大环内酯类化合物 本发明涉及一类新的大环内酯类化合物，它们具有重要的药学和相关的活性。为了方便起见，该类新的大环内酯类化合物在本申请中统称为“Sanglifehrins”
从放线菌发酵肉汤培养基中首次分离出Sanglifehrins。它们是下式的Sanglifehrins A-D：
可以看出，大环Sanglifehrins A-D具有完全新的结构，其特征在于i)1至6位含有3-羧基哌哒嗪基羧酸残基(3-carboxypiperidazinylcarboxylic acid residue)，ii)7至9位含有芳香族α-氨基酸残基，iii)10至12位含有脂肪族α-氨基酸残基。该大环的其余那分含有羟基羧酸残基，在Sanglifehrins A-D的情况下该主环中提供另外的11个碳原子。
在大环内酯化学中按照方便的作法，Sanglifehrin基本大环的原子按照以上Sanglifehrin A所示进行编号，即将大环内酯键羰基的碳原子作为1位开始编号。
Sanglifehrins A-D特征还在于，通过烃基连接基团在大环的23位上连有新的双环螺旋系统。
Sanglifehrins A-D可以经历广泛的化学反应，得到另一类Sanglifehrin大环。所述反应包括大环(尤其是在该内酯氧基团上)的裂解、在大环内酯和螺旋环系统之间连接基团的裂解，以及如以下所述取代基团的保护反应、衍生反应或其他化学修饰。熟悉本技术领域的专业人员对进一步化学修饰方法是明白地。
按照本发明，已经发现，就其生物活性来说，Sanglifehrins(尤其是其中有螺旋环的Sanglifehrins，vk Sanglifehrins A-D的情况)，具有特征性的和完全新的作用。尤其是已发现它们具有以下共同活性：
-亲环蛋白结合活性；
-免疫抑制活性；
-抑制B-细胞和T-细胞增生；
-它们没有FK结合蛋白结合活性或钙调磷酸酶抑制活性。
因此，可以将Sanglifehrins看作为提供了一类令人鼓舞的和新的免疫抑制剂和抗感染化合物。尤其是Sanglifehrins具有不同于先前已知免疫抑制剂和抗感染化合物(如环孢菌素类和大环内酯类，例如雷怕霉素和FK-506)的活性特点，同时表明，Sanglifehrins具有不同于先前化合物的作用模式。因此就结构和活性来说，Sanglifehrins提供了一类新的药物，可以预料它们实质上扩大了免疫抑制和/或抗感染治疗的范围，例如它们避免或减少了先前免疫抑制和抗感染治疗不希望有的副作用，和/或改进或扩大了对新的疾病范围或新的患者类型的治疗。
Sanglifehrins，例如其中大环内酯环是开环形式，其中在大环内酯与螺旋环系统之间的烃基连接的26位和27位均可以有羟基取代，或者其中与大环连接的螺环残基被裂解或截断，它们通常部分或完全的失去Sanglifehrins共同的特征活性。例如，其中螺环残基被裂解的Sanglifehrins通常具有亲环的蛋白结合活性，但是不具有明显的免疫抑制活性。然而，熟悉本技术领域的专业人员明白，这样的化合物提供了制备另外新的Sanglifehrins有价值的成分、中间体或关键的结构骨架，从而进一步扩大了Sanglifehrin类化合物可能的治疗效果。
例如Sanglifehrins A～D中双环螺旋系统可以看作为提供了具有关键生物效果的结构成分，由于它的存在显然对生物活性是重要的，因此它可以用作为制备另外的Sanglifehrins进一步衍生或修饰的结构成分，或者用作为衍生或修饰其他药物的结构成分，例如可以用于改变大环内酯类其他免疫抑制剂的活性。
如以上所示，Sanglifehrins代表了完全新颖和完全具有特征结构的一类新的大环内酯类化合物。
因此，第一方面，本发明提供了一大环内酯类化合物，它们为游离的或受保护的形式，或为其盐，其中
i)大环的2～6位为哌哒嗪基羧酸残基(piperidazinyl carboxylicacid residue)；和/或
ii)大环的7～9位为芳香族α-氨基酸残基；和/或
iii)大环的10～12位为脂肪族α-氨基酸残基。
本发明的大环内酯类化合物合适地包括特征结构i)、ii)和iii)中的2项，尤其是包括全部3项特征结构i)、ii)和iii)。
哌哒嗪基(piperidazinyl)羧酸残基合适地为1，2-哌哒嗪-3-羧基-1-基残基，其中羧基位于大环的1位，1-氮原子位于大环的6位，例如式I残基，其中编号代表残基的原子在大环中的位置。该残基可以是环被取代的或者是未被取代的。未被取代是合适的。
芳香族α-氨基酸残基的α-氨基部分合适地位于大环的9位。合适的芳香族α-氨基酸为苯基丙氨酸，尤其是3-OH-苯基丙氨酸，残基可为游离的或受保护的形式。
脂肪族α-氨基酸残基的α-氨基部分合适地位于大环的12位。合适的脂肪族α-氨基酸残基为游离的或受保护形式的缬氨酸。
大环的其余部分合适地含有一羟基羧酸残基，它的氧部分连接大环内酯键，它的羰基部分与大环12位上的α-氨基一起形成一酰氨键。所述羟基羧酸残基有6～20个碳原子链长是合适的，有11个碳原子链长更合适。它可以是被取代的或者是未被取代的，和/或它含有1个或多个不饱和的键，尤其是沿其链长有多个双键。更合适的是，大环的其余部分含有11-氧-十一碳烯酰(endecanoyl)-11-基，尤其是11-氧-6，8-十一碳二烯酰(endecadienoyl)-11-基，该残基可任意地被取代，例如在2、3、4和/或5位取代。所述羟基羧酸残基更合适的是式II残基，它可以是游离的或受保护的形式，或为其盐，其中R1和R2均为氢，或代表额外键；
R3为氢；
R4为-CO-CH3或-CH(OH)-CH3，或
R3与R4一起代表式III结构，按照本发明，优选的大环内酯类化合物含有式IV的大环，其中X、Y和Z是以上定义的残基i)、ii)和iii)，A为以上定义的羟基羧酸残基，它可以是游离的或受保护的形式，或其盐；尤其是含有式V的大环，它可以是游离的或受保护的形式，或为其盐，
一般来讲，在Sanglifehrins(如在Sanglifehrins A～D)中，大环在邻近内酯桥氧部分的碳原子上被取代。所述取代基通常包括2-氧杂-2′-氮杂-3′-氧代-螺双环己烷-3-基残基，例如式VI，它可以是游离的或受保护的形式，或其盐，它通过螺环残基和大环内酯环之间含有6-11个碳原子(通常为9个碳原子)链长的连接基团与大环内酯环相连，其中-a-b-为-(Me)C＝CH-或-(Me)CH-CH(OH)-，和
R5为H或Me
(其中Me和Et分别代表甲基和乙基)
该连接基团可以是被取代的或是未被取代的，和/或含有1个或多个不饱和键，尤其是沿其链长的多个双键。该连接基团可以适当地被甲基取代，例如由2个甲基取代。该连接基团可以适当地被羟基进一步取代，例如由3个羟基取代，和/或可以烯化不饱和，例如可以含有2个碳-碳双键。更合适的是，该连接基团含有1-甲基-7-甲基-壬酰基-9-基，尤其是1-甲基-7-甲基-1-壬酰基-9-基或1-甲基-7-甲基-1，3-壬二烯酰基-9-基，残基可任意地被取代，例如在3、4和/或8位取代。优选的连接基团是式VII基团，它可以是游离的或受保护的形式，其中c代表与螺环残基相连，
d代表与大环相连；
R6和R7各自为OH，或者它们一起代表另外的键。
所述连接基团通常在邻近内酯氧基团的碳原子处与大环相连，即当大环含有11-氧-十一碳烯酰基-11-基残基时，在其11位相连。
因此本发明提供了式VIII化合物，可以是游离的或受保护的形式，或为其盐，
S-L-M VIII其中S代表如以上定义的螺旋双环残基；
L代表如以上定义的连接基团；
M代表如以上定义的大环内酯环。
本发明具体的化合物是式IX所示化合物，可以是游离的或受保护的形式，或为其盐，其中-a-b-的定义同上；
-e-f-为-CH(OH)-CH(OH)-或-CH＝CH-；
