新型胶原制剂 本发明背景
【发明领域】
本发明涉及新型胶原/细胞毒性药物组合物。本文所述组合物与本领域迄今所公开的胶原/细胞毒性药物组合物相比在注射部位具有令人吃惊且出人意料地增加的药物保持能力。
技术状态
许多细胞疾病如肿瘤的治疗涉及细胞毒性药物的使用。这些药物以许多方式发挥其活性，通常影响细胞复制和/或生存所必需的细胞功能。在许多情形(若不是绝大数)中，细胞毒性药物对反常细胞不具有特异性，而是倾向于因与正常细胞相比异常细胞增生更迅速而发挥其有效性。尽管哺乳类宿主体内许多器官非常缓慢地再生细胞，但还存在涉及干细胞迅速增生的其他器官，特别是骨髓。因此，细胞毒性药物不仅能不利地影响缓慢再生的细胞，而且对免疫系统具有特别有害的影响。
一种使细胞毒性药物活性作用于异常细胞的方法由Luck和Brown在美国再颁布专利号RE 33,375中说明，该文献公开了通过将分散在生理上可接受的蛋白基质如胶原中的细胞毒性药物引入固态细胞生长中或现存或除去的固态细胞生长区域中来治疗涉及异常固态细胞生长的细胞疾病。该专利公开其中所述方法提供了该药物对固态细胞生长的增加有效性，同时降低对远离引入部位的细胞的细胞毒性作用。该专利的公开内容全部引入本文供参考。
尽管对固态细胞生长有效，但由Luck和Brown制备的生理上可接受的蛋白基质是光学不透明的。若此种制剂呈透明至半透明，则它将在药物上更为美观。
尽管Luck等人的方法具有益处，但进一步降低对远离引入部位的细胞的细胞毒性作用将是特别有利地。此外，还需要制备一种药物上更为美观的组合物。
本发明概要
本发明涉及包含细胞毒性药物的蛋白胶原组合物，其中该组合物不仅与现有技术组合物相比在注射部位具有改进的药物保持能力，而且药物上更为美观。
本发明的蛋白胶原组合物的特征在于具有低于约45℃的单一转变温度。与此相反，现有技术的蛋白组合物或者具有大于45℃的单一转变温度，或者具有两个转变温度，一个为低于约45℃的温度，而第二个为高于45℃的温度。正如在附图中所示，这两个转变温度在差示扫描量热法(DSC)曲线上本身显示为两个独立的峰或显示为一个具有高于或低于45℃的肩峰的峰。
令人惊奇的是，业已发现现有技术蛋白胶原组合物向本发明胶原组合物的转变增加了注射部位的药物保持能力，且提供了药物上美观、光学上半透明的组合物。
因此，在其组合物方面之一中，本发明涉及一种蛋白组合物，其中蛋白组分包含约30％至约100％的胶原，该蛋白组分分散在含水介质中以提供胶原浓度为约5至约100mg/ml且具有有效量可配伍细胞毒性药物的无定形可流动物料，其中所述蛋白组合物中的胶原具有约45℃或45℃以下的单一转变温度。
在其组合物方面的另一个中，本发明涉及一种光学上半透明的含水胶原组合物，它包含一种蛋白物质和有效量的可配伍细胞毒性药物，其中蛋白组分包含约30％至约100％胶原，所述蛋白物质以约5至约75mg/ml的浓度分散于含水介质中以提供无定形可流动物料，从而使所述胶原组合物冷却至约10℃或10℃以下时变为光学上半透明。
在其方法方面之一中，本发明涉及一种治疗肿瘤损伤或周围组织的方法，该方法包括在该损伤或该损伤周围的组织部位引入能稳定放置的蛋白组合物，该组合物包括以无定形可流动物料分散于含水介质中的胶原，该可流动物料包括足够浓度的均匀分散于其中的可配伍细胞毒性药物，从而使所述胶原具有约45℃或45℃以下的单一转变点，这样使所述药物缓慢释放到最接近的环境中，避免在远离引入部位的部位出现显著水平的药物。
附图的简要说明
图1示出了包含6.5wt％胶原的含水组合物在30℃至70℃的差示扫描量热法(DSC)扫描。该扫描显示出两个胶原转变温度，第一个在约44℃而第二个在约53℃。
图2示出了包含2.2wt％胶原和3.3wt％氟尿嘧啶的含水组合物(贮存于室温)在30℃至70℃的DSC扫描。该扫描显示出该组合物具有两个胶原转变温度，第一个在约42℃而第二个以约45-46℃的肩峰出现。
图3示出了包含2.2wt％胶原和3.3wt％氟尿嘧啶的含水组合物在30℃至70℃的DSC扫描。在配制后，该组合物在冰箱中于约4℃下贮存不少于24小时。从冰箱中取出时，该组合物呈光学半透明且DSC扫描显示出该组合物具有约42.5℃的单一胶原转变温度。
图4示出了在室温下制备的包含6.5wt％胶原的含水组合物在20℃至80℃的DSC扫描。该扫描显示出该组合物具有两个胶原转变温度，第一个在约43℃而第二个在约53℃。
图5示出了包含2.2wt％胶原和16.7mg/ml甲氨蝶呤的含水组合物在30℃至65℃的DSC扫描。在配制后，该组合物在室温下贮存一个月并且在贮存后呈光学不透明。DSC扫描显示出该组合物具有约43℃的第一胶原转变温度和约52℃的第二转变点。
