巴细胞， 在免疫病变的动物模型中具有疾病调节活性， 并且降低了在缓解复发 (relapsing remitting) 的多发性硬化症中的缓解速率 (Brinkman 等 2002 JBC 277 ： 21453， Mandala 等 2002 Science 296 ： 346， Fujino 等 2003 JPharmacology and Experimental Therapeutics 305 ： 45658， Brinkman 等 2004American J Transplantation 4 ： 1019， Webb 等 2004 J Neuroimmunology 153 ： 108， Morris 等 2005 EurJ Immunol 35 ： 3570， Chiba 2005 Pharmacology andTherapeutics 108 ： 308， Kahan 等 2003， Transplantation 76 ： 1079， Kappos 等 2006New Eng J Medicine 335 ： 1124)。 该化合物是一种前药， 其在体内由鞘氨醇 激酶磷酸化得到对 S1P1、 S1P3、 S1P4 和 S1P5 受体具有激动剂活性的分子。临床研究表明 用 FTY720 治疗在治疗的头 24 小时内导致心动过缓 (Kappos 等 2006New Eng J Medicine 335 ： 1124)。根据许多基于细胞的实验和动物实验， 认为该心动过缓是因为对 S1P3 受体 的激动作用。这些实验包括使用不同于野生型小鼠的 S1P3 敲除动物， 其在给药 FTY720 和 使用 S1P1 选择性化合物后并没有显示出心动过缓。(Hale 等 2004Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters 14 ： 3501， Sanna 等 2004JBC 279 ： 13839， Koyrakh 等 2005 American JTransplantation 5 ： 529)。 因此， 需要相对于 S1P3， 对 S1P1 受体具有选择性的激动剂化合物， 可能预期会显 示出减小诱导心动过缓的趋势。
下 列 专 利 申 请 描 述 了 作 为 S1P1 激 动 剂 的二唑衍生物： WO03/105771、WO05/058848、 WO06/047195、 WO06/100633、 WO06/115188、 WO06/131336、 WO07/024922 和 WO07/116866。
下列专利申请描述了作为 S1P 受体激动剂的四氢异喹啉基 -二唑衍生物 ：WO06/064757、 WO06/001463、 WO04/113330。
WO08/064377 描述了具有 S1P1 受体活性的苯并环庚基类似物。
现已发现一类新结构的化合物， 其提供了 S1P1 受体的激动剂。
因此， 本发明提供了式 (I) 化合物或其药学上可接受的盐 ：
A 为苯基或 5 或 6- 元杂芳环 ；
R1 为至多两个取代基， 所述取代基独立地选自 ： 卤素、 C(1-3) 烷氧基、 C(1-3) 氟代烷基、 氰基、 任选取代的苯基、 C(1-3) 氟代烷氧基、 C(1-6) 烷基和 C(3-6) 环烷基 ；
R2 为氢、 卤素或 C(1-4) 烷基 ；
B 为选自下列基团的 7 元饱和环 ：
R3 为氢或任选被氧取代的 C(1-3) 烷基 ；
R4 为 (CH2)1-3CONH2、 (CH2)1-3OH、 CO2H 或 (CH2)1-3CO2H。
在本发明的一个实施方案中，
A 为苯基 ； 和/或
R1 为至多两个取代基， 所述取代基独立地选自 ： 氯和异丙氧基 ； 和/或
R2 为氢 ； 和/或
B 为 (a) 或 (b) ； 和/或
R3 为氢 ； 和/或
R4 为 (CH2)2CONH2、 (CH2)1-3OH、 CO2H 或 (CH2)2CO2H。
在本发明的一个实施方案中，
A 为苯基或吡啶基 ；
R1 为至多两个取代基， 所述取代基独立地选自 ： 氯、 氰基和异丙氧基 ；
R2 为氢 ；
B 为 (a) 或 (b) ；
R3 为氢 ；
R4 为 (CH2)2CONH2、 (CH2)1-3OH、 CO2H 或 (CH2)1-3CO2H。
在一个实施方案中， A 为苯基或吡啶基。在另一个实施方案中， A 为苯基。在另一 个实施方案中， A 为 3， 4- 二取代的苯基。
在一个实施方案中， R1 为两个取代基， 其中一个为 C(1-3) 烷氧基， 另一个选自卤素 或氰基。在另一个实施方案中， R1 为两个取代基， 其中一个为异丙氧基， 且另一个选自氯或 氰基。在另一个实施方案中， R1 为两个取代基， 其选自氯、 异丙氧基和氰基。在另一个实施 方案中， R1 为氯和异丙氧基。在另一个实施方案中， 当 A 为苯基时， R1 为在 3- 位上的氯和 在 4- 位上的异丙氧基， 或者当 A 为吡啶基时， R1 为在 5- 位上的氯和在 6- 位上的异丙氧基。 在另一个实施方案中， R1 为异丙氧基和氰基。在另一个实施方案中， 当 A 为苯基时， R1 为 在 3- 位上的氰基和在 4- 位上的异丙氧基， 或者当 A 为吡啶基时， R1 为在 5- 位上的氯和在 6- 位上的异丙氧基。
在一个实施方案中， B 为 (a) 或 (b)。在另一个实施方案中， B 为 (b)。
在一个实施方案中， R2 为氢。
在一个实施方案中， R3 为氢。
在一个实施方案中， R4 为 (CH2)2CONH2、 (CH2)1-3OH、 CO2H 或 (CH2)1-3CO2H。在另一个 实施方案中， R4 为 (CH2)1-3CO2H。
术语 “烷基” 作为基团或基团 ( 如烷氧基或羟基烷基 ) 的一部分， 是指所有异构形 式的直链或支链烷基。术语 “C(1-6) 烷基” 是指如上定义的烷基， 其含有至少 1 个且至多 6 个 碳原子。这样的烷基的实例包括甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 仲丁基或叔丁 基。 这样的烷氧基的实例包括甲氧基、 乙氧基、 丙氧基、 异丙氧基、 丁氧基、 异丁氧基、 仲丁氧
基和叔丁氧基。
合适的 C(3-6) 环烷基包括环丙基、 环丁基、 环戊基和环己基。
本文中所用的术语 “卤素” 是指氟 (F)、 氯 (Cl)、 溴 (Br) 或碘 (I)， 且术语 “卤” 是 指卤素 ： 氟 (-F)、 氯 (-Cl)、 溴 (-Br) 和碘 (-I)。
术语 “杂芳基” 表示包含一个或多个选自 O、 N 或 S 的杂原子的不饱和环。5 或 6 元 杂芳环的实例包括吡咯基、 三唑基、 噻二唑基、 四唑基、 咪唑基、 吡唑基、 异噻唑基、 噻唑基、 异 唑基、 唑基、 二唑基、 呋咱基、 呋喃基、 噻吩基、 吡啶基、 嘧啶基、 吡嗪基、 哒嗪基和三嗪基。 在某些式 (I) 化合物中， 取决于取代基的性质， 存在手性碳原子， 并因此式 (I) 化 合物可以立体异构体存在。本发明延伸至式 (I) 化合物的所有旋光异构体如立体异构体形 式， 包括对映异构体、 非对映异构体及其混合物如外消旋体。 不同的立体异构体形式可利用 常规的方法彼此之间分离或拆分得到， 或任何指定的异构体可利用常规立体选择性或不对 称合成得到。
本文中的某些化合物可以不同的互变异构体形式存在， 并且应该理解本发明包括 所有这些互变异构体形式。
应该理解本发明的某些化合物不但含有酸性基团而且含有碱性基团， 因此在某些 pH 值它们可以两性离子形式存在。
本发明合适的化合物为 ：
3-[7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-1- 基 ] 丙酰胺二唑 -3- 基 )-2， 3，4， 5- 四氢 -1H-2- 苯并氮杂
3-[7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-1- 基 ] 丙酸 3-[7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-1- 基 ]-1- 丙醇二唑 -3- 基 )-2， 3， 二唑 -3- 基 )-2， 3，4， 5- 四氢 -1H-2- 苯并氮杂
4， 5- 四氢 -1H-2- 苯并氮杂
