一种中药组合物在制备降低水通道蛋白-4表达的药物中的应用 【技术领域】
本发明属医药领域，具体涉及一种已知的中药组合物在制备降低水通道蛋白-4表达的药物中的应用。
背景技术
水通道蛋白-4(AQP4)是中枢神经系统最为丰富的水通道蛋白，覆盖超过95％的脑毛细血管表面，在血脑屏障和脑-脑脊液屏障的星形神经胶质细胞高度表达，经由该通道的水双向转运，对维持脑内水平衡至关重要。Venero等【Venero J L，VizueteM L，Machado A，et al Aquaporins in the central nervous systern[J].Prog Neurobiol，2001，63(3)：121-130.】报道AQP-4mRNA在侧脑室及中脑导水管的室管膜细胞、脉络从上皮、软脑膜、下丘脑、室上核、海马、齿状回和小脑浦肯野细胞均有显著表达。石向群等【石向群，杨金开，等.大鼠脑缺血在灌注损伤过程中水通道蛋白-4表达水平的变化[J].国外医学脑血管疾病分册，2004，12(2)：122-125.】发现，AQP4主要分布于面向毛细血管内皮细胞、软脑膜和脑室室管膜侧胶质细胞的细胞膜或足突上，呈明显的极性现象，提示AQP4分布与脑内水分转运具有同向性。而分布于脉络丛上皮细胞和脑室管膜上皮细胞的AQP4则参与脑脊液的形成和重吸收。AQP4在脑内分布的多区域以及它的主要功能是参与了脑内水的代谢。目前认为AQP4的调节方式有：第一，AQP4的短时程调节：通过蛋白质磷酸化；第二，水通道蛋白与其膜描定蛋白a-syntrophin的关系：AQP4在胶质细胞上的极性表达主要依赖于AQP4与a-syntrophin之间的相互作用，将a-syntrophin基因敲除的大鼠进行免疫细胞化学染色发现，血管周围的星形胶质细胞AQP4表达明显减少；第三，低氧对AQP4的调节：星形胶质细胞培养发现，低氧会下调AQP4mRNA蛋白质表达，再给氧后，水通道蛋白水平迅速恢复；第四，渗透压对AQP4的调节；颅内注入甘露醇可以增加大鼠皮质AQP4的表达。可见，AQP4在脑内分布，广泛参与脑内水代谢、脑脊液的生成和重吸收、调节渗透压、维持和调节细胞K代谢，发挥着极其重要的功能。
脑水肿是多种脑部疾病发展到一定阶段所共同经历的一个病理过程，往往伴随着脑肿瘤、脑缺血、脑出血和颅脑损伤等疾病发生。根据发生机制不同，脑水肿可分为细胞毒性脑水肿、血管性脑水肿、间质性脑水肿和缺血性脑水肿，其中主要的为细胞毒性和血管源性脑水肿。多种脑部病变、如脑外伤、脑出血、脑肿瘤、脑缺血等，都可引起脑水肿。而不同的脑部病变，其引发脑水肿的机制也各不相同；相同的是，AQP4在这些病理过程中都起着重要作用。
本申请人已经申请了专利号为00131558.7名称为“一种治疗中风的药物及其生产方法”、授权公告日为2003年6月11日、公开号为CN1111054C。该发明公开了一种治疗中风的中药制剂，其主要活性原料的组份和重量百分含量为：红参6.05-15.8、三七8.95-10.08、当归5.12-8.34；鸡血藤7.76-8.97、丹参8.01-11.13、红花5.18-8.84；银杏叶8.87-10.11、山楂7.76-8.55、菊花5.78-6.89、石决明5.80-6.53、何首乌7.77-8.84、石菖蒲5.03-5.74、葛根7.56-8.65。该药物是将上述中药原料利用醇提、水提等现代制药生产工艺制成胶囊剂或颗粒剂、口服液、片剂。该药物具有益气活血、化瘀通络、熄风豁痰之功效，能抑制、消除动脉粥样硬化，抑制高胆固醇与高血脂、通血脉溶血栓、抗脑血管老化等功效，主治缺血性中风(脑梗塞)、恢复期中经络之气虚血瘀证、风痰瘀血闭阻脉络证，也可用于缺血性中风急性期之早期，疗效显著，治疗病谱宽，且标本兼治。其药品名称为“脑脉泰”，由于其疗效确切，至上市以来，赢得了广大患者的信赖。