图6示出了包含2.2wt％胶原和16.7mg/ml甲氨蝶呤的含水组合物在30℃至65℃的DSC扫描。在配制后，该组合物于4℃贮存1个月。从冰箱中取出时，该组合物呈光学半透明且甚至在该物质温度达到室温时也保持如此。该物质的DSC扫描显示出该组合物具有约43℃的单一胶原转变温度。
图7A-7E示出了在室温贮存0(图7A)、1(图7B)、2(图7C)、4(图7D)和8(图7E)小时的包含2wt％胶原和0.4wt％顺铂的含水组合物在30℃至70℃的DSC扫描。这些扫描显示出该组合物随时间的推移在约61℃形成胶原主转变温度，而在约43℃形成胶原次级转变温度。
图8示出了包含2.2wt％胶原和33.3mg/ml氟尿嘧啶的含水胶原组合物因在三个不同温度下贮存而对由吸光度测得的光学不透明性的影响。
图9示出了含有三种不同量的氟尿嘧啶的含水胶原组合物对由吸光度测量的光学不透明性的影响，其中各组合物然后在2-8℃下贮存。
图10示出了含水胶原组合物在两种不同pH下对由吸光度测量的光学不透明性的影响，其中各组合物随后在2-8℃下贮存。
图11示出了使用以0.25M加入的不同组分且然后在2-8℃下贮存的含水胶原组合物对由吸光度测得的光学不透明性的影响。
图12示出了通过使用本文所述组合物达到的氟尿嘧啶在注射部位的改进保持能力。
优选实施方案的详细说明
本发明涉及新颖的胶原/细胞毒性药物组合物。在一个实施方案中，本发明的胶原组合物的特征在于约45℃或45℃以下的单一胶原转变温度。在另一实施方案中，本发明的胶原组合物的特征在于光学半透明性。然而，在详细描述本发明前，首先定义如下术语：
定义
如本文所用，下列术语具有下列含意。
术语“转变温度”指含水胶原组合物中的胶原发生相变的温度。该相变通常是组合物中胶原微丝尺寸的变化且可容易地由该含水胶原组合物的常规差示扫描量热法(DSC)扫描中的峰来确定。对本申请来说，DSC测定的转变温度在以下条件下确定：以10℃/分钟在25psi氮气(N2)中加热，使用购自TA Industries(New Castle，Delaware，USA)的DSC 10仪器。
术语“单一转变温度”指含水胶原组合物中的胶原在DSC扫描中在30℃至70℃的温度范围内具有单一吸热峰。在此方面，在该峰中出现肩峰的DSC扫描在本文中被认为具有多于一个转变温度。
术语“可配伍细胞毒性药物”指不与含水胶原组合物中的胶原明显交联的细胞毒性药物。细胞毒性药物与含水胶原组合物中的胶原明显交联易于按如下实施例通过测量在细胞毒性药物存在下胶原的转变温度在室温下随时间的变化来确定。具体而言，细胞毒性药物与胶原的明显交联导致胶原随时间推移出现更高的转变温度且说明该药物与胶原不配伍。
合适的可配伍细胞毒性药物包括(仅为实例)氟尿嘧啶、甲氨蝶呤等及可配伍细胞毒性药物的混合物。用于本发明组合物中的具体可配伍细胞毒性药物或此类药物的混合物并不重要。与胶原明显交联且因此对本发明来说与胶原不配伍的细胞毒性药物实例作为举例包括顺氯氨铂(II)。
术语“有效量的可配伍细胞毒性药物”指使用足量的可配伍细胞毒性药物或其混合物以对要治疗的病症在治疗上有效，同时允许胶原组合物保持约45℃或45℃以下的单一胶原转变温度。
术语“光学半透明”指该组合物在可见光范围足够透明以致于当用波长410nm的光通过1mm组合物样品测量时吸光度低于0.6OD单位。
组合物
本文所述组合物为无定形、光学上半透明、可注射、粘稠且具有约45℃或45℃以下的单一转变温度，以基本保持固定位置而不从给药部位显著流开。本发明组合物与现有技术胶原组合物相比的一个重要优点是细胞毒性药物被更好地保持在注射部位(即在肿瘤中)，从而降低了药物转移至患者其他部位的程度。因此，药物在循环血液中的浓度保持在低水平。这样达到了与不存在胶原的细胞毒性药物直接给药相比增加的疗效；即与易感的正常细胞相比，对恶性细胞的细胞毒性作用更大。
与现有技术胶原组合物相比，本发明组合物的另一重要优点是这些组合物在可见光范围内是光学半透明的，从而提供了药物上更为美观的产品。也就是说通常认为光学透明产品在用来注射于患者时比光学不透明产品在药物上更为美观。
并不局限于任何理论，据信光学半透明性以及在注射部位增加的可配伍细胞毒性药物保持能力与其中胶原具有约45℃或45℃以下的单一转变温度的组合物有关。进而，据信此类组合物通过药物扩散到胶原纤维中而形成，使纤维断裂，从而形成更小的微丝。再有，具有更小微丝的胶原组合物具有更高的粘度且光学上呈半透明。此外，并不局限于任何理论，组合物粘度更高和随之而来的细胞毒性药物对流转移至胶原基质中的显著降低据信与组合物在注射部位的保持能力增加和在注射部位的药物剂量增加相对应。