-g-h-同上述-a-b-的定义，和
R3、R4和R5的定义同上。
式I～IX化合物含有不对称碳原子，因此可以有许多差向立体异构体形式。所有这些可能的差向立体异构体以及它们的非对映异构体混合物均包括在本发明内。但是，其中大环内酯环为闭环形式并且有合适立体化学的式VIII和IX化合物一般具有如以上所述Sanglifehrins特征的活性。优选具有Sanglifehrin特征活性的差向立体异构体。一般来说，对于本发明的药学用途，优选纯的或实质上纯的(即游离的或实质上游离的Sanglifehrin特征活性缺乏的差向立体异构体)具有Sanglifehrin特征活性的差向立体异构体，例如含有至少90％，例如含有至少95％活性的差向立体异构体(即含有少于10％，例如含有少于5％无活性的差向立体异构体)。
在大环1～6位的3-羧基哌哒嗪基羧酸残基最好具有下式构型：
在大环7～9位的芳香族氨基酸ii)最好为L构型，例如最好为下式构型，
在大环10～12位的脂肪族氨基酸iii)最好为L构型，例如最好为下式构型，当大环的其余部分含有式II残基时，它最好具有下式构型，或当R3和R4一起代表下式时，它最好具有下式构型，
2-氧杂-2′-氮杂-3′-氧代-螺双环己烷-3-基残基最好具有下式构型，其中当-a-b-为-(Me)CH-CH(OH)-时，它最好为下式构型，当连接基团为式VII时，它最好为下式构型，
当R6和R7各自为OH时，在26和27位上的构型最好为26(S)、27(S)或26(R)、27(R)。当R6和R7一起代表另外的键时，在26和27位上的构型最好如下式，
本发明式IX化合物最好具有下式构型，其中当-a-b-为-(Me)CH-CH(OH)-时，它最好为下式构型，
当-e-f-为-CH(OH)-CH(OH)-时，它最好具有(S)，(S)构型或(R)，(R)构型，
当-g-h-为-(Me)CH-CH(OH)-时，它最好具有下式构型，
当-g-h-为-(Me)C＝CH-时，它最好具有下式构型，
当R3和R4稠合在一起时，它们最好具有下式构型，
Sanglifehrins A～C最好具有下式构型，
本发明化合物可以为游离的或受保护的形式，例如“ProtectiveGroups in Organic Synthesis”(由T.W.Greene和P.G.M.Wuts编著，第二版，1991，John Wiley & Sons Inc.，New York)中所述受保护形式。尤其是羟基可以为受保护的形式，例如为甲硅烷基醚(例如在Green和Wuts编著的上述一书的p.68-86所述)、酯(见Green和Wuts编著的上述一书的p.87-103)和碳酸酯的形式(见Green和Wuts编著的上述一书的p.104-111)。所述受保护的形式也包括内部受保护的形式；例如在式IX大环内酯的情况(其中-g-h-为-CH(CH3)-CH(OH)-)，其中大环14～17位受保护的形式包括式X残基，
例如其构型为
又例如，在Sanglifehrins中的1，3-二醇可以以合适的环结构进行保护，例如参见Greene和Wuts编著的上述一书的p.118-142所述。
本发明化合物还可以以盐的形式存在。用于本发明药学上适用的盐的实例，根据存在于化合物中特定的取代基包括酸加成盐和碱加成盐。如以上所述，本发明化合物的大环可以被裂解(尤其在内酯氧基上)，得到其中大环为开环形式的化合物。内酯氧基的裂解一般可通过水解(溶剂分解)进行，得到式XI化合物，
R6O-X-Y-Z-A-OH XI例如式XII化合物，例如式IX′化合物，其中X、Y、Z、A、R3、R4和R5的定义同上，R6为氢或C1-4烷基，例如甲基。
所述开环形式提供了改变基本Sanglifehrin大环系统中间体的方法，它们也属于本发明部分。
因此，另一方面，本发明还提供了
-上述开环形式的大环内酯，所述开环大环为游离的或受保护的形式，或为其盐；
-上述化合物R6O-X-Y-Z-A-OH，它可以为游离的或受保护的形式，或为其盐；
-化合物R6O-X-Y-Z-A′-CH(OH)-L-S，为游离的或受保护的形式，或为其盐，其中-A′-CH(OH)-为羟基羧酸残基，例如上面定义的式II残基，其他符号的定义同上；
式XII′化合物，为游离的或受保护的形式，或为其盐，
-式IX″化合物，为游离的或受保护的形式，或为其盐，
本发明还包括其中2-氧杂-2′-氮杂-3′-氧代-3′-基-螺双环己烷系统为开环形式的化合物，例如式XII化合物，它可以是游离的或受保护的形式，或为其盐，其中a、b、L和M的定义同上。
本发明的开环化合物的构型最好为以上闭环化合物确定的优选构型。开环螺双环系统化合物式XII最好具有下式构型，其中当-a-b-为-(Me)CH-CH(OH)-时，它最好具有下式构型，
具有与大环连接的螺双环残基的本发明大环内酯还可以经历涉及连接基团的裂解(例如关于式IX，尤其是在残基26和27之间的键)，结果得到独立的新的螺双环化合物和另一大环内酯类化合物。如以上所述，上述化合物也可以用作为中间体，尤其是在Sanglifehrins的生物活性中具有主要官能作用的Sanglifehrins的螺双环部分。
因此，本发明提供了：
-2-氧杂-2′-氮杂-3′-氧代-3′-基-螺双环己烷，它可以为游离的或受保护的形式，或为其盐，尤其是式VI′化合物，它可以是游离的或受保护的形式，或为其盐，其中R7为H，任意受保护的OH基团，活性官能团或-CH2-CH(OH)-CH(CH3)-CH2-CH2-CHO基团，或其等效的δ邻位羟基内醚
优选的式VI′化合物具有以下构型，其中当-a-b-为-(Me)CH-CH(OH)-时，它最好具有下式构型，
本发明还包括开环的2-氧杂-2′-氮杂-3′-氧代-3′-基-螺双环己烷，它为游离的或受保护的形式，或为其盐，尤其是式XII′化合物，它为游离的或受保护的形式，或为其盐，其中a、b和R7的定义同前。开环的螺双环系统式XII′化合物最好为下式构型，其中当-a-b-为-(Me)CH-CH(OH)-时，它最好具有下式构型，
本发明还提供了式XIII大环内酯，它为游离的或受保护的形式，或为其盐，其中M为如上定义的大环内酯环，尤其是式XIV大环内酯环，尤其是具有下式构型的大环内酯环，其中当-g-h-为-(Me)CH-CH(OH)-时，它最好具有下式构型，当-g-h-为-(Me)C＝CH-时，它最好具有下式构型，当R3和R4稠合在一起时，它们最好具有下式构型，
另一方面，本发明包括本发明所述大环内酯类及相关化合物，尤其是实质上纯的(例如至少90％，至少95％较好，尤其至少98％纯的)天然产品。
除了以上所述之外，本发明也提供了制备任一上述本发明化合物的方法，该方法包括：
i)为了制备Sanglifehrins A、B、C、D中任何一个产品，将能产生Sanglifehrin A、B、C、D的放线菌菌株在培养基中培养，并且从得到的肉汤培养物中分离所需要的Sanglifehrin A、B、C或D；
ii)为了制备Sanglifehrins C和D，使Sanglifehrins A和B在15及16位进行环合；
iii)为了制备Sanglifehrins A和B，使Sanglifehrins C和D在15和16位的邻位羟基内醚环进行开环；
iv)为了制备其中-g-h-为-C(CH3)＝CH-的式IX或IX′大环内酯，将其中-g-h-为-CH(CH3)-CH(OH)-的式IX或IX′化合物或其受保护形式进行脱水；
v)为了制备其中R4为-CH(OH)-CH3的式IX或IX′大环内酯，将其中R4为-C(O)-CH3的式IX或IX′化合物进行氢化；
vi)为了制备其中大环内酯环的14～16位含有式X残基的式IX或IX′大环内酯，使式IX或IX′化合物在15和17位进行内部保护，