近年来，本申请人继续挖掘上述组合物的其他功效，功夫不负有心人，经过近年的临床与试验研究，本申请人发现上述中药组合物还有降低水通道蛋白-4表达的作用，而且到目前为止，还未发现上述组合物降低水通道蛋白表达的报道。虽然有上述组合物治疗脑水肿的报道，但脑水肿的治疗是结果，并未详细说明是通过哪一个或几个环节或靶点的作用而使脑水肿得到治疗，亦未见上述组合物降低水通道蛋白-4的表达而治疗脑水肿的报道。
此外，水通道蛋白-4还在消化道正常胃黏膜组织中表达。“水通道蛋白-4在大肠癌组织中的表达”(参见唐会峰等的“水通道蛋白-4在大肠癌组织中的表达”，南京医科大学学报(自然科学版)，2007年11月第27卷第11期)表明正常组织中水通道蛋白4低表达或不表达，而肿瘤组织较癌旁表达明显增加。“水通道蛋白与耳鼻咽喉科疾病”(参见高晓葳等的“水通道蛋白与耳鼻咽喉科疾病”，医学综述2007年11月第13卷第22期)表明水通道蛋白-4与耳鼻咽喉科疾病也有关系。本申请人通过潜心研究，发现所述组合物还有降低水通道蛋白-4表达的作用，从而可用于治疗一些由水通道蛋白-4表达增加所引起的疾病，成为一种新的治疗水通道蛋白-4表达增加所致疾病的靶向药物。
有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种中药组合物在制备降低水通道蛋白-4表达药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种中药组合物在制备降低水通道蛋白-4表达的药物中地应用，该药物的主要活性原料的组份和重量百分含量如下：红参6.05～15.8、三七8.95～10.08、当归5.12～8.34；鸡血藤7.76～8.97、丹参8.01～11.13、红花5.18～8.84；银杏叶8.87～10.11、山楂7.76～8.55、菊花5.78～6.89、石决明5.80～6.53、何首乌7.77～8.84、石菖蒲5.03～5.74、葛根7.56～8.65。
本发明所述的中药组合物在制备水通道蛋白-4表达增加所致疾病的药物中的应用。
本发明所述的中药组合物在制备治疗水通道蛋白-4表达增加所致脑部病变疾病的药物中的应用。
本发明所述的中药组合物在制备制备治疗水通道蛋白-4表达增加所致脑外伤、脑出血、脑肿瘤或脑缺血药物中的应用。
本发明所述的中药组合物在制备治疗水通道蛋白-4表达增加所致耳鼻咽喉科疾病药物中的应用。
本发明所述的中药组合物在制备治疗水通道蛋白-4表达增加所致大肠癌疾病药物中的应用。
本发明中，所述药物的剂型为任何一种药剂学上所说的剂型，优选胶囊剂、颗粒剂、口服液或片剂。所述药物的制备方法可参见本申请人已经申请了专利号为00131558.7、名称为“一种治疗中风的药物及其生产方法”、授权公告日为2003年6月11日、公开号为CN1111054C的发明专利。
存在于细胞膜上的AQP4，是对水有高度选择性的细胞膜转运蛋白，主要分布在中枢神经系统，中脑导水管的室管膜细胞、大脑皮质和脑干周围的胶质细胞和上皮细胞上，是胶质细胞与脑脊液以及血管间的水调节和转运的重要成分，与血脑屏障的开放存在明显的相关性，在脑水肿的形成过程中发挥着极为重要的作用。实验表明，在正常大鼠脑内仅有低水平AQP4蛋白表达，但在创伤、脑缺血缺氧时AQP4开放，致使大量水分进入细胞内，脑水肿加重。本发明人发现，本发明所述药物组合物可降低AQP4的表达，从而可用于治疗一些由水通道蛋白-4表达增加所引起的疾病，成为一种新的治疗水通道蛋白-4表达增加所致疾病的靶向药物。