[7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-3- 基 ] 甲醇二唑 -3- 基 )-2， 3， 4，5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-3- 甲酸 [9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-5- 基 ] 乙酸 [9-(5-{3- 氰基 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-5- 基 ] 乙酸二唑 -3- 基 )-2， 3， 4， 二唑 -3- 基 )-2， 3， 4， 二唑 -3- 基 )-2， 3， 二唑 -3- 基 )-2，5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
[9-(5-{5- 氯 -6-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ]-3- 吡啶基 }-1， 2， 4-5- 基 ] 乙酸3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
4-[9-(5-{3- 氰基 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 47二唑 -3- 基 )-2，101945865 A CN 101945873说明书5/51 页3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
-5- 基 ] 丁酸 二唑 -3- 基 )-2， -5- 基 ] 丁酸 二唑 -3- 基 )-2， 3， 二唑 -3- 基 )-2， 3， -5- 基 ] 丁酸 -3- 基 ] 丙酸4-[9-(5-{5- 氯 -6-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ]-3- 吡啶基 }-1， 2， 44-[9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 43-[7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
或其药学上可接受的盐。
式 (I) 化合物的药学上可接受的衍生物包括式 (I) 化合物的任何药学上可接受的 盐、 酯、 或这些酯的盐， 当将其给予接受者时能 ( 直接或间接地 ) 提供式 (I) 化合物或其活 性代谢物或残余物。
式 (I) 化合物可形成盐。应当理解， 对于在药物中使用， 式 (I) 化合物的盐应该 是药学上可接受的。合适的药学上可接受的盐是本领域的技术人员显而易见的， 并包括在 J.Pharm.Sci.， 1977， 66， 1-19 中所述的那些盐， 例如与无机酸例如盐酸、 氢溴酸、 硫酸、 硝酸 或磷酸 ； 以及与有机酸例如琥珀酸、 马来酸、 乙酸、 富马酸、 柠檬酸、 酒石酸、 苯甲酸、 对甲苯 磺酸、 甲磺酸或萘磺酸形成的酸加成盐。某些式 (I) 化合物可与一或多当量的酸形成酸加 成盐。本发明在其范围内包括所有可能的化学计量的和非化学计量的形式。盐还可以由药 学上可接受的碱包括无机碱和有机碱制备。 衍生自无机碱的盐包括铝盐、 铵盐、 钙盐、 铜盐、 铁盐、 亚铁盐、 锂盐、 镁盐、 锰盐、 二价锰盐、 钾盐、 钠盐、 锌盐等。 衍生自药学上可接受的有机 碱的盐包括衍生自下述碱的盐 ： 伯胺、 仲胺以及叔胺 ； 取代的胺包括天然存在的取代的胺 ； 和环胺。具体的药学上可接受的有机碱包括精氨酸、 甜菜碱、 咖啡因、 胆碱、 N， N′ - 二苄基 乙二胺、 二乙基胺、 2- 二乙基氨基乙醇、 2- 二甲基氨基乙醇、 乙醇胺、 乙二胺、 N- 乙基 - 吗啉、 N- 乙基哌啶、 葡萄糖胺、 葡糖胺、 组氨酸、 哈胺 (hydrabamine)、 异丙基胺、 赖氨酸、 甲基葡萄 糖胺、 吗啉、 哌嗪、 哌啶、 普鲁卡因、 嘌呤、 可可碱、 三乙基胺、 三甲基胺、 三丙基胺、 三 ( 羟基 甲基 ) 氨基甲烷 (TRIS， 氨基丁三醇 ) 等。盐还可以由碱性离子交换树脂例如多胺树脂形 成。 当本发明的化合物为碱性的时候， 盐可由药学上可接受的酸包括无机酸和有机酸制备。 所述的酸包括乙酸、 苯磺酸、 苯甲酸、 樟脑磺酸、 柠檬酸、 乙磺酸、 乙二磺酸、 富马酸、 葡糖酸、 谷氨酸、 氢溴酸、 氢氯酸、 羟乙基磺酸、 乳酸、 马来酸、 苹果酸、 扁桃酸、 甲磺酸、 半乳糖二酸、 双羟萘酸、 泛酸、 磷酸、 丙酸、 琥珀酸、 硫酸、 酒石酸、 对甲苯磺酸等。
药学上可接受的盐可通过与合适的酸或酸衍生物反应而常规地制备。 与碱形成的 药学上可接受的盐可通过与合适的无机碱或有机碱反应而常规地制备。
式 (I) 化合物可以以结晶或非结晶形式制备， 如果为结晶的话， 则可以任选为水 合的或溶剂化的。本发明范围包括化学计量的水合物或溶剂化物以及含有可变量的水和 / 或溶剂的化合物。
式 (I) 化合物的所有盐、 溶剂化物、 水合物、 络合物、 多晶型物、 前药、 放射标记的 衍生物、 立体异构体和旋光异构体均包括在本发明的范围内。
在另一方面， 本发明提供了制备式 (I) 化合物的方法。
本发明化合物对于 S1P1 受体的效能和功效可以通过如本文所述的在人克隆的受体上进行的 GTPγS 试验测定。 使用本文所述的功能试验也已经证明式 (I) 化合物对于 S1P1 受体具有激动活性。
因此， 式 (I) 化合物及它们药学上可接受的盐用于治疗由 S1P1 受体介导的病症或 疾病。特别是， 式 (I) 化合物及它们药学上可接受的盐用于治疗多发性硬化症、 自身免疫性 疾病、 慢性炎性疾病、 哮喘、 炎性神经病、 关节炎、 移植、 节段性回肠炎、 溃疡性结肠炎、 红斑 狼疮、 牛皮癣、 缺血 - 再灌注损伤、 实体肿瘤 (solid tumours) 和肿瘤转移、 与血管生成有关 的疾病、 血管疾病、 疼痛病症、 急性病毒病、 炎性肠病、 胰岛素和非胰岛素依赖性糖尿病 ( 后 文中称作 “本发明的疾病” )。
因此， 式 (I) 化合物及它们药学上可接受的盐用于治疗红斑狼疮。
因此， 式 (I) 化合物及它们药学上可接受的盐用于治疗牛皮癣。
因此， 式 (I) 化合物及它们药学上可接受的盐用于治疗多发性硬化症。
应当理解本文中所用的″治疗″包括预防以及确定症状的减轻。
因此， 本发明还提供了式 (I) 化合物或其药学上可接受的盐， 其为用作特别是治 疗由 S1P1 受体所介导的病症或疾病的治疗物质。特别是， 本发明提供了式 (I) 化合物或其 药学上可接受的盐， 其为用作治疗多发性硬化症、 自身免疫性疾病、 慢性炎性疾病、 哮喘、 炎 性神经病、 关节炎、 移植、 节段性回肠炎、 溃疡性结肠炎、 红斑狼疮、 牛皮癣、 缺血 - 再灌注损 伤、 实体肿瘤和肿瘤转移、 与血管生成有关的疾病、 血管疾病、 疼痛病症、 急性病毒病、 炎性 肠病、 胰岛素和非胰岛素依赖性糖尿病的治疗物质。
式 (I) 化合物及它们药学上可接受的盐为用作治疗红斑狼疮的治疗物质。
式 (I) 化合物及它们药学上可接受的盐为用作治疗牛皮癣的治疗物质。
式 (I) 化合物及它们药学上可接受的盐为用作治疗多发性硬化症的治疗物质。
本发明还提供了治疗哺乳动物包括人中可由 S1P1 受体所介导的病症或疾病的方 法， 所述方法包括给药于患者治疗上安全且有效量的式 (I) 化合物或其药学上可接受的 盐。特别地， 本发明提供了治疗多发性硬化症、 自身免疫性疾病、 慢性炎性疾病、 哮喘、 炎性 神经病、 关节炎、 移植、 节段性回肠炎、 溃疡性结肠炎、 红斑狼疮、 牛皮癣、 缺血 - 再灌注损 伤、 实体肿瘤和肿瘤转移、 与血管生成有关的疾病、 血管疾病、 疼痛病症、 急性病毒病、 炎性 肠病、 胰岛素和非胰岛素依赖性糖尿病的方法， 所述方法包括给药于患者治疗上安全且有 效量的式 (I) 化合物或其药学上可接受的盐。
本发明提供了治疗红斑狼疮的方法， 所述方法包括给药于患者治疗上安全且有效 量的式 (I) 化合物或其药学上可接受的盐。
本发明提供了治疗牛皮癣的方法， 所述方法包括给药于患者治疗上安全且有效量 的式 (I) 化合物或其药学上可接受的盐。