vii)为了制备式IX或IX′大环内酯，使其中大环内酯环的14～16位含有式X残基的式IX或IX′化合物在15和17位进行内部保护的脱保护，
viii)为了制备其中R5为甲基的式IX或IX′大环内酯，将其中R5为氢的式IX或IX′大环内酯进行甲基化；
ix)为了制备其中R4为氧-受保护形式的式IX或IX′大环内酯，使其中R4为氧-未受保护形式的式IX或IX′大环内酯转变为氧-受保护形式；
x)为了制备其中R4为氧-未受保护形式的式IX或IX′大环内酯，使其中R4为氧-受保护形式的式IX或IX′大环内酯进行氧脱保护；
xi)为了制备在大环7～10位上有氧-受保护的羟基苯基丙氨酸残基的式IX或IX′大环内酯，使其中在大环的7～10位有氧-未受保护的羟基苯基丙氨酸残基的式IX或IX′大环内酯进行氧-保护；
xii)为了制备在大环7～10位上有氧-未受保护的羟基苯基丙氨酸残基的式IX或IX′大环内酯，使在大环7～10位有氧-受保护的羟基苯基丙氨酸残基的式IX或IX′大环内酯进行氧-脱保护；
xiii)为了制备其中-e-f-为-CH(OH)-CH(OH)-的式IX或IX′大环内酯，使其中-e-f-为-CH＝CH-的式IX或IX′大环内酯进行氧化水解；
xiv)为了制备式V′化合物或式XII化合物，使式IX或IX′的螺双环与大环之间的连接基团进行裂解；
xv)为了制备式R6O-X-Y-Z-A-OH或式R6O-X-Y-Z-A′-CH(OH)-L-S化合物，使式IV大环或式VIII大环在其内酯桥处进行开环；
xvi)为了制备闭环形式的式IX或XII大环内酯，使式R6O-X-Y-Z-A-OH化合物或式R6O-X-Y-Z-A′-CH(OH)-L-S化合物进行大环的闭合；
xvii)为了制备式XII或XII′化合物，使式IX或VI′化合物在螺双环系统内进行开环；
xix)为了制备式IX或VI′化合物，使式XII或XII′化合物在螺双环系统内进行闭合。
本发明的方法可以按例如实施例所述进行。可以明白，以上所述方法可用于任一合适的顺序或合适顺序的组合，结果得到另一大环内酯类化合物，它可以是以上所述游离的、受保护的、开环的和闭环的形式。
本发明的大环内酯，例如Sanglifehrins A～D是天然的化合物，或是由天然化合物衍生的，它们通常可以由链霉菌科的成员中得到。
如以上所述，细菌能够产生大环内酯，这在以前是未被确定的。
因此，再一方面，本发明提供了：
-产生大环内酯的放线菌菌株，其中大环内酯是下述大环内酯，其中
i)大环的2～6位为哌哒嗪基羧酸残基；和/或
ii)大环的7～9位为芳香族α-氨基酸残基；和/或
iii)大环的10～12位为脂肪族α-氨基酸残基，尤其是本发明提供了
-产生Sanglifehrin A、B、C或D的射线菌菌株。
合适的放线菌株是链霉菌科，更合适的是链霉菌属，尤其是后面所述的链霉菌sp.A 92-308110株，或者是由它衍生的菌株，例如包括其突变系、变异株、融合、重组株或改性的形式。
本发明应用的合适的菌株是生物学上纯的分离菌株。
通过常用的方法，例如通过紫外线照射或通过用化学诱变剂(如N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍)，可以使链霉菌菌株A92-308110变异或变化成不同的形式。通过原生质融合可以得到重组的细胞系。能够产生Sanglifehrins的所有变异株或重组株或变化的形式，包括能够增加收率产生Sanglifehrins的变异株和重组株均包括在本发明的范围内。
在本发明特定的实施例中，其中Sanglifehrins A、B、C和D是从新的链霉菌菌株A92-308110中分离得到的。链霉菌属A92-308110菌种以Budapest Treaty名称存储在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国(1995年5月3日)，其存储编号为DSM 9954。链霉菌属A92-308110菌种也可以从Sandoz Ltd.CH4002 Basel瑞士得到。
必须注意，按照供给规则28(4)和(5)EPC，利用DSM 9985菌种是有限制的。
在实施例2中叙述从链霉菌属A92-308110中分离SanglifehrinsA、B、C和D。
按照Bergey′s Manual(第4卷，1989，Williams and Wilkins，Baltimore)和The Prokaryotes(1992 Springer Verlag，纽约)的叙述，链霉菌属A92-308110株属于链霉菌科。该细菌的细胞壁含有LL-二氨基庚二酸。该脂肪酸是异-和反异-支链、直链和不饱和的。糖光谱不是特殊的。营养菌丝体没有分解成碎片。气生菌丝体形成长链芽孢。
根据以上所引的参考中，标为A92-308110的菌株是新的链霉菌。A92-308110生长在各种有机和无机介质中，并且在大多数情况下形成气生菌丝体。原始的基质菌丝体作为菌丝生长，并且通常为米色至淡灰棕色。气生菌丝体的颜色属于灰色型，序数4，该菌丝体形成长链的、属于螺旋b型的芽孢。
在下表中列出了链霉菌属A92-308110在常用的生物介质中的生长能力、它的碳应用以及它的生理特征。
表1.在各种生物介质中的生长
培养基 培养物特征
酵母浸出物/ 生长：良好
麦芽琼脂 基质菌丝体：淡棕色
气生菌丝体：淡灰-棕色
可溶性色素：无
燕麦琼脂 生长：良好
基质菌丝体：暗棕色
气生菌丝体：淡灰-棕色
可溶性色素：淡棕色
葡萄糖-天冬酰胺 生长：适度
基质菌丝体：淡棕色
气生菌丝体：淡灰-棕色
可溶性色素：无
无机盐/淀粉琼脂 生长：适度
基质菌丝体：灰色
气生菌丝体：淡灰-棕色
可溶性色素：无
蔗糖/硝酸盐琼脂 生长：很不好
基质菌丝体：灰白色
气生菌丝体：不好，淡灰棕色
可溶性色素：无甘油/天冬酰胺琼脂 生长：适度
基质菌丝体：淡棕色
气生菌丝体：淡灰-棕色
可溶性色素：无营养琼脂 生长：适度
基质菌丝体：米色
气生菌丝体：无
可溶性色素：棕色
表2：碳应用适度或良好： 葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖不好： 鼠李糖、蔗糖、棉子糖、纤维素、柳醇阴性： m-肌醇
表3：生理特征硝酸还原 阳性淀粉水解 对无机盐-淀粉琼脂为适度
对燕麦琼脂为阴性酪氨酸降解 阴性牛奶胨化 阳性黑素生成 阳性生长温度 18～37℃在13℃生长很不好在45℃不生长pH范围 在pH5和7，富生长
在pH9，生长良好NaCl抗性 直到6％，但在浓度为2％时生长已经减慢
本发明的大环内酯类化合物，包括Sanglifehrins A、B、C和D可以通过在合适的培养基上培养链霉菌属A92-308110或其变异株、重组株或改性形式得到。实施例1叙述(仅仅是为了本发明的叙述)了培养链霉菌属A92-308110株的方法。
因此，再一方面，本发明包括：
a)能够产生本发明大环内酯的生物学上纯的链霉菌属A92-308110(DSM 9954)株或其变异株、重组株或改性的形式，
b)制备本发明大环内酯的方法，该方法包括在合适的培养基中培养链霉菌属A92-308110(DSM 9954)菌株或其变异株、重组株或改性的形式，并且有选择地回收Sanglifehrin。
本发明的大环内酯类化合物，例如式IX化合物，例如SanglifehrinsA、B、C和D以及它们的药学上适用的盐(后面从种属上来说后面称为“本发明药物”)具有Sanglifehrin特征活性，即具有下述共同活性：
-有亲环蛋白结合活性；
-有免疫抑制活性；
-抑制B-细胞和T-细胞增生作用；
-没有FK结合蛋白结合活性；
-没有抑制钙调磷酸酶活性。
为了测定它们的活性，下面较详细地叙述试验和它们的活性。本发明大环内酯类化合物，例如式IX化合物以及Sanglifehrins A、B、C和D的生物活性可以用例如下述通常的体外和体内试验方法来表明。1.对羊血红细胞的初级体液免疫反应(MD，Mishell-Dutton)