【附图说明】
图1-A为Sham组对MCAO模型大鼠AQP4蛋白表达的影响；
图1-B为脑脉泰大剂量组对MCAO模型大鼠AQP4蛋白表达的影响；
图1-C为脑脉泰中剂量组对MCAO模型大鼠AQP4蛋白表达的影响；
图1-D为脑脉泰小剂量组对MCAO模型大鼠AQP4蛋白表达的影响；
图1-E为MCAO组对MCAO模型大鼠AQP4蛋白表达的影响；
图2为Sham组对脑缺血再灌注大鼠超微结构的影响；
图3为MCAO组对脑缺血再灌注大鼠超微结构的影响；
图4为脑脉泰大剂量对脑缺血再灌注大鼠超微结构的影响。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。
实施例1
称取以下中药成分(单位：g)：
红参6 三七9.0 当归5.5 鸡血藤7.8 丹参8.5
红花5.5 银杏叶9.0 山楂7.8 菊花6.0 石决明5.9
何首乌7.5 石菖蒲5.1 葛根7.6
其生产步骤为：
1、取红参4g，三七6g，粉碎，过80目筛，灭菌得中间产品A；
2、剩余的红参2g，三七3g与银杏叶9.0g，丹参8.5g用4倍量70％的乙醇回流提取2小时，醇提液回收乙醇得中间产品B；
3、醇提部分的药渣与当归5.5g、鸡血藤7.8g、红花5.5g、山楂7.8g、菊花6.0g、石决明5.9g、何首乌7.5g、石菖蒲5.1g、葛根7.6g等九味药材一起加5倍量水提取两次，每次2小时，得提取液，与B部分混合，浓缩，得流浸膏，喷雾干燥，得中间产品干膏C；
4、取中间产品A、C，混合制粒，用胶囊分装，再用铝箔包装得成品，产品名称为“三金脑脉泰胶囊”。
实施例2
称取以下中药成分(单位：g)：
红参8 三七10 当归6 鸡血藤8.2 丹参9.2
红花5.8 银杏叶9.5 山楂8.1 菊花6.6 石决明6.6
何首乌8.0 石菖蒲5.5 葛根7.9
其生产步骤为：
1、取全部红参8g，三七10g与银杏叶9.5g，丹参9.2g用4.5倍量60％的乙醇回流提取2小时，醇提液回收乙醇得中间产品B1；
2、醇提部分的药渣与当归6g、鸡血藤8.2g、红花5.8g、山楂8.1g、菊花6.6g、石决明6.6g、何首乌8.0g、石菖蒲5.5g、葛根7.9g等九味药材一起加8倍量水提取两次，每次2小时，得提取液，与B1部分混合，浓缩，得相对密度为1.05～1.20/55-60℃的流浸膏C1；
3、取中间产品流浸膏C1，与适量辅料混合制粒，分装，包装得成品，产品名称为“三金脑脉泰颗粒”。
实施例3
称取以下中药成分(单位：g)：
红参10 三七8 当归7 鸡血藤8.5 丹参10.2
红花6.5 银杏叶10 山楂8.2 菊花6.5 石决明6.2
何首乌8.5 石菖蒲5.3 葛根8.3
其生产步骤为：
1、取全部红参10g，三七8g与银杏叶10g，丹参10.2g用7倍量50％的乙醇回流提取2～3小时，醇提液回收乙醇得中间产品B2；
2、醇提部分的药渣与当归7g、鸡血藤8.5g、红花6.5g、山楂8.2g、菊花6.5g、石决明6.2g、何首乌8.5g、石菖蒲5.3g、葛根8.3g等九味药材一起加8倍量水提取两次，每次2小时，得提取液，与B2部分混合，浓缩，得相对密度为1.05～1.20/55-60℃的流浸膏C2；
3、取中间产品流浸膏C2，与适量糖浆或蜂蜜混匀，灭菌，分装，再灭菌，包装得成品，产品名称为“三金脑脉泰口服液”。
实施例4
称取以下中药成分(单位：g)：
红参8.0 三七9.0 当归5.8 鸡血藤8.0 丹参8.8
红花5.6 银杏叶9.2 山楂8.1 菊花6.2 石决明6.3