本发明提供了治疗多发性硬化症的方法， 所述方法包括给药于患者治疗上安全且 有效量的式 (I) 化合物或其药学上可接受的盐。
另一方面， 本发明提供了式 (I) 化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗由 S1P1 受体所介导的病症或疾病的药物中的用途。
特别地， 本发明提供了式 (I) 化合物或其药学上可接受的盐， 其用于制备用于治 疗多发性硬化症、 自身免疫性疾病、 慢性炎性疾病、 哮喘、 炎性神经病、 关节炎、 移植、 节段性 回肠炎、 溃疡性结肠炎、 红斑狼疮、 牛皮癣、 缺血 - 再灌注损伤、 实体肿瘤和肿瘤转移、 与血管生成有关的疾病、 血管疾病、 疼痛病症、 急性病毒病、 炎性肠病、 胰岛素和非胰岛素依赖性 糖尿病的药物。
式 (I) 化合物及它们药学上可接受的盐， 其用于制备用于治疗红斑狼疮的药物。
式 (I) 化合物及它们药学上可接受的盐， 其用于制备用于治疗牛皮癣的药物。
式 (I) 化合物及它们药学上可接受的盐， 其用于制备用于治疗多发性硬化症的药 物。
为了在治疗中使用式 (I) 化合物及其药学上可接受的盐， 通常根据标准的制药方 法将它们配制成药物组合物。本发明还提供了药物组合物， 其包括式 (I) 化合物或其药学 上可接受的盐， 以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一方面， 本发明提供了制备药物组合物的方法， 所述方法包括将式 (I) 化合 物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体或赋形剂相混合。
本发明的药物组合物可以合适地通过在环境温度下以及大气压力下混合制备， 通 常适合于口服、 肠胃外或直肠给药， 并且可以以片剂、 胶囊、 口服液体制剂、 粉剂、 粒剂、 锭 剂、 可重新配制粉末 (reconstitutable powders)、 可注射或可输注的溶液或悬浮液或栓剂 的形式存在。通常优选口服给药的组合物。 对于口服给药的片剂和胶囊可为单位剂型， 并且可含有常规赋形剂， 如粘合剂 ( 如预胶化的玉米淀粉， 聚乙烯吡咯烷酮或羟基丙基甲基纤维素 ) ； 填充剂 ( 如乳糖， 微晶纤 维素或磷酸氢钙 ) ； 压片润滑剂 ( 如硬脂酸镁， 滑石或二氧化硅 ) ； 崩解剂 ( 如马铃薯淀粉或 淀粉羟乙酸钠 ) ； 和可接受的润湿剂 ( 如月桂基硫酸钠 )。片剂可通过通常的药物实践中熟 知的方法进行包衣。
口服液体制剂可以以例如含水或含油悬浮液、 溶液、 乳液、 糖浆或酏剂的形式存 在， 或者可以以干产品的形式存在， 这种干产品在使用前用水或其它合适的载体 (vehicle) 重新配制 (reconstitution)。 这些液体制剂可以含有常规添加剂例如助悬剂 ( 如山梨醇糖 浆、 纤维素衍生物或氢化食用脂肪 )， 乳化剂 ( 如卵磷脂或阿拉伯树胶 )， 非水载体 ( 其可以 包括食用油如杏仁油， 油酯， 乙醇或分馏植物油 (fractionated vegetable oils))， 防腐剂 ( 如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸 )， 以及如果需要的话， 该制剂还可以 含有常规调味剂 (flavouring) 或着色剂、 缓冲性盐和甜味剂。口服给药制剂可适当地配制 成活性化合物的控释释放剂型。
对于肠胃外给药， 使用本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及无菌载体配制 成液体单位剂量形式。 注射用制剂可以使用本发明的化合物或其药学上可接受的衍生物以 及无菌载体， 任选地加入防腐剂， 例如装在安瓿或多剂量容器中以单位剂型存在。 组合物可 以采取在油性或水性载体中的混悬液、 溶液或乳液的形式， 并且可以含有配制试剂， 如助悬 剂、 稳定剂和 / 或分散剂。另一方面， 活性成分可以是粉末形式， 在使用前用合适的载体， 如 无菌无热原水来配制。 根据所用的载体及浓度， 可将所述化合物悬浮或溶解在所述载体中。 在配制溶液的过程中， 为了用于注射可将所述化合物溶解和过滤灭菌， 随后填充到合适的 小瓶 (vial) 或安瓿中， 然后密封。有利地， 将助剂例如局部麻醉剂、 防腐剂和缓冲剂溶于载 体中。为了提高稳定性， 可将组合物填充到小瓶中后， 将其冷冻并在真空下除去水。除了将 所述化合物悬浮在载体中而不是溶于载体中， 并且不能通过过滤灭菌外， 以基本上相同的 方式配制肠胃外悬浮液。在将化合物悬浮于无菌载体中之前， 可通过暴露于环氧乙烷中来
对所述化合物进行灭菌。 有利地， 将表面活性剂或润湿剂加入到所述组合物中， 以便促进化 合物的均匀分布。
洗剂可用水性或油性基质配制， 洗剂一般还包含一种或多种乳化剂、 稳定剂、 分散 剂、 助悬剂、 增稠剂或着色剂。滴剂可以用水性或非水性基质配制， 还包含一种或多种分散 剂、 稳定剂、 增溶剂或助悬剂。它们还可含有防腐剂。
式 (I) 化合物或其药学上可接受的盐还可以制成直肠组合物的形式， 如栓剂或者 保留灌肠剂， 例如含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油酯。
式 (I) 化 合 物 或 其 药 学 上 可 接 受 的 盐 还 可 被 配 制 成 长 效 制 剂 (depotpreparation)。这些长效制剂可以通过植入 (implantation) 方式 ( 例如皮下或者 肌内 ) 或者通过肌肉注射方式给药。因此， 例如本发明的化合物可以用合适的聚合物或者 疏水性材料 ( 例如作为在可接受油中的乳液 ) 或离子交换树脂， 或以微溶性衍生物例如微 溶性盐制成制剂。
对于鼻内给药， 式 (I) 化合物或其药学上可接受的盐可以被配制成通过合适的计 量或单一剂量装置给药的溶液， 或者用适合的载体配制成粉末混合物， 利用适合的递药装 置给药。因而， 式 (I) 化合物或其药学上可接受的盐可以被配制成口服、 口含、 肠胃外、 局部 ( 包括眼和鼻 )、 长效或直肠给药剂型或者被配制成适合于借助吸入或吹入 ( 通过口或鼻 ) 给药的剂型。 式 (I) 化合物或其药学上可接受的盐可以被配制成用于局部给药的软膏剂、 霜 剂、 凝胶剂、 洗剂、 阴道栓剂、 气雾剂或滴剂 ( 例如眼、 耳或鼻滴剂 )。 软膏剂和霜剂例如可以 用水性或油性基质加以配制， 其中加入适合的增稠剂和 / 或胶凝剂。眼部给药用软膏剂可 以使用经过灭菌的组分、 按无菌方式加以制备。
根据给药方法， 所述组合物可含有 0.1 ％～ 99 重量％， 优选地含有 10 ～ 60 重 量％的活性物质。用于治疗前述疾病的化合物的剂量可按常规的方式随疾病的严重程度、 患者的体重以及其他类似的因素而改变。但是， 作为一般性的指导， 合适的单位剂量可为 0.05 ～ 1000mg， 1.0 ～ 500mg 或 1.0 ～ 200mg ； 并且所述的单位剂量可以每天多于一次给 药， 例如每天两次或三次给药。
式 (I) 化 合 物 或 其 药 学 上 可 接 受 的 盐 可 以 组 合 制 剂 (combinationpreparations)、 以与其他的活性成分组合的形式使用。例如， 本发明化合物 可与环孢霉素 A、 甲氨喋呤、 类固醇、 雷帕霉素、 促炎细胞因子抑制剂、 免疫调节剂包括生物 制剂或其他治疗上有效的化合物组合使用。
本发明也包括同位素标记的化合物， 其与在式 I 和下面中所述的那些化合物相 同， 但实际上一个或多个原子被具有不同于自然界中通常存在的原子量或质量数的原子量 或质量数的原子所替换。可掺入到本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、 碳、 氮、 氧、 3 11 14 18 123 125 磷、 氟、 碘和氯的同位素， 如 H、 C、 C、 F、 I 和 I。
含有上述同位素和 / 或其它原子的其它同位素的本发明化合物及所述化合物的 药学上可接受的盐在本发明的范围内。本发明同位素标记的化合物 ( 例如掺入放射性同位 14 素如 3H、 C 的化合物 ) 可用于药物和 / 或底物组织分布试验。氚代， 即 3H， 以及碳 -14， 即， 14 11 18 C， 同位素是特别优选的， 由于它们易于制备以及检测。 C 和 F 同位素尤其可用于 PET( 正 电子发射断层扫描术 )， 且 125I 同位素特别用于 SPECT( 单光子发射计算机化断层显象 )， 它