在24孔培养板中，以1ml的最后体积将小鼠脾细胞(OF 1，雌性，8-10周龄，1×107)与羊红细胞(SRBC，3×107)共同培育3天。收集淋巴细胞，洗涤，并以1×106个细胞的密度在带有新鲜抗原(SRBC)的软琼脂上作平皿培养。培育60-90分钟之后，加入补体(豚鼠血清)，再继续培养60分钟，然后通过空斑计数(显微镜下)评价试验结果。在3天的培育中，淋巴细胞被抗原(SRBC)致敏。当再次与抗原共同养育时，B-淋巴细胞分泌特异性抗体，并与该分泌性淋巴细胞附近的抗原相结合。加入补体引起抗体包被红细胞的溶解而产生空斑。每个空斑则代表一个产生抗体的细胞。
对空斑形成的抑制作用是药剂有效性的指针。本发明的化合物，如Sanglifehrins A至D，在大约…？…至…？…nM的浓度在此试验中有活性。
参考文献：
R.I.Mishell & F.W.Dutton(1966)，正常小鼠脾细胞悬液在体外的免疫作用。Scierce 153：1004-1006。
R.I.Mishell & F.W.Dutton(1967)，从正常小鼠分离的脾细胞培养物的免疫作用。J.Exp.Med.126：423-442。2.淋巴细胞对异源性刺激的增殖反应
双向MLR(鼠混合淋巴细胞反应)
将来源于Balb/c小鼠(雌性，8-10周龄)的脾细胞(2×105)与来源于CBA小鼠(雌性，8-10周龄)的2×105脾细胞共同培育4天。异源细胞对反应性脾细胞群诱发增殖反应，可通过标记前体物掺入DNA来测定。本发明的大环内酯，如结构式IX的化合物及其药剂学可接受的盐，如Sanglifehrins A、B、C和D，具有从大约30up至200nM范围的IC50，与之相比较，环孢多肽A在此试验中测得IC50为大约20nM。
T.Meo(1979)小鼠MLR反应。In：“免疫学方法”，L.Lefkovitsand B.Pernis，Eds，Academic Press，N.Y.pp.227-239。3.LPS激活的鼠B细胞
将来源于CBA小鼠的脾细胞(2×105)与50μg/ml LPS及待测化合物混合培育48小时。通过标记的前体物掺入DNA测定细胞增殖反应。本发明的大环内酯，如结构式IX化合物及其药剂学可接受的盐，如Sanglifehrins A、B、C和D，抑制B细胞增殖，具有从大约40up至100μM范围的IC50。
参考文献：
Greaves，M.and J.Janossy，1972，通过细胞表面结合配体而引发的选择性T和B淋巴细胞反应，Transplant Rev.11：87。
Janossy，G.and M.F.Greaves，1971，淋巴细胞激活作用。I.T和B淋巴细胞对植物致丝裂素的反应。4.用THP1细胞株作体外细胞毒性和细胞抑制活性试验
用人单核细胞株THP1(5×104个细胞/孔)作细胞毒性测定，在存在IFNγ(100U/ml)和LPS(5μg/ml)加待测定化合物(至10μM)的情况下，将它在37℃培育24-72小时。用比色MTT读出法，通过测定活细胞中线粒体脱氢酶的活性而对存活细胞进行定量(Mossman1983)。在本试验经过24小时培育之后，本发明的大环内酯，如结构式IX化合物及其药剂学可接受的盐，如Sanglifehrins A、B、C和D，具有大约1000-5000nM的IC50。
Mossman T.J.(1983)，细胞生长和存活的快速比色测定法：用于细胞增殖和毒性测定，J.Imm.Methods，65，55-635.人外周血单核细胞释放TNF
按照Hansell et al.(1991)的方法，借助Ficoll-Hypaque密度分离技术，从健康志愿者的外周血制备单核细胞。在加入刺激剂之前，将细胞(105个细胞/孔，在含有10％体积FCS的200μl RPMI中)与系列稀释的待测化合物在37℃共同培育30分钟。以γ干扰素(100U/ml)和LPS(5μg/ml)作刺激剂，诱发外周血单核细胞释放α肿瘤坏死因子(TNF)。培育3小时之后，将细胞离心(1200rpm，10分钟)，收集上清液。用可购得的酶联免疫吸附试验试剂盒，测定细胞上清液中TNF的含量。用此法测定时，本发明的大环内酯，如结构式IX化合物及其药剂学可接受的盐，如Sanglifehrins A、B、C和D，具有从大约200nM至1000nM范围的IC50。6.亲环蛋白结合测定法
适合的亲环蛋白结合测定法是由Quesniaux在Eur.J.Immunol.1987 17 1359-1365中所述的竞争性ELISA试验。在此试验中，在亲环蛋白(重组的人亲环蛋白A)与包被的BSA-环孢多肽A共温育的过程中加入待测化合物，然后计算达到没有竞争剂的对照反应50％抑制所需要的浓度(IC50)。另一种测定法是Schneider et al在Biochemistry(1994)，33，8218-8224中所述的竞争结合试验。它包括在将生物素化的亲环蛋白(重组的人A)与包被的BSA-环孢多肽A共温育的过程中加入待测化合物。可通过与抗生蛋白链菌素偶联的碱性磷酸酶共温育，来测定存在和不存在待测化合物时被结合的生物素化亲环蛋白的量。本发明的大环内酯，如结构式IX化合物，如Sanglifehrin A、B、C和D，具有从大约10至100nM范围的IC50，与之相比较。当环孢多肽A用这些检测法测定时，具有大约80nM的IC50。
可用于证明Sanglifehrins生物活性的另一些体外试验是，IL-2指示基因检测法和ConA刺激脾细胞检测法(指示对T-细胞激活的作用)。
当用标准的试验进行测定时，本发明的大环内酯，如结构式IX化合物如Sanglifehrin A、B、C和D，不具有结合FK的蛋白质结合活性，也不能抑制神经钙蛋白的活性。7.大鼠的局部移植-对抗-宿主(GvH)反应
〔Ford et al.，TRANSP L.PROC.10(1979)258〕
从起始日(0天)开始，将来自6周龄雌性Wistar/Furth(WF)大鼠的脾细胞(1×107)，对体重约100g的雌性(F344×WF)F1大鼠的左后脚爪作皮下注射。动物被再连续处理4天，在第7天取出双侧腘淋巴结并称重。以二个淋巴结之间的重量差异作为评价反应的参数。
在上述试验中，对GvH反应的抑制作用是药剂效果的指针。本发明的大环内酯，如结构式IX化合物及其药剂学可接受的盐，如Sanglifehrins A、B、C和D，当以大约1mg/kg的剂量皮下给药时，能够抑制GvH反应达到大约30％。8.SRBC-TH细胞诱发的DTH
对雌性C57 BL/6小鼠(6-12周龄)的右后爪垫皮下注射TH(备用的羊红细胞)细胞克隆(2×106)和10％羊红细胞(SRBC)悬液的1∶1(v/v)混合物50μl。而对小鼠左后爪皮下注射50μl SRBC细胞悬液(以PBS 1∶1 v/v稀释的)(用于测定由于注射操作引起的非特异性爪垫肿胀增加)。24小时之后，测定左、右后爪垫的厚度。
计算右爪垫比左爪垫厚度增加的百分数(z)。右爪垫厚度＝x，左爪垫厚度＝y，％比增加＝z
z＝((x-y)/y)·100
本发明的大环内酯，如结构式IX化合物及其药剂学可接受的盐，如Sanglifehrins A、B、C和D，在皮下注射大约5mg/kg剂量时，DTH小鼠的肿胀减少达到大约50％。
参考文献
A.T.J.Bianchi，H.Hooijkaas，R.Brenner，R.Tees，AA.Nordin & M.H.Schreier(1981)辅助T细胞克隆中介抗原特异性的，H-2局限性DTH。Nature 290：62-63。
