠糖尿病模型的稳定性研究中，主要是通过四氧嘧啶溶液，在注射后所致糖尿病，一定时间内检测小鼠血清中血糖值。糖尿病时，反映过去1-2周平均血糖水平以及药物对体内非酶糖化作用的影响的GSP(糖化血清蛋白)含量会升高，同时，机体内糖原合成过程中的某些酶活性低下，糖原合成减少，表现为肝糖原含量减少。另外，糖尿病同时可造成组织的氧化损伤，表现为肝组织中的超氧化物歧化酶(SOD)降低和丙二醛(MDA)的含量的升高。还可引起脂类代谢障碍，表现为血清甘油三酯(TG)的升高。
仪器：UV-2000型紫外可见分光光度计(尤尼可上海仪器有限公司)，CS-H1型混合器(北京博励阳科技公司)，LRH-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司)，Multiskan MK3酶标仪(热电上海仪器有限公司)，TGL-16高速离心机(江苏金坛市中大仪器厂)，985370-395型组织匀浆机(BIOSREC，Mexico)，各种规格移液器等。
试剂：Alloxan(alfa asear公司，批号：2244-11-3)阿卡波糖片(杭州中美华东制药有限公司，批号：080105)，考马斯亮蓝G250(上海化学试剂公司分装厂，批号：20050115)，葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司，批号：20080705)GSP、TG、肝糖原检测试剂盒(均为南京建成生物工程研究所)，其他试剂均为分析纯。
实验方法：
小鼠(雄性，体重：22±2g)适应7d后，随机分成组，空白对照组10只，另一组为糖尿病造模组。糖尿病造模组于禁食不禁水12-16h小时后按80mg/kg一次性尾静脉注射4％四氧嘧啶致糖尿病。
96h小时后禁食不禁水6h，称重、眼眶静脉取血，分离血清。以血糖值大于11.1mmol/L作为成功造模的标准，根据血糖值均衡原则将造模成功的分组，每组11只。
分组后给药组每天开始灌胃相应的药物，阿卡波糖阳性对照组每天灌胃75mg/kg，茜草乙酸乙酯提取物组每天灌胃750mg/kg，茜素组每天灌胃50mg/kg，正常对照组和模型组每天灌胃相应的CMC-Na，给药8d后禁食6h，摘眼球取血分离血清测定空腹血糖值、GSP含量、TG含量，分离出肝脏称重，取一部分(约80mg)测定肝糖原含量，并称量约300mg和约30mg的肝脏用0-3℃生理盐水匀浆成10％(测MDA)和1％(测SOD)的肝脏匀浆液，测定MDA和SOD，考马斯亮蓝除蛋白。另取脾脏、肾脏称重计算各脏器指数。
血糖、GSP、TG、肝糖原含量、SOD和MDA的测定均按照试剂盒的要求进行，实验数据x±s表示，实验统计采用spss11.0统计软件进行单因素方差分析。
结果：
(1)茜草乙酸乙酯提取物和化合物茜素对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖值、GSP含量、肝糖原含量的影响结果见表1，表中显示，茜草乙酸乙酯提取物组和茜素组的血糖值均低于模型组和给药前值，显示出显著的降血糖作用，且GSP含量明显低于模型组，而肝糖原含量明显高于模型组，且数据差异具有显著性意义。
(2)茜草乙酸乙酯提取物和茜素对四氧嘧啶糖尿病小鼠的氧化能力的影响结果见表2，数据显示，模型组的SOD水平明显低于空白对照组，而茜草乙酸乙酯提取物和茜素的SOD水平明显高于模型组，茜素甚至高于空白对照组；且MDA水平明显低于模型组。表明茜草乙酸乙酯提取物和提取物茜素有一定的抗氧化作用，可以治疗糖尿病相关的氧化损伤。
(3)茜草乙酸乙酯提取物和茜素对四氧嘧啶糖尿病小鼠的血脂水平的影响表2数据显示，模型组的TG含量明显高于空白对照组，而茜草乙酸乙酯提取物和茜素的TG含量明显低于模型组，且低于空白对照组，显示出优于阳性对照药的降血脂作用，表明它们对于糖尿病引起的血脂代谢异常有一定治疗作用。
表1茜素乙酸乙酯提取物和茜素对糖尿病模型的治疗作用(x±s)

各组与空白对照组比较：^△P＜0.05，^△△P＜0.01，^△△△P＜0.001；
各组与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001；
各组与阳性对照组比较：^#P＜0.05，^##P＜0.01，^###P＜0.001
表2茜素乙酸乙酯提取物和茜素对糖尿病模型的
抗氧化和降血脂作用(x±s)

各组与空白对照组比较：^△P＜0.05，^△△P＜0.01，^△△△P＜0.001；
各组与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001；
实验结果表明，糖尿病模型组与空白组对照组比较，血清中血糖值维持较高水平，GSP值均明显升高，肝糖原含量降低，说明所造糖尿病模型稳定，TG值和肝细胞中MDA值均明显升高，SOD值降低，说明糖尿病引起了相关的氧化损伤和脂代谢紊乱等并发症。
茜草乙酸乙酯提取物和茜素组均具有降低糖尿病模型小鼠的血糖值、GSP含量、，升高肝组织中肝糖原含量，可见茜草乙酸乙酯提取物和茜素均有很好的降血糖作用，可开发用于糖尿病的治疗；同时，茜草乙酸乙酯提取物和茜素明显降低糖尿病小鼠血清TG含量和组织中MDA值，同时提升小鼠的SOD活力水平。可见茜素乙酸乙酯提取物和化合物茜素还具有很好抗氧化以及降血脂等辅助糖尿病治疗的作用。
实施例4
本实施例为茜草乙酸乙酯提取物片剂的制备方法：
制备方法：取上述茜草乙酸乙酯提取物300g，加入淀粉100g、阿拉伯胶15g后加入适量80％的乙醇作润湿剂混匀制成软材，于60℃温度下干燥至含水量3％以下，然后将烘干的物粉碎过14目筛，最后加入硬脂酸镁5g及滑石粉20g混匀后，过12目筛整粒，压片，质检、包衣，制成1000片。按照成人每人每天三次，每次5片。
实施例5
本实施例为化合物茜素片剂的制备方法，具体如下：
制备方法：取上述化合物茜素162g，与60g淀粉混匀，将10％的淀粉浆24g制成软材，用14目筛制粒后，置70℃～80℃干燥后于12目整粒，加入干淀粉23g及硬脂酸镁3g混匀后，压片，质检、包衣，制成1000片。按照成人每人每天三次，每次2片。
实施例6
本实施例为茜草乙酸乙酯提取物胶囊剂的制备方法，具体如下：
制备方法：取茜草乙酸乙酯提取物450g，分铺烘盘上，放入40-50℃烘箱中干燥至含水量在3％以下，然后将烘干的块状物碎成8目以下的粉末，加10％的淀粉浆适量制成软材，干燥后，用8目筛制粒，按照0.4g粉末/粒直接装入胶囊，制成1000粒胶囊，包装。茜草乙酸乙酯提取物胶囊剂每人每天服用三次，每次3粒胶囊。
实施例7
本实施例为化合物茜素的胶囊剂的制备方法，具体步骤如下：
取化合物茜素90g，与40g淀粉混匀，加10％的淀粉浆适量制成软材，用14目筛制粒后，置70℃～80℃干燥后用8目筛制粒，按照0.4g粉末/粒直接装入胶囊，制成1000粒胶囊，包装。化合物茜素胶囊剂每人每天服用三次，每次1粒胶囊。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。