一种形成本发明的胶原组合物的方法是通过在约10℃或10℃以下的温度(优选约0-10℃)下冷却包含有效量可配伍细胞毒性药物的常规胶原组合物足够长的时间，以允许药物扩散到胶原纤维中。如附图所示，胶原纤维最终断裂为更小的微丝由胶原组合物中胶原的转变温度变化和胶原组合物转变为光学半透明组合物来证实。
在降低的温度下形成本文所述组合物显然在环境条件下是不可逆的(或在数月或数年内缓慢可逆)，这可由冷却的组合物甚至在回到室温时保持光学半透明且保持约45℃或45℃以下的单一胶原转变温度来证实。
用于形成具有约45℃或45℃以下的单一胶原转变温度的组合物的其它方法作为举例包括打断含水组合物中胶原的微丝尺寸的方法(它们包括例如声处理和其他均化方法)，使用高浓度的特定可配伍细胞毒性药物，然后在周围环境条件下贮存长时间等。然而，由于其形成此类组合物的容易性和迅速性，优选使用冷却步骤来形成约45℃或45℃以下的单一胶原转变温度。
本文所述组合物包括其中蛋白组分含约30％至约100％胶原的蛋白物质、可配伍细胞毒性药物和生理上可接受的含水介质，在该含水介质中分散有胶原且药物可溶解、分散或与胶原配合。其他物质可任意性可有可无地存在以增加该组合物的总体有益性能。
用于本文所述组合物中的胶原可来自于任何哺乳类宿主源，如牛、猪或人，或可由其他技术制备，例如重组DAN技术。所用胶原可以是天然胶原也可以是改性胶原，如原胶原，atelocollagen等。该胶原可以是非致免疫的、致免疫的或仅轻微致免疫的。
本领域已知各种以纯化形式制备对哺乳类宿主给药的胶原或其衍生物的方法。合适的方法包括在例如美国专利号3,949,073和其中所引用的参考文献中所引用的那些。感光趣的是纯化的并从年轻奶牛或幼牛得到的牛胶原。纯化通常包括在各种介质如稀乙酸中分散或沉淀。在某些情况下，使用异体胶原来提高注射区中的致免疫反应，或可使用致免疫辅药。另外，本文适用的胶原也可从许多卖主商购。通常，此类商业来源包括其中蛋白组分包含约30％至约100％胶原且其余蛋白组分包含例如纤维根、白蛋白或此类蛋白的衍生物的蛋白物质。
在含水组合物中使用足量蛋白物质以提供约5至约100mg/ml，优选约5至约75mg/ml的胶原浓度。所用胶原的具体量根据所需的胶原组合物粘度选择，以使该组合物在中等压力下流动，但在用于患者的特定部位后不显著移动。优选使用足够的胶原以使组合物在20℃和15.8秒-1的剪切速率下粘度为约1,000至约50,000厘泊；更优选该组合物在20℃和15.8秒-1的剪切速率下粘度为约4,000至约20,000；甚至更优选该组合物在20℃和15.8秒-1的剪切速率下粘度为约5,000至约20,000厘泊。
在本文所述含水胶原组合物中还使用有效量的可配伍细胞毒性药物。通常，细胞毒性药物的有效量依药物种类而变且该量可容易地通过本文所述方法确定。具体而言，将在含水胶原组合物中使用不同量的可配伍细胞毒性药物但其他方面相似的组合物冷却并贮存不少于24小时以确定提供具有约45℃或45℃以下单一胶原转变温度的组合物所需要的最小可配伍细胞毒性药物量。
该可配伍细胞毒性药物可单独或组合使用，视药物性质、肿瘤和是否显示药物上的协同作用而定。优选该可配伍细胞毒性药物为氟尿嘧啶、甲氨蝶呤或其组合。在一个尤其优选的实施方案中，在该组合物中氟尿嘧啶的使用浓度大于约20mg/ml，更优选为大于约20mg/ml至约60mg/ml，而甲氨蝶呤的使用浓度为至少10mg/ml，更优选约10mg/ml至约60mg/ml。
该可配伍的细胞毒性药物可以通过非共价键合如配位、成盐、配位复合(Coordination complex)等与胶原连接或不连接，但任何键合不应导致药物的生理活性显著降低，也不应导致胶原纤维的交联。可配伍细胞毒性药物例如可通过引入允许药物与载体而不是胶原酶催断裂如水解的键而改性。
任意性可有可无地，可用各种技术来降低药物在注射入肿瘤损伤或周围组织时的迁移。例如，可配伍细胞毒性药物可与特定配位体如脂质、磷脂、肽、氨基酸、糖等偶联。这些改性取决于各种药物类型，药物在含水介质中溶解度的改变以及与胶原共价相互作用的提供。此外，可任意性可有可无地使用各种生理上可接受的填充剂或浓缩剂以提供药物和蛋白的相互作用，从而导致药物释放速率降低。示例性物质包括无机物质，如羟基磷灰石，有机物质如碳水化合物，例如葡聚糖、琼脂糖、甲基纤维素和纤维素。
本发明组合物还进一步包括与可配伍细胞毒性药物组合的其他药物以降低生理损伤并增加疗效。特别有益的是就生长和/或通道打开而言限制区域脉管系统的药物，如血管收缩药或拟交感神经药。这些药物可包括儿茶酚胺，如肾上腺素和去甲肾上腺素，双特戊酰肾上腺素，环硼肾上腺素，麦角生物碱，前列腺素，血管紧张素等。其他影响组织结构的药物包括可损伤基质的酶，如肽酶木瓜蛋白酶，木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、胶原酶和胰凝乳蛋白酶。或者可使用影响细胞渗透性的药物，如非离子洗涤剂，例如多乙氧基醚，两性霉素B，二甲亚砜和麻醉剂如普鲁卡因。在一个特别优选的实施方案中，将肾上腺素与胶原组合物一起使用并刚好在使用前加入组合物中。