P.Herrmann，M.H.Schreier，J.-F.Borel & C.Feurer(1988)肥大细胞脱颗粒作为由纯系辅助T细胞诱发的迟发型过敏反应效应时相内的主要事件。Int.Archs Allergy appl.Immun.86：102-105。
大鼠/小鼠心脏异质移植
本发明大环内酯的体内试验效果，可用Alzet渗透微型真空泵皮下给药，通过大鼠和小鼠心脏异质移植来测定。在小鼠心脏异质移植中(以BALB/c对C3H移植)，本发明的大环内酯，如结构式IX化合物及其药剂学可接受的盐，Sanglifehrins A、B、C和D，在大约30mg/kg/天的剂量下能延长移植存活时间。在大鼠心脏异质移植中(以DA对Lewis移植)，以亚最佳剂量的环孢多肽A与本发明的大环内酯，如结构式IX化合物及其药剂学可接受的盐，如Sanglifehrins A、B、C和D，配伍给药可延长移植存活时间，如下表所示。 环孢多肽A (mg/kg) 1 1 对照(安慰剂) Sanglifehrin A (mg/kg) - 10 对照(安慰剂) 移植存活时间 (天) 12，12，12，13，13，14 29，30，45，48，＞51，＞46 对照(安慰剂)
本发明化合物可以用作为药物，例如作为免疫抑制剂以及作为抗炎剂。
本发明化合物尤其可用于防治急性和/或慢性器官或组织的同种异体移植和异种异体移植排异反应，例如用于心、肝、合并的心肺、肝、肾、胰、皮肤或角膜的移植。还表明，本发明化合物也可用于防治如下述骨髓移植的移植物抗宿主疾病。
本发明药物也可用于治疗自身免疫疾病和炎症，尤其是与病原学(包括自身免疫成分)有关的炎症，如关节炎(例如类风湿性关节炎、慢性关节炎和关节变形)以及风湿性疾病。本发明药物可以应用的具体的自身免疫疾病包括自身免疫血液疾病(包括例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞性贫血和自发的血小板减少症)、全身红斑狼疮、多软骨炎、硬皮疾、韦格内氏肉芽肿病、皮肤肌炎、慢性活性肝炎、重症肌无力、牛皮癣、史蒂文斯-约翰逊综合征、自发的口炎性腹泻、自身免疫炎性肠疾病(包括例如溃疡性结肠炎和节段性回肠炎)、内分泌的眼病、格雷夫斯病、肉样瘤病、多发性硬化病、原发性胆汁性肝硬变、青少年糖尿病(糖尿病I型)、眼色素尿炎(前和后)、干性角膜结膜炎和春天的和/或过敏性的角膜结膜炎、间隙的肺纤维化、牛皮癣关节炎、肾小球性肾炎(有或者没有肾变病综合征，例如包括自发的肾变病综合征或最小变化的肾病)以及哮喘。
对于上述用途和其他用途，本发明药物可以单独应用或者与另外的免疫抑制剂或抗炎剂(包括环孢菌素、雷怕霉素、FK 506和甾族化合物)一起应用。
对于上述适应症，合适的剂量可以根据所选用的本发明的药物、接受治疗对象的情况、给药的方式、需治疗疾病的特点和严重的程度进行变化。但是一般来讲，每天按0.01～10mg/kg剂量经口服给药，在动物试验中得到了满意的结果。在较大的哺乳动物(例如人)中，每天1次口服Sanglifehrin的剂量范围为0.5～500mg，每天以均分剂量分2～4次服用更为合适。
在人的器官移植中可以按0.1～100mg/kg剂量口服本发明药物，按0.3～30mg/kg剂量口服较好，更好的是按0.5～10mg/kg剂量口服。当本发明药物与其他的免疫抑制剂(如皮质甾类化合物或环孢菌素类或雷怕霉素类化合物)一起用二、三或四联药进行治疗时，可以应用低剂量(例如0.1mg/kg/天，静脉注射；3mg/kg/天开始口服)本发明药物尤其可以与其他非甾族的免疫抑制剂，例如与环孢菌素A、雷怕霉素或FK506一起应用，目的在于部分或完全的取代甾族化合物。
本发明药物可以按通常的途径给药，尤其是经胃肠道给药，例如以口服溶液剂形式、片剂或胶囊剂形式给药，或者以非经胃肠形式例如注射的溶液剂或混悬液剂形式给药。虽然对于某些情况(例如防治肝脏移植的排斥反应)静脉注射形式是合适的，但是对于全身给药口服通常是较好的。本发明化合物还可以局部给药或经皮给药，例如以经皮肤给药的霜剂或凝胶剂或类似的制剂形式应用，对于眼科应用，可以应用眼用霜剂、凝胶剂或滴眼制剂。
口服制剂合适的单位剂量形式为每个剂量含有例如0.5～100mg本发明化合物。
按照以上所述，本发明还提供了一系列具体的方法：
A.给需要上述治疗的对象有效的免疫抑制的方法，该方法包括给所述对象施用有效剂量的本发明药物。
B.1)防治急性和/或慢性器官同种异体移植或异种异体移植排异反应的方法，例如治疗接受上面所示任一类型器官移植接受者的排异反应的方法；
2)防治移植物抗宿主疾病的方法，例如防治骨髓移植接受者中的移植物抗宿主疾病的方法；
3)治疗自身免疫疾病或治疗上述任一疾病或病患的方法；
4)在需要所述治疗的对象中治疗哮喘的方法，该方法包括给所述对象施用有效剂量的本发明药物。
C.用作为药品的本发明化合物，例如用作为免疫抑制剂的本发明化合物，或用于治疗以上B所述疾病或病患的本发明化合物。
D.含有本发明化合物以及药学上适用的稀释剂或载体的本发明药用组合物。
E.本发明化合物在制备药物中的应用，所述药物用作为免疫抑制剂或用于治疗上述B所述疾病或病患。
此外，具有亲环蛋白结合活性的本发明大环内酯类化合物还可以用作为环孢菌素和其他亲环蛋白结合化合物的置换免疫试验的试剂，例如在我们的共同未决专利申请WO 95/07468中所述试验方法中应用作为试剂。该专利申请涉及测定血中亲免疫因子结合药物(如环孢素)浓度的试验方法，该方法包括加一结合竞争剂以便从血的免疫抑制剂一亲免疫因子复合物中置换药物；加一可与药物结合但不明显与竞争剂结合的受体；从标本中分离受体-药物复合物；测定药物的量。在该试验中Sanglifehrins可以用作为结合竞争剂，例如从亲环蛋白中置换环孢菌素，因此释放的环孢菌素可用于定量测定，例如用对环孢菌素专一的单克隆抗体进行定量测定。
以下面的实施例进一步叙述本发明，下述实施例仅是为了叙述，实施例中还涉及附图，其中
图1表明化合物Sanglifehrin B的质谱；
图2表明化合物Sanglifehrin A的质谱；
图3表明化合物Sanglifehrin D的质谱；
图4表明化合物Sanglifehrin C的质谱；
图5表明化合物Sanglifehrin B的红外光谱；
图6表明化合物Sanglifehrin A的红外光谱；
图7表明化合物Sanglifehrin D的红外光谱；
图8表明化合物Sanglifehrin C的红外光谱；
图9表明化合物Sanglifehrin A的核磁共振谱；
图10表明化合物Sanglifehrin D的核磁共振谱；
图11表明化合物Sanglifehrin B的核磁共振谱；
图12表明化合物Sanglifehrin C的核磁共振谱。
实施例
培养条件
将链霉菌属A92-308110菌株置于有合适营养物和无机物的各种培养基中于合适的温度下用需氧性或浸渍培养法进行培养。发酵培养基通常含有可利用的碳源、氮源和包括多种微量元素的无机盐，所有这些均可以确切的产品或复合混合物的形式加入，例如在各种基源生物产品中可以找到它们。
实施例1叙述得到式I化合物的固有条件。通过培养条件的最佳选定(换气、温度、pH、碳源和氮源的质量和数量、无机盐和微量元素的数量)以及通过控制生物反应罐中的发酵条件，可以提高产量。实施例1 A92-308110菌株的培养
a.起始的琼脂培养物
将A92-308110的斜琼脂培养物置于下面的琼脂培养基中生长10～14天：
葡萄糖 10.0g
可溶性淀粉 20.0g
酵母萃取物(Gistex，Gist Brocades) 5.0g
NZ-胺，A型(Sheffield) 5.0g
碳酸钙 1.0g
琼脂(Bacto) 15.0g
脱矿质水 加至 1000ml
用NaOH/H2SO4将上述培养基调至pH6.6～6.8，然后于121℃灭菌20分钟。
培养物贮存在-25℃～-70℃，在甘油一胨中的混悬物于液氮条件下贮存。