们都用于脑成像。此外， 用较重的同位素 ( 如氘， 即 2H) 进行取代能够提供某些治疗优点， 因为它们有更好的代谢稳定性， 例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求， 且因此在一些 情况下较重的同位素是优选的。同位素标记的本发明的式 (I) 化合物及下述化合物一般可 通过实施在下述方案和 / 或在实施例中公开的方法， 利用易得的同位素标记的试剂代替非 同位素标记的试剂来进行制备。
在另一个方面， 本发明提供了制备式 (I) 化合物的方法。
一种可以用于制备式 (I) 化合物的途径示于方案 1 中， 其中 B 为
其中 R1、 R2 和 A 如上式 (I) 中所定义， 侧链 R4 位于 1 位， n 为 1-3， R2 为氢或 C(1-4) 烷基， R3 为氢， R 为烷基 ( 例如乙基 )， hal 为氯、 溴或碘， 且 P、 P1 为保护基。
方案 1
可市售购得的 ( 如 Fluorochem) 式 (i) 化合物， 可以通过如下方法转化为例如其 中 P1 为保护基如苄基的式 (ii) 化合物 ： 在碱如碳酸钾存在的条件下， 在合适的溶剂如 DMF 中， 使用烷基化试剂如溴化苄处理。式 (ii) 化合物可以通过在合适的溶剂如乙醇中， 在升 温如 80℃下， 使用合适的碱如氢氧化钠水溶液水解转化为式 (iii) 化合物。式 (iii) 化合
物可以通过如下常规方法转化为式 (iv) 化合物 ： 例如使用合适的酰胺偶联试剂如氯甲酸 乙酯处理， 然后与氨在低温如 -10℃下， 在合适的溶剂如 THF 中反应。 式 (iv) 化合物可以通 过使用合适的还原剂如氢化铝锂， 在低温如低于 15℃下， 在溶剂如 THF 中， 然后升高温度至 如 80℃处理转化为式 (v) 化合物。式 (v) 化合物可以通过在碱如三乙胺存在下， 在合适的 溶剂如二氯甲烷中， 使用合适的酰卤 (vi) 处理转化为式 (vii) 化合物。酰化试剂 (vi) 典 型地市售购得或可使用标准方法制备。 式 (vii) 化合物可以通过如下方法转化为式 (viii) 化合物 ： 例如在溶剂如乙腈中， 在升高的温度如回流下， 使用三氯氧磷处理， 然后在合适的 溶剂如甲醇中， 使用合适的还原剂如硼氢化钠还原， 硼氢化钠需在低温如 0℃下加入然后升 温至室温。式 (viii) 化合物可以通过如下方法转化为其中 P 表示合适的保护基如叔丁氧 羰基 (BOC) 的保护的式 (ix) 衍生物 ： 例如在碱如三乙胺存在下， 在合适的溶剂如二氯甲烷 (DCM) 中， 使用焦碳酸双 (1， 1- 二甲基乙基 ) 酯处理。其中 P1 表示保护基如苄基的式 (ix) 化合物可以通过使用合适的催化剂如钯氢解脱除保护基得到式 (x) 化合物， 式 (x) 化合物 可以通过使用合适的碱如吡啶， 使用合适的试剂如三氟甲磺酸酐处理转化为式 (xi) 化合 物。式 (xi) 化合物可以通过在催化剂如四 ( 三苯基膦 ) 合钯 (0) 存在下， 在合适的溶剂如 二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 在升高的温度如 80℃下， 使用合适的氰基来源化合物如氰化锌处 理转化为式 (xii) 化合物。 式 (xii) 化合物可以通过在溶剂如甲醇或乙醇中， 在升高的温度 如 60℃下， 使用盐酸羟胺和合适的碱如碳酸氢钠处理转化为式 (xiii) 化合物。式 (xiii) 化合物可以通过在碱如三乙胺存在下， 在合适的溶剂如 DMF 中， 使用式 (xv) 的酰氯处理转 化为式 (xvi) 化合物。将上述反应混合物典型地在室温下搅拌一段时间， 然后在升高的温 度如 120℃下搅拌。式 (xv) 的酰氯可市售购得或可通过常规方法由相应的酸 (xiv) 制得。 或者， 式 (xiii) 化合物可以通过在合适的酰胺偶联试剂如 1-(3- 二甲基氨基丙基 )-3- 乙 基碳二亚胺盐酸盐 (EDAC)、 1- 羟基苯并三唑 (HOBt) 存在下， 在合适的溶剂如 DMF 中， 使用 式 (xiv) 的羧酸处理转化为式 (xvi) 化合物。上述反应典型地在升高的温度例如 50-80℃ 下进行。典型地， 在加入式 (xiii) 化合物前， 将酸 (xiv)、 EDAC 和 HOBt 在室温下搅拌一段 时间。式 (xvi) 化合物可以通过在醇性溶剂如乙醇或甲醇中， 使用碱如氢氧化钠水溶液处 理转化为式 (xvii) 化合物。其中 P 表示合适的保护基如叔丁氧羰基 (BOC) 的式 (xvii) 化 合物， 可以通过使用合适的酸典型地为三氟乙酸或盐酸处理转化为某些式 (I) 化合物。
一种可以用于制备式 (I) 化合物的途径示于方案 2 中， 其中 B 为
其中 R1、 R2 和 A 如上式 (I) 中所定义， 侧链 R4 位于苯并氧氮杂环的 5 位， R3 为氢， R4 为 (CH2)2CO2H， R 为烷基 ( 例如甲基 )， 且 P 为保护基。
方案 2
可市售购得 ( 如 Aldrich) 的式 (xviii) 化合物， 可以通过在合适的溶剂如二氯甲 烷中， 使用 Wittig 试剂 (xix) 如 ( 乙氧基羰基亚甲基 ) 三苯基膦处理转化为式 (xx) 化合 物。式 (xx) 化合物可以通过使用合适的 N- 保护的 ( 如 Boc) 乙醇胺 (xxi) 处理转化为式 (xxii) 化合物， 该反应在 Mitsunobu 反应的条件下， 使用偶氮二甲酸二异丙酯 (DIAD) 和三 苯基膦， 在合适的溶剂如 THF 中进行。其中 P 表示合适的保护基如叔丁氧羰基 (BOC) 的式 (xxii) 化合物， 可以通过使用酸典型地为三氟乙酸或盐酸处理转化为式 (xxiii) 化合物。 式 (xxiii) 化合物可以通过在合适的溶剂如 THF 中， 使用合适的试剂如 1， 8- 二氮杂双环 [5.4.0] 十一碳 -7- 烯 (DBU) 处理转化为式 (xxiv) 化合物。式 (xxiv) 化合物可以通过如 下方法转化为其中 P 表示合适的保护基如叔丁氧羰基 (BOC) 的合适的 N- 保护的式 (xxv) 衍生物 ： 例如在碱如三乙胺存在下， 在合适的溶剂如二氯甲烷 (DCM) 中， 使用焦碳酸双 (1， 1- 二甲基乙基 ) 酯处理。式 (xxv) 化合物可以通过在催化剂如四 ( 三苯基膦 ) 合钯 (0) 存在下， 在合适的溶剂如二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 在升高的温度如 80℃下， 使用合适的氰基 来源化合物如氰化锌处理转化为式 (xxvi) 化合物。式 (xxvi) 化合物可以按照方案 1 中将 (xii) 转化为 (xiii) 的方法， 通过使用盐酸羟胺处理转化为式 (xxvii) 化合物。 式 (xxvii) 化合物可以按照方案 1 中所述的用于将 (xiii) 转化为 (xvi) 的方法， 使用式 (xv) 酰氯处 理转化为式 (xxviii) 化合物。式 (xxviii) 化合物可以通过在醇溶剂如乙醇或甲醇中， 使 用碱如氢氧化钠水溶液处理转化为式 (xxix) 化合物。其中 P 为 BOC 的式 (xxix) 化合物可 以通过使用酸典型地为三氟乙酸或盐酸处理 ( 如方案 1 所述 ) 转化为某些式 (I) 化合物。
一种可以用于制备式 (I) 化合物的途径示于方案 3 中， 其中 B 为
其中 R1、 R2 和 A 如式 (I) 中所定义， 侧链 R4 位于苯并氧氮杂14环的 5 位， R3 为氢，101945865 A CN 101945873说明书12/51 页R4 为 (CH2)3CO2H， R 为烷基 ( 例如甲基 )， 且 P 为保护基。
方案 3