除使用异体胶原外，可包括其他物质以提高致免疫反应，例如巨噬细胞、辅助T细胞等的增生和侵染。示例性辅药包括短小棒状杆菌菌苗(Corynebacterium parvum)，Bacillus Calmette-Guerin细胞壁或细胞壁骨架制剂，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)菌株等。例如参见Miyata等人的癌症研究(Cancer Res.)，43：4670-4675(1983)；Bier等人的耳鼻喉杂志(Arch.Otorhinolaryngol)，236：245-255(1982)和Mehanjhlin等人的Cancer Res.8：1311-1316(1978)，这些参考文献全部引入本文供参考。
为增加细胞毒性活性，可将各种辅助物质加入胶原中，如放射性丸，例如放射性核素锝或铱；辐射敏化剂，例如米索硝唑；修复抑制剂，例如甲基化黄嘌呤；生物还原剂(bioreductive agent)，它们仅在低氧(hypoxic)细胞中活化；免疫修饰剂，如干扰素，淋巴因子，如白细胞介素-2，肿瘤生长抑制剂，如肿瘤坏死因子，肿瘤生长因子-β等，和/或血管造影对照介质(angiographic contrast media)。
将胶原、细胞毒性药物和某些任意性可有可无的添加剂均匀分散于生理上可接受的含水介质如盐水、磷酸盐缓冲盐水、蒸馏水等中，形成胶原组合物。含水介质足以提供在温和压力下能流动的无定形分散体。通常，液态含水介质为整个组合物的至少90wt％，更通常为至少95wt％，通常不大于99.5wt％，以提供可流动混合物。该量随可配伍细胞毒性药物的性质、其他物质的存在与否等而变化。
任意性可有可无的添加剂也可因各种目的而包括在组合物中。这些添加剂绝大部分将赋予保护组合物稳定性、控制pH等的性能。示例性试剂包括磷酸盐和乙酸盐缓冲剂，羟苯甲酸甲酯或丙酯，聚乙二醇等。这些试剂通常的存在量低于总组合物的约2wt％，一般低于约1wt％，且各自在0-约1wt％间变化。
本文所述组合物可通过在无菌环境中混合包含胶原的蛋白物质、可配伍细胞毒性药物和生理上可接受的含水介质而制备。此时也可包括任意性可有可无的添加剂，但某些添加剂如血管收缩药或拟交感神经药因稳定性问题而优选在刚好使用前掺入组合物中。胶原以方便的形式提供，通常与至少一部分总的待用含水介质混合。该组合物充分易于加工，从而在混合时可得到均匀分散体。可配伍细胞毒性药物可在搅拌下加入胶原分散体中以确保药物的均匀分散。合适的话，任意性可有可无的物质可同时或依次加入。灭菌通常用无菌条件达到。
确保各种组分在混合物中均匀分散后，将混合物装入合适容器并密封。此时，该组合物在可见光范围内呈光学不透明，且在从30℃到70℃的DSC扫描上具有两个转变温度。第一转变温度在大约45℃，第二转变温度在大约55℃。
在一个实施方案中，然后将组合物冷却到约10℃或10℃以下的温度。冷却维持足够长的时间以使胶原纤维断裂，显然是由可配伍细胞毒性药物引起，从而成为更小的微丝，这由组合物中胶原的转变温度特征变化到约45℃或45℃以下的单一转变温度证实。另外，冷却时，胶原组合物转变成光学半透明的组合物。组合物转化为具有约45℃或45℃以下的单一胶原转变温度的组合物时，可任意性可有可无地将其温热至室温，同时维持所需的单一转变温度。
此时合适的话也可使用如上用于将胶原组合物转变成光学半透明组合物的其他实施方案。
应用性
本发明组合物可用于涉及固态异常肿瘤、细胞生长的各种肿瘤损伤或可能含有异常肿瘤细胞的相邻组织的化疗(细胞毒性)治疗。将该组合物注射入损伤处，例如肿瘤或损伤区(与该损伤相邻的组织)，或在其中肿瘤已切除的那些情形中，注射到与已除去的肿瘤相邻的组织处。该组合物对于注射来说可流动，但一旦注入组织中位置就稳定下来。也就是说，胶原一旦注射就能抵抗机械干扰且不显著迁移。注射后，细胞毒性药物释放到最接近的环境中，以防止药物明显向其他部位转移，因为在其他部位不需要其细胞毒性活性。
示例性肿瘤包括癌、肉瘤和黑瘤，如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑瘤、软组织肉瘤、腹腔神经丛角化病、卡波济氏肉瘤、皮肤恶性淋巴瘤、博温氏病、维耳姆斯氏瘤、肝细胞瘤、结肠(colorectals)癌、脑瘤、蕈样真菌病、何杰金氏淋巴瘤、真性红细胞增多、慢性粒细胞白血病、淋巴瘤、燕麦形细胞肉瘤等。肿瘤也可包括良性生长如尖锐湿疣(生殖器疣)。