何首乌7.8 石菖蒲5.5 葛根7.8
其生产步骤为：
1、取红参5g，三七5g，粉碎，过80目筛，灭菌得中间产品A3；
2、剩余的红参3g，三七4g与银杏叶9.2g，丹参8.8g用5倍量70％的乙醇回流提取2-3小时，醇提液回收乙醇得中间产品B3；
3、醇提部分的药渣与当归5.8g、鸡血藤8.0g、红花5.6g、山楂8.1g、菊花6.2g、石决明6.3g、何首乌7.8g、石菖蒲5.5g、葛根7.8g等九味药材一起加5倍量水提取两次，每次2小时，得提取液，与B3部分混合，浓缩，得流浸膏，喷雾干燥，得中间产品干膏C3；
4、取中间产品A3、C3，混合制粒，压片，包装，得成品，产品名称为“三金脑脉泰片”。
下面本申请人将通过具体的药效学试验对该中药组合物具有降低水通道蛋白-4表达的用途进行说明。
[试验例1]脑脉泰对局灶性脑缺血大鼠脑含水量、EB含量和AQP-4阳性细胞率的影响
(一)试验材料和方法
1、材料
(1)药品与试剂
脑脉泰胶囊 桂林三金药业股份有限公司，批号：060801，规格：0.5g/粒，含生药材1.865g。
尼莫地平 山西亚宝药业集团股份有限公司，批号：国药准字H14022821号，规格：20mg/片。
AQP4免疫组化染色兔抗AQP4多克隆抗体及免疫组化二抗染色试剂盒(正常山羊血清，SABC，生物素化山羊抗兔IgG，抗原修复液)及DAB显色试剂盒均购于武汉博士德公司。
(2)动物
Sprague Dawley大鼠，体重(280±20)g，清洁级，购自中南大学实验动物学部。
(3)主要仪器设备
电子天平(型号：JY3002型)，高速低温离心机(日本生产，型号：SCR20BC)，LKB公司8800型超薄切片机，日立H-600透射电镜。Nikon ECLIPSE E600全自动图像分析系统。
2、方法
(1)分组
60只SD大鼠，随机分成6组(n＝10)：假手术组(sham-operation)、脑缺血再灌注模型组(middle cerebral artery occlusion，MCAO)、脑脉泰(2.24、1.12、0.56g·kg-1)组((MCAO+NaoMaiTai)和尼莫地平组(MCAO+nimodipine 10mg·kg-1)。脑缺血再灌注模型脑脉泰组和尼莫地平组：大鼠MCAO前五天，每天两次灌胃给于脑脉泰2.24、1.12、0.56g·kg-1体重；尼莫地平组每天两次灌胃给于尼莫地平10mg·kg-1体重。大脑中动脉栓塞(MCAO)90分钟，再灌注24小时。
(2)局灶性脑缺血再灌注模型制作
按Longa法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型：大鼠称重，腹腔注射体积分数10％水合氯醛3ml·kg-1麻醉，做颈部正中切口，暴露右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，在颈外动脉距其始端约2mm处做一小切口，用一端烤成小球形的3-0尼龙线小球端经切口处插入颈外动脉，再经颈内动脉至大脑中动脉始端，栓塞大脑中动脉，造成局灶性脑缺血：大鼠脑缺血90分钟后，拔出尼龙线，恢复脑组织供血。假手术组大鼠在尼龙线小球端插入至大脑中动脉始端后，立即拔出：实验过程中维持直肠温度在37℃。
(3)组织处理