b.预培养
将芽孢和菌丝体的10份起始培养物悬浮在100ml 0.9％盐溶液中。各自含有1立升预培养基的二个2立升三角烧瓶各自用50ml上述混悬液接种。预培养基的成分如下：
葡萄糖(工业) 7.5g
甘油 7.5g
酵母萃取物(BBL) 1.35g
麦芽萃取液(Wander) 7.50g
可溶性淀粉 7.50g
NZ-胺，A型(Sheffield) 2.50g
大豆蛋白质 2.50g
L(-)天冬酰胺 1.00g
CaCO3 0.050g
NaCl 0.050g
KH2PO4 0.250g
K2HPO4 0.500g
MgSO4·7H2O 0.100g
微量元素溶液A 1ml
琼脂(Bacto) 1g
脱矿物质水 加至 1000ml
用NaOH/H2SO4将上述培养基调至pH6.8～7.2，并于121℃灭菌20分钟。
微量元素溶液A的成分如下：
FeSO4·7H2O 5.0g
ZnSO4·7H2O 4.0g
MnCl2·4H2O 2.0g
CuSO4·5H2O 0.2g
CoCl2·6H2O 2.0g
H3BO3 0.1g
KI 0.05g
H2SO4(95％) 1ml
脱矿物质水 加至 1000ml
将上述预培养物在转速为200rpm、偏心率为50mm的旋转振荡器上于27℃发酵24小时。
c.第一中间体培养物
将各自含有50立升预培养基的二个75立升生物反应器分别用1立升预培养物接种并于27℃发酵96小时。发酵物以150rpm转速旋转。以每立升培养基每分钟0.5立升的速度引入空气。
d.第二中间体培养物
将各自含有500立升预培养基的二个750立升发酵容器分别用50立升第一中间体培养物接种。第二中间体培养物于27℃温孵70小时。以100rpm转速使发酵物旋转并以每立升培养基每分钟0.8立升的速度引入空气。
e.主要培养物
将各自含有3000立升主要培养基的二个5000立升生物反应器分别用250立升和300立升第二中间体培养物接种。主要培养物于24℃温孵96小时。生物反应器以45rpm转速旋转，并以每立升培养基每分钟0.5立升的速度引入空气。
主要培养基的成分如下：
葡萄糖(工业) 20g
麦芽萃取液(Wander) 2g
酵母萃取物(Bacto) 2g
大豆(Bacto) 2g
KH2PO4 0.2g
K2HPO4 0.4g
MgSO4·7H2O 0.2g
NaCl 0.05g
CaCl2·6H2O 0.05g
微量元素溶液B 1ml
琼脂(Bacto) 1g
脱矿物质水 加至 1000ml
用KOH/HCl将pH调至6.3。该培养基于121℃灭菌20分钟。
微量元素溶液B的成分如下：
FeSO4·7H2O 5.0g
ZnSO4·7H2O 4.0g
MnCl2·4H2O 2.0g
CuSO4·5H2O 0.2g
(NH4)6Mo7O24 0.2g
CoCl2·6H2O 1.0g
H3BO3 0.1g
KI 0.05g
H2SO4(95％) 1ml
脱矿物质水 加至 1000ml
主要培养物的最佳培养基如下：
大豆粗粉 20.0g
甘油 40.0g
MES 0.1M
脱矿物质水 加至 1000ml，pH6.8。实施例2 从链霉菌属A92-308110菌株中分离Sanglifehrins_A、B、C和D
用活性定向分级、HPLC和薄层色谱分析，从二个3000l发酵罐中完成4个新的CBA活性代谢产物的初步分离和特性鉴定。上述CBA(亲环因子结合试验)可用作生物活性的试验。
将二份3000l发酵产物分开。从每份发酵产物中取1500l，并与2000l乙酸乙酯一起置于4000l不锈钢容器内搅拌20小时。用SA-20型Westfalia-Saparator分离有机相。用80l水将乙酸乙酯萃取液洗涤2次，并在减压下蒸发至干，得到1.64和2kg萃取物。用40l甲醇/水(9∶1)和40l己烷以三步萃取法将二份粗的萃取物进行脱脂肪。在减压下蒸发至干，得到1.34kg萃取物。
在10kg Sephadex H的甲醇溶液装填的柱上分二份(每份670g)将上述脱脂肪的萃取物进行柱层析。在将每份脱脂肪萃取物加到柱中时使每份溶于3.3l甲醇中。在收集开始的15l洗脱液(作为级分1)之后，在收集2l洗脱液部分期间，继续进行层析。最具活性的级分是2、3和4，因此将其合并，得到146g。将样品再在1kg硅胶(Merck，0.04～0.063mm)柱上进一步进行层析，用甲基叔丁基醚(MTBE)、MTBE/5g甲醇和MTBE/10％甲醇作为洗脱剂。收集2l级分。级分5～9是最具活性的，将其合并，得到43.8g样品。将该样品进一步在1kg硅胶(Merck，0.04～0.063mm)柱上分离，用己烷/丙酮(7∶3)～丙酮进行梯度洗脱。将该层析的部分6(7.0g)在3kg Lihroprep R P 18(Merck，40～63μm)柱上进一步分离，用甲醇/水(94∶6)进行洗脱，得级分4～7共2.16g，然后再在100g硅胶H柱上层析分离，用二氯甲烷和3％甲醇洗脱，得到733mg，再在3kg Lichroprep R P 18柱上层析分离，得到621mg，然后在100g Lichroprep R P 18柱上层析分离，用乙腈/水(1∶1)进行洗脱，得到324mg纯的Sanglifehrin A(m.p.142～145℃(无定形的)，(α)D25＝-67.30(c＝0.988，甲醇)。
从层析柱上用己烷/丙酮洗脱得到的级分5和7合并(7.1g)，并在3kg Lichroprep R P18(40-63μm)柱上进行纯化，用甲醇/水(9∶1)洗脱，得到769mg，在100g硅胶H的柱上层析，用MTBE/3％甲醇洗脱，得到309mg，最后在100g硅胶H柱上层析，用二氯甲烷和3％甲醇洗脱，得到90mg纯化Sanglifehrin B，m.p.117～121℃(无定形的)，(α)D25＝-52.8(c＝1.128，甲醇)
在3kg Lichroprep R P 18柱上层析，用甲醇/水(94∶6)洗脱得到的级分9和10(2.147g)进一步在100g硅胶H柱上纯化，用二氯甲烷/5％甲醇洗脱，得到800mg，最后在3kg Lihroprep R P 18柱上层析，用甲醇/水(9∶1)洗脱，得到480mg Sanglifehrin C，m.p.165～170℃，(α)D25＝-35.60(c＝0.736，甲醇)。
在3kg Lichroprep R P 18柱上层析，用甲醇/水(94∶6)洗脱得到的级分11和12(835mg)进一步在100g硅胶H上纯化，用MTBE/5％甲醇洗脱，得到140mg Sanglifehrin D，mp.137～142℃，无定形的。
然后用紫外、红外、质谱和核硫共振谱表示Spnglifehrin A、B、C和D的特征。得到的结果见下面表4和附图。
表4Sanglifehrin A分子式：C60H91N5O13(1090.4)UV(MeOH)：275(1962)，242(54500)，197(75755)
H+：275(1635)，242(51884)，
OH-：292(1973)，242(60495)IR-谱：图6质谱：FAB 1096[MH+Li]+；图2NMR谱：图9Sanglifehrin B分子式：C60H89N5O12(1072.4)UV(MeOH)：273(4395)，242(50600)，197(78577)IR-谱：图5质谱：FAB 1098[MH+Li]+；图1NMR谱：图11Sanglifehrin C分子式：C61H93N5O13(1104.4)UV(MeOH)：275(1876))，242(51557)，197(72643)
H+：275(1391)，242(50120)