本发明组合物给药于肿瘤以在肿瘤部位提供细胞毒性量的可配伍细胞毒性药物。给药于肿瘤部位的细胞毒性药物量优选为约0.01-100，更通常为约0.5-30mg/kg宿主，取决于药物性质，肿瘤大小及其他考虑。使用时，血管收缩药一般为可配伍细胞毒性药物的约1-约50wt％。对每一肿瘤中的每一药物，所用细胞毒性药物的具体量取决于因素如待治疗肿瘤类型和/或性质，待使用的可配伍细胞毒性药物，细胞毒性药物的相对迁移率及类似因素。这类因素是本领域众知的。
取决于因素如可配伍细胞毒性药物在肿瘤部位的寿命和肿瘤对该药物的响应，可一次或多次给予本发明组合物。给药可以用注射器、导管或其他允许向肿瘤引入可流动组合物的方便装置。给药可每三天一次，一周一次，或以更低频率，如两周或一月一次。
本发明给药方式的示例是包含氟尿嘧啶且具有约45℃或低于45℃的单一转变温度的组合物的给药。在一个优选实施方案中，胶原中氟尿嘧啶的浓度在大于约20mg/ml至约60mg/ml间变化。取决于损伤的大小，可以在一个或多个部位注射。直径约18-30刻度的针是方便的。对多次注射，可以使用具有预穿孔的模板。可配伍细胞毒性药物的剂量通常低于100mg/m2患者且优选为约0.01至约100mg/m2患者。
本发明方法对临床上相关的肿瘤或损伤具有特殊优点。该组合物对体积大于100mm3，更具体地说大于150mm3的肿瘤具有疗效。
还发现本发明方法可降低因给药引起的局部发炎。因此，局部或相邻组织不太可能受药物影响。此外，因药物从给药部位迁移的水平低，可对该部位给予更高的药物剂量，而对远离给药部位的正常组织或淋巴细胞无不利影响。
本发明方法与其他治疗形式结合具有益处。在给予含有可配伍细胞毒性药物的含水胶原组合物之前和/或之后可辐照损伤处。剂量率可在约20-250拉德/分间变化，通常为50-150拉德/分，取决于损伤、暴露期间、患者症状及类似因素。高温(热)可用作辅助治疗。治疗通常包括加热至约43℃(包括43℃)并保持约5-100分钟。
下列实施例用于说明要求保护的发明且不应认为是对它的限制。
除非另有说明，所有温度为摄氏度。此外，在这些实施例中，除非下文另有定义，所用缩写具有通常认可的意义：
顺铂＝顺氯氨铂(II)
cps＝厘泊
DSC＝差示扫描量热法
氟尿嘧啶＝5-氟尿嘧啶〔5-氟-2，4-(1H，3H)-嘧啶二酮〕〔或5FU〕
g＝克
M＝摩尔浓度
mg＝毫克
ml＝毫升
mm＝毫米
OD＝光密度
RT＝室温
实施例
在以下实施例中，实施例1-3示出含有各种细胞毒性药物的含水胶原组合物对胶原转变温度的影响，该组合物在室温(RT)下保持或在低于10℃下冷藏。
实施例4示出了包含胶原和氟尿嘧啶(33.3mg/ml)的含水胶原组合物因在三个不同温度下贮存而对由吸光度测得的光学不透明性的影响，而实施例5测量不同浓度氟尿嘧啶对吸光度的影响。
图6说明另一种对含有甲氨蝶呤的含水胶原组合物获得光学透明性的方法。
图7和8说明包含胶原和不同pH的不同缓冲剂(实施例7)或不同添加剂(实施例8)的含水胶原组合物对由吸光度测得的光学不透明性的影响。
实施例9说明本发明组合物在患者的注射部位具有增加的药物保持能力。
实施例1-包含氟尿嘧啶的含水胶原组合物对胶原转变温度的影响
通过在无菌条件下混合必需量的各组分而制备含水胶原组合物，以提供包含6.5wt％胶原、0.1M磷酸钠和0.045M氯化钠的含水胶原组合物。所得组合物的DSC扫描通过将等份量的该组合物加入样品保持器(DSC皿)中，气密密封该样品保持器，然后将保持器放入差示扫描量热仪(Model No.DSC10，购自TAInstruments，New Castle，Delaware，USA)中而进行。该量热仪通过记录该组合物吸收或释放过量于基线的热的温度而测量出与胶原组合物相变有关的转变温度。
该组合物的DSC扫描以10℃/分钟的速率在30℃至70℃内进行，结果示于图1。该图说明该含水胶原组合物具有两个转变温度，一个在约44.2℃，另一个在约53.3℃。
如上所述制备另外两个含水组合物，不同的是将氟尿嘧啶掺入各组合物中且所得组合物包含胶原(2.2wt％)、氟尿嘧啶(33.3mg/ml)、0.033M磷酸钠和0.015M氯化钠。该组合物通过在无菌条件下混合1体积的包含6.5wt％胶原、0.1M磷酸钠和0.045M氯化钠的含水胶原组合物与2体积的氟尿嘧啶溶液(50mg/ml)直至均匀而配制，该混合通过在环境条件下重复循环通过一个静态混合器并磁力搅拌而进行。配制后，两种组合物均呈光学不透明。
然后将第一种组合物贮存于室温，而第二种组合物在约2℃至约8℃温度下冷藏贮存。贮存不少于24小时后，第一种组合物仍呈光学不透明，而第二种组合物变为光学半透明。然后以上述方式进行各样品的DSC扫描。这些扫描结果分别示于图2和图3。