其中 R2 为氢、 R 为烷基 ( 如乙基 ) 且 P 为保护基 ( 如 BOC) 的式 (xxx) 化合物可以 使用合适的还原剂如硼氢化锂， 在合适的溶剂如甲醇中转化为式 (xxxi) 化合物。 式 (xxxi) 化合物可以通过使用合适的方法如 Swern 氧化方法， 氧化为式 (xxxii) 化合物。 式 (xxxii) 化合物可以通过如下方法转化为式 (xxxiii) 化合物 ： 例如在合适的溶剂如二氯甲烷中， 使 用 Wittig 试剂 (xix) 如 ( 乙氧基羰基亚甲基 ) 三苯基膦处理。式 (xxxiii) 化合物可以通 过使用合适的催化剂如钯， 氢化为式 (xxxiv) 化合物。式 (xxxiv) 化合物可以通过方案 2 中所述的用于将式 (xxvi) 转化为某些式 (I) 化合物的方法转化为式 (xxxv) 化合物。
一种可以用于制备式 (I) 化合物的途径示于方案 4 中， 其中 B 为
其中 R1、 R2 和 A 如式 (I) 中所定义， 侧链 R4 位于苯并氧氮杂环的 5 位并为(CH2)2CO2H， R3 为氢， R 为烷基 ( 例如甲基 )， 且 P 为保护基。
方案 4
式 (xxxii) 化合物可以通过如下方法转化为式 (xxxvi) 化合物 ： 例如在合适的碱 如二异丙基氨基化锂 (LDA) 存在下， 在合适的溶剂如 THF 中， 使用合适的试剂如 ( 甲氧基甲 基 ) 二苯基氧膦 (xxxv) 处理， 然后任选地加入碱如氢化钠。式 (xxxvi) 化合物可以通过在 合适的溶剂如二氯甲烷中， 使用合适的方法如氯代铬酸吡啶 (PCC) 氧化为式 (xxxvii) 化合物。式 (xxxvii) 化合物可以通过使用方案 2 中所述的用于将式 (xxvi) 化合物转化为某 些式 (I) 化合物的方法转化为式 (I) 化合物。
一种可以用于制备式 (I) 化合物的途径示于方案 5 中， 其中 B 为
其中 R1、 R2 和 A 如式 (I) 中所定义， 侧链 R4 位于苯并氧氮杂环的 3 位并为(CH2)2CO2H， R3 为氢， R 为烷基 ( 例如甲基 )， 且 P 为保护基。
方案 5
可市售购得 ( 如 Aldrich， 其中 R ＝ Me) 的式 (xxxviii) 化合物可以通过如下方 法转化为式 (xL) 化合物 ： 在 Mitsunobu 反应条件下， 使用例如偶氮二甲酸二异丙酯 (DIAD) 和三苯基膦， 在合适的溶剂如甲苯中， 使用其中 P 为合适的保护基如叔丁氧羰基 (BOC) 的式 (xxxix) 化合物 ( 其可以使用如 Journal ofOrganic Chemistry(1987)， 52(12)， 2361-4 所 述方法制备 ) 处理。其中 P 表示合适的保护基如叔丁氧羰基 (BOC) 的式 (xL) 化合物可以 通过在合适的溶剂如甲醇中， 使用酸典型地为 4- 甲基苯磺酸处理转化为式 (xLi) 化合物。 式 (xLi) 化合物可以通过如下方法转化为式 (xLii) 化合物 ： 例如在合适的碱如三乙胺存在 下， 在合适的溶剂如甲苯中， 在室温下然后加热回流下， 使用合适的酸如三氟乙酸处理。式 (xLii) 化合物可以通过在合适的溶剂如 THF 中， 在合适的温度如回流下， 使用合适的还原 剂如硼烷 -THF 络合物处理转化为式 (xLiii) 化合物。式 (xLiii) 化合物可以通过如下方 法转化为其中 P 表示合适的保护基如叔丁氧羰基 (BOC) 的保护的式 (xLiv) 衍生物 ： 例如在 碱如三乙胺存在下， 在合适的溶剂如二氯甲烷 (DCM) 中， 使用焦碳酸双 (1， 1- 二甲基乙基 ) 酯处理。式 (xLiv) 化合物可以通过在催化剂如四 ( 三苯基膦 ) 合钯 (0) 存在下， 在合适的 溶剂如二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 在升高的温度如 80℃下， 使用合适的氰基来源化合物如氰 化锌处理转化为式 (xLv) 化合物。式 (xLv) 化合物可以通过在溶剂如甲醇或乙醇中， 在升 高的温度如 60℃下， 使用盐酸羟胺和合适的碱如碳酸氢钠处理转化为式 (xLvi) 化合物。
式 (xLvi) 化合物可以通过使用方案 1 中所述的用于将式 (xiii) 化合物转化为式 (xvi) 化合物的方法用式 (xv) 酰氯处理转化为式 (xLvii) 化合物。式 (xLvii) 化合物可 以通过在合适的溶剂如二氯甲烷中， 使用合适的氧化剂如 Dess-Martin 氧化剂氧化转化为 式 (xLviii) 化合物。式 (xLviii) 化合物可以通过如下方法转化为式 (xLix) 化合物 ： 例如在合适的溶剂如二氯甲烷中， 使用 Wittig 试剂 (xix) 如 ( 乙氧基羰基亚甲基 ) 三苯基膦处 理。式 (xLix) 化合物可以通过在合适的溶剂如乙醇中， 使用合适的催化剂如钯氢化转化为 式 (L) 化合物。式 (L) 化合物可以通过在醇溶剂如乙醇或甲醇中， 使用碱如氢氧化钠水溶 液处理转化为式 (Li) 化合物。其中例如 P 为 BOC 的式 (Li) 化合物可以按照方案 1 中所述 的方法， 通过使用酸典型地为三氟乙酸或盐酸处理转化为某些式 (I) 化合物。
一种可以用于制备式 (I) 化合物的途径示于方案 6， 其中 B 为
其中 R1、 R2 和 A 如上式 (I) 中所定义， 侧链 R4 位于苯并氧氮杂环的 3 位并为R3 为氢， 且 P 为保护基。 CO2H，
方案 6
式 (xLvii) 化合物可以通过在合适的溶剂如丙酮中， 使用合适的氧化剂如三氧化 铬的硫酸溶液氧化为式 (Lii) 化合物。其中例如 P 为 BOC 的式 (Lii) 化合物可以通过合适 的酸典型地为三氟乙酸或盐酸处理转化为某些式 (I) 化合物。
在本说明书中所引用的所有出版物， 包括但不局限于专利和专利申请， 在此将它 们引入作为参考， 就像每个单独的出版物具体地和单独地在此被充分阐述地引用作为参 考。
下面的制备例和实施例举例说明了本发明化合物的制备。
缩写 ：
g克
mg毫克
ml毫升
μl微升
MeCN乙腈
MeOH甲醇
EtOH乙醇
Et2O乙醚
EtOAc乙酸乙酯
DCMDIADDMEDMFDMSOEDACEDCEDClHOBT/HOBtIPANCSPyBOPTHFdbaRT℃MHsdtqMHzMeODLCMSLC/MSMSESMH+-二氯甲烷 偶氮二甲酸二异丙酯 1， 2- 双 ( 甲氧基 ) 乙烷 N， N- 二甲基甲酰胺 二甲基亚砜 N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N′ - 乙基碳二亚胺盐酸盐 N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N′ - 乙基碳二亚胺盐酸盐 N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N′ - 乙基碳二亚胺盐酸盐 羟基苯并三唑 异丙醇 N- 氯琥珀酰亚胺 苯并三唑 -1- 基 - 氧基三 ( 吡咯烷基 ) 四氢呋喃 二亚苄基丙酮 室温 摄氏度 摩尔浓度 质子 单峰 二重峰 三重峰 四重峰 兆赫兹 氘代甲醇 液相色谱 - 质谱联用法 液相色谱 - 质谱联用法 质谱 电喷雾 质量离子 (mass ion)+H+ 六氟磷酸盐MDAP质 量 检 测 的 自 动 制 备 液 相 色 谱 法 (Mass DirectedAutomated Preparative liquid chromatography)
sat.饱和的
一般的化学部分
下述方法用于说明的目的， 制备实施例的中间体可不必由所述的具体物料制备。
制备例 1
3-{3-[( 苯基甲基 ) 氧基 ] 苯基 } 丙酸苯甲基酯
将 3-(3- 羟 基 苯 基 ) 丙 酸 (Fluorochem， 12.46g， 75mmol)、碳 酸 钾 (31.1g， 225mmol) 和苄基溴 (18.7ml， 158mmol) 在 DMF(120ml) 中的混合物于 65℃搅拌 16 小时。将 该混合物冷却至室温， 用乙醚 (200mL) 和水 (400mL) 稀释， 并将水相用乙醚 (100mL) 再次萃 取。将合并的有机物用水 (3x100mL) 洗涤， 干燥 ( 硫酸镁 ) 并蒸发， 得到几乎无色的油状物 1 (26.5g)， 将其不需纯化而使用。 H NMR(CDCl3)δ2.68(2H， t)， 2.94(2H， t)， 5.01(2H， s)， 5.11(2H， s)， 6.78-6.82(3H， m)， 7.17-7.43(11H， m).