OH-：292(1832)，242(57960)IR-谱：图8质谱：FAB 1110[MH+Li]+；图4NMR谱：图12Sanglifehrin D分子式：C61H91N5O12(1086.4)UV(MeOH)：273(3 194)，242(47584)，197(73766)
H+：273(3237)，242(46389)
OH-：285(2600)，242(52907)IR-谱：图7质谱：FAB 1092[MH+Li]+；图3NMR谱：图10实施例3 将Sanglifehrin A转变成Sanglifehrin C
向搅拌的，冷至0℃的20mg(18.3μmol)Sanglifehrin A的0.5ml甲醇溶液中加入对甲苯磺酸一水合物结晶。将得到的黄色溶液搅拌1小时，用饱和碳酸氢钠水溶液终止反应。得到的混合物用乙酸乙酯萃取二次。有机溶液用饱和盐水洗涤，往无水硫酸钠干燥，过滤，并于减压下浓缩。残余物经硅胶柱层析纯化，用甲基叔丁基醚∶甲醇(95∶5)洗脱，得到Sanglifehrin C，为白色无定形粉末。它是Sanglifehrin C及其C53差向立体异构体的4∶1混合物，Sanglifehrin C具有下示(S)构型(R＝Me)。
非对映异构体的4∶1混合物
另外，上述转变可以用其他的质子酸(如对甲苯磺酸吡啶鎓、盐酸或硫酸)或路易斯酸(如氯化锌、溴化镁或氯化镁。四异丙醇钛或三氟化硼)于甲醇中进行。应用其他的醇溶剂或共溶剂如乙醇。异丙醇、丁醇、烯丙醇、炔丙醇、苄醇、按用样方式得到在上式结果里其中及分别乙基、异丙基、丁基、烯丙基、炔丙基、苄基的同系物。
按上述同样的方式，可以将Sanglifehrin B转变成Sanglifehrin D实施例4 将Sanglifehrin C转变成Sanglifehrin A
将550mg(0.5mmol)Sanglifehrin C在5ml 4∶1 THF-水中的溶液用0.5ml 2N稀硫酸处理并搅拌1.5小时。用饱和碳酸氢钠水溶液终止反应，得到的混合物用乙酸乙酯萃取二次。有机层先用饱和碳酸氢钠洗涤一次，然后用饱和盐水洗涤二次，经无水硫酸钠干燥，过滤，并于减压下浓缩。残余物经硅胶柱层析纯化，用甲基叔丁基醚∶甲醇(90∶10)洗脱，得到Sanglifehrin A，为白色无定形粉末。
其他的无机或有机酸可以用于含有水和任意一有机共溶剂的介质。合适的酸包括盐酸、对甲苯磺酸或其他的磺酸，对甲苯磺酸吡啶鎓、乙酸、三氟乙酸、甲酸。合适的有机共溶剂有乙腈、三甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷。
所述反应伴随形成不用数量的式XV化合物，尤其是取决于反应时间(生成式XV化合物较好的方法，见下面实施例5)。
同样，可以将Sanglifehrin D转变成Sanglifehrin B。实施例5 将Sanglifehrin A转变成式XV化合物
向搅拌的、冷至0℃的50mg(46μmmol)Sanglifehrin A在1.9ml乙腈的溶液中加入0.1ml氟化氢-吡啶。得到的黄色溶液搅拌1小时，并用饱和碳酸氢钠水溶液终止反应。得到的混合物用乙酸乙酯萃取二次。有机层用饱和盐水洗涤二次，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物经硅胶柱层析纯化，用95∶5甲基叔丁基醚∶甲醇洗脱，得到式XV化合物，为白色无定形粉末。按类似方法，可以将Sanglifehrin B转变成式XVI化合物。所述物质的C53位单一的差向立体异构体形式存在，但是绝对构型当末明确的确定。式XV：MS m/z 1078[M+Li]+(相对强度100)；1H NMR(DMSO)(仅列出具有特征的信号)δ0.40(3H，d，H-50)，1.20(3H，s，H-54)，1.69(3H，s，H-49)，4.20(1H，t，H-15)，4.58(1H，dd，H-17)，5.19(1H，dd，H-18)，5.28(1H，dd，H-23)，5.62(1H，m，H-21)，5.67(1H，m，H-27)，5.99(1H，d，H-25)，6.03(1H，dd，H-19)，6.14(1H，dd，H-20)，6.22(1H，dd，H-26).实施例6 将式XV化合物转变成Sanglifehrin A
向搅拌的54mg(μmol)式XV化合物在0.5ml 4∶1 THF-水的溶液中加入50μl 2N稀硫酸。得到的溶液于室温下搅拌12小时，用饱和碳酸氢钠水溶液终止反应。混合物用乙酸乙酯萃取2次。合并的有机层依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并于减压下浓缩。残余物经硅胶柱层析，用90∶10甲基叔丁基醚∶甲醇洗脱，得到Sanglifehrin A，为白色无定形固体。
同样，可以将式XVI化合物转变成Sanglifehrin B。
实施例3～6所述方法可以用作为有选择的分子内保护-脱保护程序。因此，按实施例5所述反应，15位羟基可以有选择地受保护，这样使得其余游离的羟基可以有选择的处理。实施例5中的方法考虑到15和17位二个羟基的选择性保护。二个方法还可以用作为C53酮的分子内保护。按实施例4和6所述反应，还可以使羟基和酮重生。因此Sanglifehrins C和D以及式XV和式XVI化合物是制备其他Sanglifehrin类化合物重要的中间体。实施例7 制备16-脱氢-17-脱羟基-Sanglifehrin A(式XVII)
将54mg(50μmol)式XV化合物和对甲苯磺酸一水合物晶体在1ml 4∶1乙腈-水中的溶液加热至80℃并保持1.5小时。加入饱和的碳酸氢钠水溶液使反应终止。得到的混合物用乙酸乙酯萃取2次。有机层用饱和的碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物经硅胶柱层析纯化(以90∶10甲基-叔丁基醚∶甲醇洗脱)，随后经反相层析(RP18，以50∶50乙腈-水～乙腈洗脱45分钟)纯化，得到纯的标题化合物，为白色无定形的固体。MS m/z 1078[M+Li]+(相对强度100)；1H NMR(DMSO)(仅列出特征信号)δ1.58(3H，s，H-50)，1.71(3H，s，H-49)，2.08(3H，s，H-54)，4.03(2H，d，H-15和C31-OH)，5.57(2H，m，H-21(和C35-OH)，5.72(1H，dt，H-27)，5.96(1H，d，C15-OH)，6.03(1H，d，H-25)，6.09-6.28(4H，m，H-18，H-19，H-20和H-26)，6.37(1H，d，H-17).实施例8 制备42-N-甲基-Sanglifehrin A(式XVIII)
向搅拌并冷却(-15℃)的109mg(0.1mmol)Sanglifehrin A和67μl(0.3mmol)2，6-二叔丁基吡啶在1ml二氯甲烷的溶液中加入16.5μl甲基三氟甲磺酸酯。将混合物温至室温并连续搅拌6小时，然后加入饱和的碳酸氢钠水溶液使反应终止。得到的混合物用乙酸乙酯萃取2次。有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物经硅胶2次连续层析纯化(以90∶10甲基-叔丁基醚∶甲醇，然后95∶5甲基-叔丁基醚∶甲醇洗脱)，得到纯的标题化合物，为白色无定形的固体。MS m/z 1110[M+Li]+(相对强度100)；1H NMR(DMSO)(仅列出特征信号)δ1.70(3H，s，H-49)，2.06(3H，s，H-54)，3.53(3H，s，42 N-Me)，3.98(1H，d，C31-OH)，4.50(1H，d，H-65)，4.77(1H，d，C17-OH)，5.43(1H，d，C15-OH)，5.49(1H，d，C35-OH)，7.50(1H，d，H-12)，8.11(1H，d，H-9)，9.22(1H，s，C61-OH).实施例9 制备53二氢Sanglifehrin A(式XIX)