具体而言，图2说明包含氟尿嘧啶且贮存于室温的含水胶原组合物具有两个胶原转变温度，第一个在约42℃，第二个在约45-46℃以肩峰出现。相反，图3说明在冷藏下贮存相同时间的相同含水胶原组合物具有约42.5℃的单一胶原转变温度。
除以上以外，比较在室温和2-8℃下贮存的包含氟尿嘧啶的含水胶原组合物在20℃的粘度以及这些组合物的吸光度，吸光度使用波长410nm的光通过光程长度1mm的微比色杯(microcuvet)测量。分析结果示于下表I中：
表I胶原组合物贮存温度 粘度(cps，20℃) 吸光度(410nm) RT 6478cps 0.684OD 2-8℃ 7873cps 0.009OD
根据该实施例的结果，氟尿嘧啶是一种可配伍细胞毒性药物。
实施例2-包含甲氨蝶呤的含水胶原组合物对胶原转变温度的影响
通过在无菌条件下混合必需量的各种组分而制备含水胶原组合物，以提供包含6.5wt％胶原、0.1M磷酸钠和0.045M氯化钠的含水胶原组合物。所得组合物的DSC扫描通过将等份量的该组合物加入样品保持器(DSC皿)中，气密密封该样品保持器，然后将保持器放入差示扫描量热仪(Model No.DSC 10，购自TAInstruments，New Castle，Delaware，USA)中进行。该量热仪通过记录该组合物吸收或释放过量于基线的热的温度而测量出与胶原组合物相变有关的转变温度。
该组合物的DSC扫描以10℃/分钟的速率在30℃至80℃内进行，结果示于图4。该图说明该含水胶原组合物具有两个转变温度，一个在43℃，另一个在约53℃。
如上所述制备另外两个含水组合物，不同的是将甲氨蝶呤掺入各组合物中且所得组合物包含胶原(2.2wt％)，甲氨蝶呤(16.7mg/ml)，0.033M磷酸钠和0.015M氯化钠。该组合物通过在无菌条件下在环境条件下混合1体积的包含6.5wt％胶原、0.1M磷酸钠和0.045M氯化钠的含水胶原组合物与2体积的甲氨蝶呤溶液直至均匀而配制。混合通过在两个由混合接管连接的注射器间反复转移而进行。第一组合物在室温贮存，而第二组合物在约2℃至约8℃温度下冷藏贮存。贮存约1个月后，第一组合物仍呈光学不透明，而第二组合物变为光学半透明。然后以上述方式进行各样品的DSC扫描。这些扫描结果分别示于图5和图6。
具体而言，图5说明包含甲氨蝶呤且贮存于室温的含水胶原组合物具有两个胶原转变温度，第一个在约42℃，而第二个在约52.4℃。相反，图6说明在冷藏下贮存相同时间的相同含水胶原组合物具有约43℃的单一胶原转变温度。
根据该实施例的结果，甲氨蝶呤是一种可配伍细胞毒性药物。
实施例3-包含顺铂的含水胶原组合物对胶原转变温度的影响
如上所述制备一种含水胶原组合物，不同的是将顺铂掺入该组合物中且所得组合物含有胶原(2.2wt％)，顺铂(4mg/ml)，0.033M磷酸钠和0.015M氯化钠。该组合物在室温下贮存并如上所述在0、1、2、4和8小时进行该组合物等份样的DSC扫描。这些扫描的结果示于图7A(0小时扫描)、7B(1小时扫描)、7C(2小时扫描)、7D(4小时扫描)和7E(8小时扫描)。
具体而言，这些图说明约43℃和53℃的初始转变温度最终随时间消失，在约61℃出现主转变温度峰值，仅在43℃保留一个次级峰。这种转变温度随时间的增加被认为与顺铂与含水胶原组合物中的胶原交联(即共价键合)有关。
根据该实施例的结果，顺铂不是可配伍细胞毒性药物。
实施例1-3的结果说明某些但不是所有细胞毒性药物可与胶原配伍并允许含水胶原组合物具有45℃或45℃以下的单一转变温度。细胞毒性药物是否可在胶原组合物中配伍可由该组合物在室温保持时在不同时间的标准DSC扫描确定。
另外，可配伍性可由包含候选细胞毒性药物的胶原组合物产生约45℃或45℃以下的单一转变温度来确定。应理解候选细胞毒性药物是那些要测定其在本发明方法和组合物中的可配伍性的药物。
实施例4-贮存温度对包含氟尿嘧啶的含水胶原组合物的光学不透明性的影响
通过在无菌条件下混合必需量的各组分制备三种相同的含水胶原组合物，所得含水胶原组合物包含胶原(2.2wt％)、氟尿嘧啶(33.3mg/ml)、0.033M磷酸钠和0.015M氯化钠。将等份量(0.5ml)的各组合物在不同温度下置于1mm光程长度的微比色杯中10分钟，其中第一等份样在约12℃下贮存，第二等份样在约8℃下贮存，而第三等份样在约4℃下贮存。然后通过用微比色杯测定对光线(410nm)的吸收度以30秒间隔测量各样品的光学不透明度。在各种情况下较低吸光度对应于在410nm的较高光学透明性。