制备例 2
3-{3-[( 苯基甲基 ) 氧基 ] 苯基 } 丙酸
将 3-{3-[( 苯基甲基 ) 氧基 ] 苯基 } 丙酸苯甲基酯 (26.5g， 76mmol) 和 2M 氢氧化 钠水溶液 (115ml， 229mmol) 在乙醇 (250ml) 中的混合物在 60℃下搅拌 30 分钟， 然后蒸发乙 醇。将残余物用水 (200mL) 稀释， 并用乙醚 (2x150mL) 萃取。将水相用 2M 的 HCl 水溶液酸 化， 并用乙醚 (250ml 和 100ml) 萃取， 然后将合并的乙醚萃取液干燥 ( 硫酸镁 )， 并蒸发， 得 到白色固体 (19.6g)。m/z(ES-)255[M-H] 。
制备例 3
3-{3-[( 苯基甲基 ) 氧基 ] 苯基 } 丙酰胺
在 -10℃下， 将氯甲酸乙酯 (8.08ml， 84mmol) 滴加到 3-{3-[( 苯基甲基 ) 氧基 ] 苯 基 } 丙酸 (19.6g， 76mmol) 和三乙胺 (11.7ml， 84mmol) 的 THF(250ml) 溶液中， 生成白色悬浮 液。将该混合物于 -10℃搅拌 15 分钟， 然后以一批加入氨水 (120ml， 1830mmol)， 并用 2 小 时的时间温热至室温。将 THF 蒸除， 并将含水悬浮液用 DCM(200ml 和 2x50mL) 萃取。将合 并的有机物干燥 ( 硫酸镁 )， 蒸发， 悬浮于乙醚中， 并过滤出来， 得到白色固体 (16.2g)。m/ + z(ES+)256[M+H] 。
制备例 4
(3-{3-[( 苯基甲基 ) 氧基 ] 苯基 } 丙基 ) 胺
在氩气下， 在冰浴冷却下， 用 15 分钟的时间， 将 3-{3-[( 苯基甲基 ) 氧基 ] 苯基 } 丙酰胺 (16.13g， 63.2mmol) 的 THF(350ml) 溶液加入到搅拌下的 LiAlH4 溶液 (1M 的 THF 溶 液， 126ml， 126mmol) 中。然后将该混合物于 65℃搅拌 2 小时， 随后冷却至 0℃， 并通过小心 地加入水 (4.8mL)、 15％氢氧化钠水溶液 (4.8mL) 和水 (14.4ml)( 所有都在冰冷却下 ) 来 终止。将该混合物过滤， 蒸发， 再溶于 DCM(200mL) 中， 然后用水 (100mL) 洗涤， 干燥 ( 硫酸 镁 ) 并蒸发， 得到蜡状固体。将其在乙酸乙酯 (200mL) 和 2M 氢氧化钠水溶液 (150mL) 之间 分配， 然后过滤， 并分离。将有机相干燥 ( 硫酸镁 ) 并蒸发， 得到无色油状物 (14.1g)。m/ + z(ES+)242[M+H] 。
制备例 5
4- 氧代 -4-[(3-{3-[( 苯基甲基 ) 氧基 ] 苯基 } 丙基 ) 氨基 ] 丁酸甲酯
将 4- 氯 -4- 氧代丁酸甲酯 (1.58g， 10.5mmol) 滴加到搅拌下的 (3-{3-[( 苯基甲 基 ) 氧基 ] 苯基 } 丙基 ) 胺 (2.41g， 9.99mmol) 和三乙胺 (1.53ml， 11.0mmol) 的 DCM(30ml) 溶液中， 同时冰浴冷却。将该混合物搅拌 30 分钟， 然后用 2M 的盐酸水溶液 (30mL) 洗涤， 干 燥 ( 硫酸镁 )， 蒸发， 并通过快速色谱法 ( 乙酸乙酯 / 异己烷， 1 ∶ 1) 纯化， 得到树胶状物， + 将其刮擦 (scratching) 来结晶 (1.91g)。m/z(ES+)356[M+H] 。
制备例 6
3-{7-[( 苯基甲基 ) 氧基 ]-2， 3， 4， 5- 四氢 -1H-2- 苯并氮杂-1- 基 } 丙酸甲酯在氩气下， 将 4- 氧代 -4-[(3-{3-[( 苯基甲基 ) 氧基 ] 苯基 } 丙基 ) 氨基 ] 丁酸 甲酯 (10.4g， 29.3mmol) 和磷酰氯 (8.95ml， 96mmol) 的 MeCN(250ml) 溶液在回流下搅拌 2.5 小时， 然后冷却并蒸发。将残余物溶于甲醇 (150mL) 中， 冷却至 0℃， 然后用 25 分钟的时间 分批加入硼氢化钠 (7.65g， 202mmol)， 并将混合物静置 16 小时。加入水 (600ml)， 然后将混 合物用 DCM(200ml 和 2x75mL) 萃取。将合并的有机物干燥 ( 硫酸镁 )， 蒸发， 并通过快速色 谱法 (3％甲醇的 DCM 溶液， 然后 10％甲醇的 DCM 溶液 ) 纯化， 得到粘稠的淡褐色树胶状物 (4.2g， LCMS ： 62％纯 )。其不需进一步纯化用于制备例 7。m/z(ES+)340[M+H]+。
制备例 7
1-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-7-[( 苯基甲基 ) 氧基 ]-1， 3， 4， 5- 四氢 -2H-2- 苯
并氮杂
-2- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
将 BOC- 酐 (3.16ml， 13.6mmol) 加入到 3-{7-[( 苯基甲基 ) 氧基 ]-2， 3， 4， 5- 四 -1- 基 } 丙酸甲酯 (4.2g， 12.4mmol) 和三乙胺 (2.07ml， 14.9mmol)氢 -1H-2- 苯并氮杂的 DCM(50mL) 溶液中， 并在室温下搅拌 1 小时。将反应混合物用水 (50mL) 洗涤， 干燥 ( 硫 酸镁 )， 蒸发， 并通过快速色谱法 ( 乙酸乙酯 / 异己烷， 1 ∶ 4) 纯化两次， 得到无色树胶状物 (1.81g)。LCMS ： 剩余 4％的杂质。将其不需进一步纯化用于制备例 8。m/z(ES+)440[M+H]+。
制备例 8
7- 羟基 -1-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-1， 3， 4， 5- 四氢 -2H-2- 苯并氮杂-2- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
在 50℃下， 在连续的气流下将 1-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-7-[( 苯基甲基 ) 氧 -2- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (0.088g， 0.200mmol)基 ]-1， 3， 4， 5- 四氢 -2H-2- 苯并氮杂的甲醇 (4ml) 溶液氢化。蒸发得到无色树胶状物 (55mg)。m/z(ES+)350[M+H]+。
制备例 9
1-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-7-{[( 三氟甲基 ) 磺酰基 ] 氧基 }-1， 3， 4， 5- 四 氢 -2H-2- 苯并氮杂
-2- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
将三氟甲磺酸酐 (0.041ml， 0.240mmol) 加入到 7- 羟基 -1-[3-( 甲氧基 )-3- 氧 -2- 甲 酸 1， 1- 二 甲 基 乙 基 酯 (0.070g，代 丙 基 ]-1， 3， 4， 5- 四 氢 -2H-2- 苯 并 氮 杂0.200mmol) 的吡啶 (2mL) 溶液中， 并在室温下搅拌 30 分钟， 加入乙醚 (40mL)， 然后将混合 物用 2M 的 HCl 水溶液 (20mL)、 水 (20mL) 洗涤， 干燥 ( 硫酸镁 ) 并蒸发， 得到浅黄色树胶状 + 物质 (95mg)。m/z(ES+)482[M+H] 。
制备例 107- 氰基 -1-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-1， 3， 4， 5- 四氢 -2H-2- 苯并氮杂-2- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
在氩气下， 将 1-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-7-{[( 三氟甲基 ) 磺酰基 ] 氧基 }-1， -2- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (1.8g， 3.74mmol)、 氰化锌3， 4， 5- 四氢 -2H-2- 苯并氮杂(0.878g， 7.48mmol) 和四 ( 三苯基膦 ) 合钯 (0.864g， 0.748mmol) 在 DMF(15ml) 中的混合物 于 90℃搅拌 18 小时， 然后冷却至室温， 并用水 / 乙酸乙酯 ( 每个 60ml) 稀释。将有机层用 水 (3x20mL) 洗涤， 干燥 ( 硫酸镁 )， 并通过快速色谱法 ( 乙酸乙酯 / 异己烷， 1 ∶ 3) 纯化， + 得到无色树胶状物 (608mg)。m/z(ES+)359[M+H] 。
制备例 11
7-[( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-1-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-1， 3， 4， 5- 四 氢 -2H-2- 苯并氮杂
-2- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
将 7- 氰基 -1-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-1， 3， 4， 5- 四氢 -2H-2- 苯并氮杂-2- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (0.072g， 0.201mmol)、 羟基胺盐酸盐 (0.028g， 0.402mmol) 和 碳酸氢钠 (0.067g， 0.804mmol) 在乙醇 (4ml) 中的混合物于 60℃搅拌 3 小时， 然后在室温下 静置 64 小时。加入乙酸乙酯 (40ml)， 并将混合物用水 (50mL) 洗涤， 干燥 ( 硫酸镁 ) 并蒸 + 发， 得到无色树胶状物 (80mg， LCMS ： 81％纯 )。m/z(ES+)392[M+H] 。
制备例 12 7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4二唑 -3- 基 )-1-[3-( 甲 -2- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯氧基 )-3- 氧代丙基 ]-1， 3， 4， 5- 四氢 -2H-2- 苯并氮杂