向搅拌并冷却(0℃)的54mg(50μmol)Sanglifehrin A在0.5ml甲醇的溶液中加入2.8mg(75μmol)硼氢化钠。连续搅拌1小时，并加入饱和的碳酸氢钠水溶液。混合物用乙酸乙酯萃取2次。有机溶液用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物经硅胶层析纯化(先用95∶5甲基-叔丁基醚∶甲醇，然后用90∶10甲基-叔丁基醚∶甲醇洗脱)，得到纯的标题化合物，为白色无定形的固体。分离出的产物相当于约1∶1 C-53非对映体的混合物MS m/z 1098[M+Li]+(相对强度63)，1104[M+2Li-H]+(相对强度100)；1HNMR(DMSO)(仅列出特征信号)δ0.62(3H，d，H-50)，1.02(3H，d，H-54)，3.55和3.59(1H，2m，H-53).实施例10 制备53-甲苯磺酰基腙-Sanglifehrin A(式XX)
将55mg(50μmol)Sanglifehrin A和23mg(125μmol)甲苯磺酰基肼在0.5ml二氯甲烷中的混合物在室温下搅拌6小时。除去溶剂，残余物经硅胶层析纯化(以90∶10甲基-叔丁基醚∶甲醇洗脱)，得到标题化合物，为白色无定形的粉末。MS m/z 1264[M+Li]+(相对强度100)；1H NMR(DMSO)(仅列出特征信号)δ1.70(3H，s，H-49)，1.77(3H，s，H-54)，2.37(3H，s，-NSO2C6H4CH3)，6.51(1H，s，H-60)，6.59(2H，2d，H-62 and H-64)，7.06(1H，dd，H-63)，7.35(2H，d，甲苯磺酰基间位质子)，7.73(2H，d，甲苯磺酰基对位质子)。实施例11 制备26S，27S-二羟基-Sanglifehrin A(式XXI)和26R，27R-二羟基-Sanglifehrin A(式XXII)
向搅拌并冷却(0℃)的495mg(1.5mmol)铁氰化钾、207mg(1.5mmol)碳酸钾、19.5mg(0.025mmol)(DHQ)2PHAL、65μl(0.005mmol)0.08M四氧化锇在叔丁醇中的溶液和95mg(1mmol)甲基氨磺酰在2.5ml丁醇和5ml水的溶液中加入545mg(0.5mmol)Sanglifehrin A的2.5ml叔丁醇溶液。将得到的两相混合物温至室温并搅拌3小时。然后加入1.08g(8.6mmol)亚硫酸钠，随后加入乙酸乙酯和水，混合物剧烈搅拌15分钟。分离两层，水层用乙酸乙酯萃取2次。合并的有机层用饱和的碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物经反相层析纯化(RP18，以30∶70乙腈-水～乙腈洗脱60分钟)，得到26S，27S-二醇，为无定形的粉末。
用上述方法，但用(DHQD)2PHAL代替(DHQ)2PHAL，制得相应的26R，27R-二醇。
26S，27S-二醇；MS m/z 1130[M+Li]+(相对强度100)；1H NMR(DMSO)(仅列出特征信号)δ1.64(3H，s，H-49)，2.06(3H，s，H-54)，3.20(1H，宽的m，H-27)，3.45(1H，宽的m，H-31)，3.94(3H，m，H-17，H-26和C31-OH)，4.30(1H，d，C27-OH)，4.57(1H，d，C26-OH)，5.20(1H，t，H-23)，5.33(1H，d，H-25)，5.57(3H，m，H-18，H-21和C35-OH)，6.03(1H，dd，H-19)，6.14(1H，dd，H-20).26R，27R-二醇：MS m/z 1130[M+Li]+(相对强度100)；1H NMR(DMSO)(
仅列出特征信号)δ1.64(3H，s，H-49)，2.06(3H，s，H-54)，3.16(1H，宽的m，H-27)，3.48(1H，宽的m，H-31)，3.94(3H，m，H-17，H-26和C31-OH)，4.30(1H，d，C27-OH)，4.57(1H，d，C26-OH)，5.20(1H，dd，H-23)，5.35(1H，d，H-25)，5.57(3H，m，H-18，H-21和C35-OH)，6.03(1H，dd，H-19)，6.14(1H，dd，H-20).实施例12 26S，27S-二羟基-Sanglifehrin A中二醇的裂解
向90mg(79μmol)26S，27S二醇在0.9ml 2∶1 THF-水的溶液中加入33.7mg(157μmol)高碘酸钠。连续搅拌1小时，并加入饱和的碳酸氢钠水溶液。混合物用乙酸乙酯萃取2次。有机溶液用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物经硅胶纯化(95∶5甲基-叔丁基醚∶甲醇)，得到式XXIII化合物(泡沫状)和式(XXIV)化合物(粉末状)。式XXIII：MS m/z 366[M+H-H2O]+(相对强度100)；1H NMR(DMSO)(在异头中心处OHax∶Oheq差向立体异构体的2∶1混合物)
δ3.54和4.08(1H，2m，H-31)，3.57(1H，宽的m，H-35)，3.66(1H，m，H-33)，4.38(0.67H，ddd，H-27ax)，4.95(0.33H，宽的m，H-27eq)，5.40(0.33H，d，C27-OHeq)，5.59(0.33H，d，C35-OH)，5.61(0.67H，d，C35-OH)，5.96(0.67H，d，C27-OHax)，7.89(0.67H，s，NH-42)，7.91(0.33H，s，NH-42).式XXIV：MS m/z 745[M+Li]+；1H NMR(DMSO)(仅列出特征信号
δ0.64(3H，d，H-50)，0.81(6H，d，H-56和H-57)，2.06(3H，s，H-54)，2.17(4H，s，H-14 and H-49)，3.80(1H，宽的m，H-15)，3.94(1H，dd，H-17)，5.33(1H，宽的d，H-23)，5.62(2H，m，H-18和H-21)，6.89(1H，d，H-25)，6.10(1H，dd，H-19)，6.18(1H，dd，H-20)，10.0(1H，d，H-26).实施例13 Sanglifehrin A乙酰化得到61-O-乙酰基-Sanglifehrin A(式XXV)
向搅拌并冷却(0℃)的54mg(50μmol)Sanglifehrin A和50μl吡啶在0.5ml二氯甲烷的溶液中加入5.2μl(55μmol)乙酐。反应液于0℃保持1小时，然后将其温至室温，并连续搅拌12小时。加入饱和的碳酸氢钠水溶液，得到的混合物用乙酸乙酯萃取。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物经反相层析纯化(RP18，以40∶60乙腈-水～乙腈洗脱45分钟)，得到标题化合物，为无定形粉末。MS m/z 1132[M+H]+(相对强度100)；1H NMR(DMSO)(仅列出具有特征的信号)δ1.68(3H，s，H-49)，2.06(3H，s，H-54)，2.25(3H，s，CH3CO2)，4.04(1H，d，C31-OH)，4.67(1H，d，C2-NH)，4.76(1H，d，C17-OH)，5.42(2H，m，H-8和C15-OH)，5.57(3H，m，H-18，H-21和C35-OH)，6.85(1H，s，H-60)，6.98(1H，d，H-62)，7.06(1H，d，H-64)，7.31(1H，dd，H-63)，7.51(1H，d，H-12)，7.89(1H，s，H-42)，8.23(1H，d，H-9).