该实施例的结果如图8所示，该图说明含水胶原组合物在4℃或8℃下贮存导致样品吸光度随贮存时间而显著降低，表明样品的光学透明度增加。相反，含水胶原组合物在12℃下贮存并未导致样品吸光度的显著降低。这些结果表明对于包含氟尿嘧啶的含水胶原组合物，在降低的温度下贮存要求该组合物在约10℃或10℃以下，优选在约8℃或8℃以下贮存，以获得光学透明度。
实施例5-细胞毒性药物浓度对含水胶原组合物光学不透明性的影响
如上所述制备三种相同的含水胶原组合物，不同的是将掺入组合物中的氟尿嘧啶量分别变为16.65mg/ml，22.2mg/ml和33.3mg/ml。所得组合物以等份样(0.5ml)在1mm光程长度的微比色杯中于4℃贮存10分钟并通过该微比色杯测定对光线(410nm)的吸收度而以30秒间隔测量各样品的光学不透明度。在各种情况下吸光度越低对应于在410nm的光学透明度越高。
本实施例的结果示于图9，该图说明含氟尿嘧啶(33.3mg/ml)的胶原组合物与含22.2mg/ml或16.65mg/ml氟尿嘧啶的胶原组合物相比具有明显更低的吸光度。这些结果表明对于包含氟尿嘧啶的含水胶原组合物，需要有效量的氟尿嘧啶来获得光学透明性。
进行第二个研究以确定使不透明含水胶原组合物澄清所需的氟尿嘧啶量。具体而言，配制含水胶原组合物使之含有胶原(21.7mg/ml)、0.033M磷酸盐缓冲液和可变量的氟尿嘧啶。然后将各组合物在约2℃至8℃下贮存17天并周期性测量该组合物的光学外观。分析结果示于下表II：
表II FU浓度(mg/ml) 外观(开始时) 外观(3小时) 外观(24小时) 外观 (10天) 外观 (17天) 33.3 不透明 透明 透明 透明 透明 20.0 不透明 不透明 不透明 较透明 较透明 6.7 不透明 不透明 不透明 不透明 不透明 0 不透明 不透明 不透明 不透明 不透明
上述数据说明在20mg/ml下，氟尿嘧啶开始对不透明胶原组合物具有一定澄清效果。因此，在一个优选实施方案中，氟尿嘧啶浓度大于约20mg/ml。
实施例6-另一种在含水胶原组合物中获得光学透明度的方法
本实施例的目的是说明在本些情况下对某些可配伍细胞毒性药物可使用另一方法来获得含水胶原组合物的光学透明度。具体而言，在本实施例中，改变胶原组合物中甲氨蝶呤的浓度并将胶原组合物在2℃-8℃或室温下贮存1天和3天。在第3天的结果与1天后发现的结果相同且因此下表III仅示出1天后的结果。
表III 甲氨蝶呤浓度在RT下贮存1天时的 光学性能在2-8℃下贮存1 天时的光学性能 1.0mg/ml 白黄色，不透明 白黄色，不透明 5.0mg/ml 浅黄色，不透明 浅黄色，不透明 10.0mg/ml 浅黄色，不透明浅黄色，轻微不透明 16.7mg/ml 黄色，不透明 黄色，半透明 33.3mg/ml 深黄色，透明 深黄色，透明
以上结果表明对甲氨蝶呤，冷藏和甲氨蝶呤的高浓度均能有效影响光学透明度。然而，对于10.0mg/ml和16.7mg/ml的甲氨蝶蛉浓度，冷藏似乎提供了增加的光学透明性。
下列实施例7和8的目的是说明澄清现象与有效量的可配伍细胞毒性药物的存在有关而与组合物中的其他组分无关。具体而言，因上述实施例1的氟尿嘧啶制剂的pH为9.3(相对于加入氟尿嘧啶前的pH7.3)，进行实施例7以确定pH是否对不含细胞毒性药物的光学不透明胶原组合物具有明显的澄清作用。
因为将氟尿嘧啶加入上述实施例2的胶原组合物中改变了磷酸盐缓冲液和氯化钠的浓度，所以进行实施例8以确定氟尿嘧啶以外的不同组分的存在是否对光学不透明胶原组合物具有明显的澄清作用。
实施例7-缓冲液和pH对光学不透明胶原组合物澄清的影响
第一个研究通过制备第一含水胶原组合物而进行，该组合物配制成含有6.5wt％胶原、0.1M磷酸钠和0.045M氯化钠且pH在配制后为7.3。配制第二含水胶原组合物，使之含有6.5wt％胶原、0.1M硼酸钠和0.045M氯化钠且pH在配制后为9.1。然后将两种组合物以等分样(0.5ml)在1mm光程长度的微比色杯中于约2-8℃贮存10分钟，通过用微比色杯测定对光线(410nm)的吸收度以15秒的间隔测量各样品的光学不透明度。在各种情况下吸光度越低对应于在410nm下的光学透明度越高。
该分析的结果示于图10中，该图说明没有一种组合物在贮存过程中显示出吸光度的显著改变，这说明pH和缓冲液均对不含细胞毒性药物的光学不透明胶原组合物没有显著澄清作用。
第二个研究通过制备具有0.033M磷酸钾缓冲液和21.7g胶原的胶原组合物而进行。通过按需要加入HCl或NaOH而调节溶液的pH，以将组合物的pH改变为约5、7、8和9。在室温或2-8℃下贮存组合物。在贮存1天和11天后评价这些组合物的光学外观。该评价的结果示于下表IV：