将 7-[( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-1-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-1， 3， 4， 5- 四 -2- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (0.57g， 1.46mmol)、 3- 氯 -4-[(1- 甲23氢 -2H-2- 苯并氮杂101945865 A CN 101945873说明书21/51 页基乙基 ) 氧基 ] 苯甲酸 (Paragos Product， 0.344g， 1.60mmol)， EDC(0.307g， 1.60mmol) 和 HOBt(0.245g， 1.60mmol) 在 DMF(8ml) 中的混合物在室温下搅拌 20 分钟， 然后于 120℃加热 3 小时。将该反应冷却至室温， 并用乙酸乙酯 / 水 ( 每个 80ml) 稀释。将有机相用饱和的碳 酸氢钠水溶液和水 (3x 20mL) 洗涤， 然后干燥 ( 硫酸镁 )， 蒸发， 并通过快速色谱法 ( 乙酸乙 酯 / 异己烷， 1 ∶ 3) 纯化， 得到白色泡沫状物质 (515mg)。m/z(ES+)570[M+H]+。
制备例 13
3-(7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-2-{[(1， -1- 基 ) 丙酸1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1H-2- 苯并氮杂
将 2M 氢 氧 化 钠 水 溶 液 (0.5ml， 1.0mmol) 加 入 到 7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲 基 乙 二唑 -3- 基 )-1-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-1， 3， 4， 5- 四 -2- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (0.090g， 0.16mmol) 的乙醇 (4mL) 溶基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4氢 -2H-2- 苯并氮杂液中， 并在室温下搅拌 17 小时。将该混合物蒸发， 并将残余物在水和乙醚之间分配， 然后用 2M 的 HCl 水溶液酸化。将有机相干燥 ( 硫酸镁 ) 并蒸发， 得到白色泡沫状物质 (86mg)。m/ + z(ES+)556[M+H] 。
制备例 14
3-[7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-1- 基 ] 丙酸甲酯二唑 -3- 基 )-2， 3，4， 5- 四氢 -1H-2- 苯并氮杂
将三氟乙酸 (1ml， 12.98mmol) 加入到 7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯 二唑 -3- 基 )-1-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-1， 3， 4， 5- 四氢 -2H-2- 苯并 -2- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (0.10g， 0.175mmol) 的 DCM(1mL) 溶液中， 并在室温下基 }-1， 2， 4氮杂搅拌 30 分钟。将该溶液蒸发， 再溶于乙醚 (30mL) 中， 用 1M 碳酸钾水溶液洗涤， 干燥 ( 硫酸 + 镁 ) 并蒸发， 得到无色树胶状物 (71mg)。m/z(ES+)470[M+H] 。
制备例 15
4-[({4- 溴 -2-[( 甲氧基 ) 羰基 ] 苯基 } 氧基 ) 甲基 ]-2， 2- 二甲基 -1， 3-唑烷 -3- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
将 DIAD(6.40ml， 32.9mmol) 加 入 到 4-( 羟 基 甲 基 )-2， 2- 二 甲 基 -1， 3-唑烷 -3- 甲 酸 1， 1- 二 甲 基 乙 基 酯 (6.92g， 29.9mmol)、 5- 溴 -2- 羟 基 苯 甲 酸 甲 酯 (6.91g， 29.9mmol) 和三苯基膦 (8.63g， 32.9mmol) 的甲苯 (70ml) 溶液中， 然后将混合物于 80℃搅 拌 18 小时。将该溶液冷却， 蒸发， 并通过快速色谱法 ( 乙酸乙酯 / 异己烷， 1 ∶ 9) 纯化， 得 + 到无色油状物 (7.56g)。m/z(ES+)344 和 346(1 ∶ 1， [M+H-100] )。
制备例 16
5- 溴 -2-{[2-({[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 } 氨基 )-3- 羟基丙基 ] 氧基 } 苯甲酸甲酯
向 4-[({4- 溴 -2-[( 甲氧基 ) 羰基 ] 苯基 } 氧基 ) 甲基 ]-2， 2- 二甲基 -1， 3-唑烷 -3- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (7.54g， 17.0mmol) 的甲醇 (100ml) 溶液中加入对甲苯磺 酸 (0.10g， 0.53mmol)， 并将混合物在室温下搅拌 16 小时。将该溶液蒸发至干， 并通过快速 色谱法 ( 乙酸乙酯 / 异己烷， 2 ∶ 3) 纯化， 得到无色粘稠的油状物 (5.55g)。m/z(ES+)404 + 和 406(1 ∶ 1， [M+H] )。
制备例 17
7- 溴 -3-( 羟基甲基 )-3， 4- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-5(2H)- 酮将 5- 溴 -2-{[2-({[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 } 氨基 )-3- 羟基丙基 ] 氧基 } 苯甲酸甲酯 (5.52g， 13.7mmol) 溶于 DCM(15mL) 和 TFA(15ml， 195mmol) 中， 并在室温下搅拌 1 小时。将该溶液蒸发， 然后将残余物再溶于甲苯 (60mL) 和三乙胺 (8ml， 57.4mmol) 中， 随 后在回流下加热 2 小时。将该混合物蒸发至干， 再溶于乙酸乙酯 (100mL) 中， 用水 (20mL) 洗涤， 干燥 ( 硫酸镁 ) 并蒸发。将残余物溶于 2M 氨的甲醇溶液 (50mL) 中， 并在室温下搅拌 5 天。蒸发， 并通过快速色谱法 (3.5％甲醇的 DCM 溶液 ) 纯化， 得到白色固体 (2.71g)。m/ + z(ES+)272 和 274(1 ∶ 1， [M+H] )。
制备例 18
25(7- 溴 -2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-3- 基 ) 甲醇101945865 A CN 101945873说明书23/51 页
将 1M 硼烷 -THF 络合物的 THF 溶液 (26.0ml， 26.0mmol) 加入到 7- 溴 -3-( 羟基甲 -5(2H)- 酮 (2.36g， 8.67mmol) 在 THF(5mL) 中的悬浮基 )-3， 4- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂液中， 并将混合物在回流下加热 5 小时， 然后冷却至室温。加入 5M 的 HCl 水溶液 (50ml)， 并 将混合物在回流下加热 1 小时， 然后冷却至室温。蒸发， 并将残余的溶剂与乙醇 (100ml) 共 沸蒸馏， 剩下残余物， 将其再溶于乙醇 (100mL) 和三乙胺 (20mL) 中， 然后再次浓缩。通过快 速色谱法 (5％甲醇的 DCM 溶液 ) 纯化， 得到粗产物， 将其在乙酸乙酯 (300mL) 和水 (100mL) 之间分配。将该混合物用 2M 氢氧化钠水溶液碱化， 然后将有机物干燥 ( 硫酸镁 )， 并蒸发， + 得到白色固体 (1.93g)。m/z(ES+)258 和 260(1 ∶ 1， [M+H] )。
制备例 19
7- 溴 -3-( 羟基甲基 )-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
将 (7- 溴 -2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-3- 基 ) 甲醇 (1.93g， 7.48mmol)和 BOC- 酐 (2.08ml， 8.97mmol) 在 THF(30mL) 和饱和的碳酸氢钠水溶液 (30ml) 中的混合物 在室温下搅拌 2 小时。将该混合物用乙酸乙酯 (100mL) 稀释， 用水 (50mL) 洗涤， 干燥 ( 硫 酸镁 )， 蒸发， 并通过快速色谱法 ( 乙酸乙酯 / 异己烷， 2 ∶ 3) 纯化， 得到白色固体 (2.36g)。 + m/z(ES+)258 和 260(1 ∶ 1， [M+H-100] )。
制备例 20
7- 氰基 -3-( 羟基甲基 )-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
在氩气下， 将 7- 溴 -3-( 羟基甲基 )-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (2.05g， 5.72mmol)、 氰化锌 (1.34g， 11.5mmol) 和四 ( 三苯基膦 ) 合 钯 (0.992g， 0.858mmol) 在 DMF(20ml) 中的混合物于 80℃搅拌 3 小时。将该混合物冷却， 用 乙酸乙酯 / 水 ( 每个 150ml) 稀释， 并将各层分离。将有机相用水 (3x30mL) 洗涤， 干燥 ( 硫 酸镁 )， 蒸发， 并通过快速色谱法 ( 乙酸乙酯 / 异己烷， 1 ∶ 1) 纯化， 得到白色固体 (1.43g)。 + m/z(ES+)205[M+H-100] 。制备例 21 7-[( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-3-( 羟基甲基 )-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
将 7- 氰基 -3-( 羟基甲基 )-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (1.43g， 4.70mmol)、 羟基胺盐酸盐 (0.653g， 9.40mmol) 和碳酸氢钠 (1.974g， 23.5mmol) 在乙醇 (20ml) 中的混合物于 50℃搅拌 15 小时。然后冷却， 并用乙酸乙酯 / 水 ( 每个 100ml) 稀释， 将水层再次用乙酸乙酯 (50mL) 萃取， 然后将合并的有机物干燥 ( 硫酸 镁 ) 并蒸发， 得到白色泡沫状物质 (1.60g)。m/z(ES+)338[M+H]+。