于脑缺血再灌注24h后，用10％水合氯醛麻醉大鼠，打开胸腔，于右心耳部剪一小口，从左心室插入导管至主动脉，向主动脉内缓慢注入37℃肝素化的生理盐水200ml，至右心房流出液变清亮，然后注入4％的多聚甲醛磷酸盐缓冲液350ml，灌流固定30min后，断头取脑，放入相同固定液中固定72h。经梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，以视交叉和其后4mm处冠状切片，片厚4μm。载玻片经DEPC处理。AQP4免疫组化染色兔抗AQP4多克隆抗体及生物素化羊抗兔IgG及DAB显色剂均购于武汉博士德公司。采用SABC法染色，严格按试剂盒说明书进行操作。根据大鼠脑缺血半暗带的定位方法，将大脑中动脉阻塞的同侧额顶叶皮质上部界定为半暗带的等值区。阳性为棕黄色或棕褐色，呈颗粒状，背景呈紫蓝色。AQP4阳性物质位于胞质，采用Nikon ECLIPSE E600全自动图像分析系统，在400倍的视野下，随机选取5个视野，计数AQP4免疫反应阳性细胞数。
(4)脑组织EB含量测定
各组动物均于处死前15min经舌下静脉注射2％Evance蓝染料2ml/kg。在深麻下开胸，由左心室插管至主动脉，剪开右心房，10min内经插管灌注生理盐水150ml。断头后取部分脑组织，精确称湿重，投入中号试管，加3ml甲酰胺，加盖于37℃水浴箱孵育48h后摇匀，3000r/min离心15min，取上清液在721紫外分光光度计上测光密度(λ：632nm)。按公式计算脑组织EB含量：脑组织EB含量(μg/g脑组织)＝Ax甲酰胺量(ml)÷脑湿重(g)。式中A为根据标准曲线回归方程求得的样品EB含量。
(5)脑组织含水量的测定
脑组织取材同上。取材完毕，将脑组织放在烘烤过的玻片上，精确称湿重，放入烤箱中烘干(110℃，24h)，取出并称干重。
脑组织含水量(％)＝(1-脑组织干重/脑组织湿重)×100％
(6)电镜标本制作及观察
样品经2％多聚甲醛+2.5％戊二醛前固定，1％锇酸后固定，0.1M PBS漂洗，丙酮各级脱水(50，70，90，100％)，Epon812环氧树脂包埋剂包埋与100％丙酮1∶1比例浸泡，包埋剂浸泡包埋，LKB公司11800型修块机修块定位，LKB公司8800型超薄切片机切片，醋酸铀、硝酸铅双重染色，日立H-600透射电镜观察。
3、统计学处理
所有资料用X±S表示，统计学分析采用SPSS11.0软件。多组间均数比较用F检验，均数间两两比较用q检验。
(二)结果
结果见表1所示。从表1可见，脑脉泰大剂量组、中剂量组和尼莫地平均可使局灶性脑缺血大鼠的脑含水量、EB含量明显减少，并与水通道蛋白表达成正相关，与缺血模型组比较，有显著性差异(P＜0.05)。AQP4阳性染色主要位于星形胶质细胞、室管膜细胞和血管间隙。缺血组和给药组表达强度明显高于Sham组(见图1-A-E)。
表1.脑脉泰对局灶性脑缺血大鼠脑含水量、EB含量和AQP-4阳性细胞率的影响.
(x±s.n＝10)
MCAO VS Sham：◇◇P＜0.01，MCAO+脑脉泰/尼莫地平vs MCAO：*P＜0.05 **P＜0.01
[实施例2]脑脉泰对脑缺血再灌注大鼠超微结构的影响
(一)试验材料和方法
同实施例1。
(二)结果
图2显示Sham组大鼠神经细胞的细胞核大而圆，核膜清晰，核仁明显，线粒体结构完好，未见水肿。
图3显示MCAO组大鼠神经细胞变性坏死，固缩，崩解，胞质内多数线粒体呈空泡样变，水肿明显。
图4显示脑脉泰大剂量组大鼠神经细胞少数线粒体有空泡，核膜较清晰，胶质细胞核仁明显，核膜有轻度凹陷，有局灶性水肿，与MCAO组比较，有明显改善。
此外，临床资料显示，本发明所述的中药组合物可用于治疗水通道蛋白-4表达增加所致脑部病变疾病，包括水通道蛋白-4表达增加所致脑外伤、脑出血、脑肿瘤或脑缺血；本发明所述的中药组合物还可用于水通道蛋白-4表达增加所致耳鼻咽喉科疾病或大肠癌疾病，治疗上述疾病的总有效率达到89％，疗效明显高于其他药物，且无明显不良反应和毒副作用。