表IV组合物的pH室温贮存1天后的外观2-8℃下贮存1天后的外观室温贮存11天后的外观2-8℃贮存11天后的外观 4.87 乳白色 乳白色 乳白色 乳白色 6.98不透明白色 不透明白色不透明白色 不透明白色 8.07不透明白色 不透明白色不透明白色 不透明白色 8.90不透明白色 不透明白色不透明白色 不透明白色
上表IV结果表明pH对光学不透明胶原组合物的澄清没有显著影响，但在pH5时胶原组合物与具有中性或碱性pH的胶原组合物相比较为透明。然而，在室温或2-8℃下贮存期间未观察到任何样品的澄清。
实施例8-添加剂对光学不透明胶原组合物的澄清的影响
使用不同添加剂测定添加剂对不透明胶原组合物的澄清的影响。具体而言，向包含6.5wt％胶原，0.25M添加剂和足量硼酸钠的单独组合物中加入添加剂脲、蔗糖、氯化钠、甘油和氟尿嘧啶，使pH为9.1。
然后将各组合物在约2-8℃下以等份样(0.5ml)在1mm光程长度的微比色杯中贮存10分钟并通过用该微比色杯测定对光线(410nm)的吸收度以15秒的间隔测量各样品的光学不透明度。在各种情况下吸光度越低对应于在410nm下的光学透明度越高。该分析的结果示于图11中，该图说明在约2-8℃下贮存过程中仅氟尿嘧啶对胶原组合物的澄清具有显著影响。
实施例9-在注射部位对可配伍细胞毒性药物的增加保持能力
按本发明制备的光学半透明氟尿嘧啶/胶原组合物在注射部位的保持能力与光学不透明氟尿嘧啶组合物相比较。
光学半透明氟尿嘧啶/胶原组合物的制备
将含有胶原(22.4mg/ml)、氟尿嘧啶(33.3mg/ml)0.033M磷酸钠和0.015M氯化钠且pH调至约9.3的含水胶原凝胶组合物在注射器(标称装填(nominal fill)0.9ml)中于约2-8℃温度下贮存不少于24小时以提供光学半透明组合物。
将含肾上腺素(1mg/ml)、乙二胺四乙酸二钠(0.5mg/ml)、偏亚硫酸氢钠(1.5mg/ml)和氯化钠(8mg/ml)的水溶液贮存在第二个注射器(标称装填0.1ml)中。
通过将氟尿嘧啶凝胶注射器与肾上腺素溶液注射器相连并将其内容物通过连接这两个注射器的混合接头由注射器-注射器转移进行来回转移直至组合物均匀而制备出用于注射到损伤处的最终凝胶。所得光学半透明凝胶制剂含有氟尿嘧啶(30mg/ml)、肾上腺素(0.1mg/ml)、胶原(20mg/ml)、0.03M磷酸钠，氯化钠(1.6mg/ml)，乙二胺四乙酸二钠(0.05mg/ml)、偏亚硫酸氢钠(0.15mg/ml)且pH为约9。在制备后1小时内使用该凝胶。
光学不透明氟尿嘧啶/胶原组合物的制备
将含有胶原(65mg/g)、0.1M磷酸钠和0.045M氯化钠且pH调至约7.2的含水胶原凝胶组合物贮存在第一容器(在预装填的注射器中为0.3ml)中且这些组合物在贮存前后呈光学不透明。
将一种包含肾上腺素(1mg/ml)、乙二胺四乙酸二钠(0.5mg/ml)、偏亚硫酸氢钠(1.5mg/ml)和氯化钠(8mg/ml)的水溶液贮存在第二容器中。
将含氟尿嘧啶(50mg/ml)的水溶液贮存于第三容器中。
通过混合三个容器的内容物直至组合物均匀来制备用于注射于损伤处的最终凝胶。所得光学不透明凝胶制剂含氟尿嘧啶(30mg/ml)、肾上腺素(0.1mg/ml)、胶原(20mg/ml)、0.03M磷酸钠、氯化钠(1.6mg/ml)、乙二胺四乙酸二钠(0.05mg/ml)、偏亚硫酸氢钠(0.15mg/ml)且pH为约9。该光学不透明凝胶组合物在制备后1小时内使用。
保持能力研究
然后使用在小鼠皮上植入并生长的同质纤维肉瘤(RIF-1)评价上面制备的光学不透明和光学半透明胶原组合物的局部保持能力。在该评价中，肿瘤细胞从胁腹皮下注射，所得肿瘤生长至可见尺寸(一般约0.5cm3)，然后通过瘤内注射一种或另一种含3H标记的氟尿嘧啶的上述胶原组合物治疗该动物。在0-24小时的不同时间段切除肿瘤，消化组织并用闪烁计数法测量组织中的3H量。计算肿瘤含量/时间曲线下的面积(AUC)并用作组织对药物的累积暴露的度量。
本研究的结果示于图12中，该图图示说明标记的氟尿嘧啶在注射部位随时间的保持能力。具体而言，Y轴反映标记的氟尿嘧啶在肿瘤中的保持能力(为给药剂量的百分数)，而X轴反映从初始给药开始的时间。该图的结果说明光学透明组合物的肿瘤AUC比光学不透明组合物高30％-50％。在该研究中AUC的相对标准误差为25-35％。因此，这些结果表明含有与光学不透明组合物相同浓度的氟尿嘧啶的光学透明胶原凝胶组合物比光学不透明组合物对该细胞毒性药物在注射部位提供更好的保持能力。
图12还说明因对小鼠腹膜内给予氟尿嘧啶水溶液而产生的肿瘤AUC。显而易见的是，这种给药途径明显不如使用光学不透明或光学半透明组合物合适。
这些结果还可理解为与光学半透明胶原凝胶组合物相比光学透明胶原组合物中的氟尿嘧啶效力增加，而因氟尿嘧啶从注射部位迁移的相应副作用较小。