制备例 22 7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4二唑 -3- 基 )-3-( 羟基 -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯甲基 )-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 7-[( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-3-( 羟基甲基 )-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (1.59g， 4.71mmol)、 3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ]苯 甲 酸 (Paragos Product， 1.012g， 4.71mmol)、 HOBt(0.794g， 5.18mmol) 和 EDC(0.994g， 5.18mmol) 在 DMF(20ml) 中的混合物在室温下搅拌 30 分钟， 然后于 100℃加热 5 小时。将 该混合物冷却， 用乙酸乙酯 (150ml) 稀释， 然后用水 (100mL)、 饱和的碳酸氢钠水溶液和水 (3x50mL) 洗涤。蒸发， 然后通过快速色谱法 ( 乙酸乙酯 / 异己烷， 45 ∶ 55) 纯化， 得到白色 + 固体 (673mg)。m/z(ES+)516[M+H] 。
制备例 23
7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-4-{[(1， -3- 甲酸1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 Jones 试剂 [ 由三氧化铬 (0.213g， 2.13mmol) 和硫酸 (184μl， 3.45mmol) 制备， 用水调成 0.8ml] 加入到冰冷却下的 7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2，
4-二唑 -3- 基 )-3-( 羟基甲基 )-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (0.103g， 0.2mmol) 的丙酮 (4mL) 溶液中， 并将生成的混合物在冰中搅拌 2 小 时。加入 IPA(0.5ml)， 随后加入水 (20mL) 和乙酸乙酯 (40mL)。将有机相干燥 ( 硫酸镁 )， 蒸发， 并通过快速色谱法 ( 乙酸乙酯 / 异己烷， 1 ∶ 1， 然后 1％乙酸的乙酸乙酯溶液 / 异己 烷， 1 ∶ 1) 纯化， 得到白色固体 (72mg)。m/z(ES+)530[M+H]+。
制备例 24
7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-3- 甲酰基 -2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
在 氩 气 下，将 Dess-Martin 氧 化 剂 (Dess-Martin periodinane)(0.127g， 二 -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基0.300mmol) 加 入 到 7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4唑 -3- 基 )-3-( 羟基甲基 )-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂酯 (0.155g， 0.30mmol) 的 DCM(5ml) 溶液中， 并将生成的混合物在室温下搅拌 1 小时。加入 DCM(30ml)， 然后将混合物用硫代硫酸钠 (3g) 在饱和的碳酸氢钠水溶液 (20mL) 中的溶液洗 涤。将有机相干燥 ( 硫酸镁 )， 蒸发， 并通过快速色谱法 ( 乙酸乙酯 / 异己烷， 2 ∶ 3) 纯化， + 得到树胶状物质， 将其用乙醚研磨， 得到白色固体 (136mg)。m/z(ES+)513[M ].
制备例 25
7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-3-[(1E)-3-( 乙氧基 )-3- 氧代 -1- 丙烯 -1- 基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
在 氩 气 下， 将 7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-3- 甲酰基 -2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯(0.136g， 0.265mmol) 和 ( 三 苯 基 -15- 膦 ) 乙 酸 乙 酯 (ethyl(triphenyl-15-phosphanyl idene)acetate)(0.101g， 0.291mmol) 在 THF(4ml) 中的混合物在 40 ℃下搅拌 1 小时。蒸 发， 并通过快速色谱法 ( 乙酸乙酯 / 异己烷， 1 ∶ 4) 纯化， 得到无色树胶状物 (109mg)。m/ + z(ES+)584[M+H] 。
制备例 26
7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 428二唑 -3- 基 )-3-[3-( 乙氧基 )-3- 氧代丙基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯101945865 A CN 101945873
说明书26/51 页
将 7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-3-[(1E)-3-( 乙氧基 )-3- 氧代 -1- 丙烯 -1- 基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (0.109g， 0.187mmol) 的乙醇 (20ml) 溶液用 10％ Pd/ C(0.030g， 0.282mmol， 50％水 ) 氢化 45 分钟。然后过滤， 蒸发， 并通过快速色谱法 ( 乙酸乙 酯 / 异己烷， 1 ∶ 4) 纯化， 得到无色树胶状物 (59mg)。m/z(ES+)586[M+H]+。
制备例 27 3-(7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4二唑 -3- 基 )-4-{[(1， -3- 基 ) 丙酸1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 2M 氢氧化钠水溶液 (1.0ml， 2.0mmol) 加入到 7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 二唑 -3- 基 )-3-[3-( 乙氧基 )-3- 氧代丙基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯 -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (0.059g， 0.101mmol) 的乙醇 (4mL) 溶液中，氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4并氧氮杂并在室温下搅拌 2 小时。将该混合物蒸发， 然后在水和乙酸乙酯 ( 每个 25ml) 之间分配， 并 用 2M 的 HCl 水溶液酸化。将有机相干燥 ( 硫酸镁 ) 并蒸发， 得到无色树胶状物 (55mg)。m/ z(ES-)556[M-H] .
制备例 28
(2E)-3-(3- 溴 -2- 羟基苯基 )-2- 丙烯酸乙酯
在室温下， 向 3- 溴 -2- 羟基苯甲醛 (WO9606822 ； 1.005g， 5.0mmol) 的二氯甲烷 (20ml) 溶液中加入 ( 乙氧基羰基亚甲基 ) 三苯基膦 (Aldrich ； 2.09g， 6.0mmol)。将该反应 在室温下搅拌 3 小时， 然后蒸发溶剂。 将残余物通过色谱法纯化， 使用 20％乙酸乙酯的环己 烷溶液洗脱， 得到白色固体的标题化合物 (1.2g)。 MS(ES)C11H11BrO3 计算值 (requires)270， + 272 ； 实测值 (found)271， 273[M+H] 。
制备例 29
(2E)-3-(3- 溴 -2-{[2-({[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 } 氨基 ) 乙基 ] 氧基 } 苯基 )-2- 丙烯酸乙酯
在 0℃下， 向 (2E)-3-(3- 溴 -2- 羟基苯基 )-2- 丙烯酸乙酯 ( 制备例 28)(870mg， 3.21mmol)、 (2- 羟基乙基 ) 氨基甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 (Aldrich ； 517mg， 3.21mmol) 和三 苯基膦 (926mg， 3.53mmol) 的四氢呋喃 (20ml) 溶液中加入偶氮二甲酸二异丙基酯 (714mg， 3.53mmol)。将反应混合物在室温下搅拌 2 小时。蒸发溶剂， 并将残余物溶于乙酸乙酯中， 然后用盐水洗涤两次。 将有机相干燥， 并蒸发。 通过色谱法纯化， 使用 20％乙酸乙酯的环己 烷溶液洗脱， 得到产物， 为无色油状物 (1.23g)。MS(ES)C18H24BrNO5 计算值 413， 415 ； 实测值 + 414， 416[M+H] 。
制备例 30
(2E)-3-{2-[(2- 氨基乙基 ) 氧基 ]-3- 溴苯基 }-2- 丙烯酸乙酯三氟乙酸盐
在冰浴中， 向 (2E)-3-(3- 溴 -2-{[2-({[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 } 氨基 ) 乙基 ] 氧基 } 苯基 )-2- 丙烯酸乙酯 ( 制备例 29)(0.207g， 0.5mmol) 的二氯甲烷 (4ml) 溶 液中缓慢地加入三氟乙酸 (1mL)。1 小时后， 将反应混合物浓缩至干， 并将残余物与乙醚共 沸。将残余物真空干燥， 得到粗产物， 为油状物 (0.214g)。MS(ES)C13H16BrNO3 计算值 313， + 315 ； 实测值 314， 316[M+H] 。
制备例 31
(9- 溴 -2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-5- 基 ) 乙酸乙酯在室温下， 在氮气下， 向 (2E)-3-{2-[(2- 氨基乙基 ) 氧基 ]-3- 溴苯基 }-2- 丙烯 酸乙酯 ( 制备例 30)(1.4g， 4.46mmol) 的四氢呋喃 (40ml) 溶液中加入 1， 8- 二氮杂二环 [5.4.0] 十一碳 -7- 烯 (0.678g， 4.46mmol)， 并将反应混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶 剂， 并将残余物通过色谱法纯化， 使用 0-2％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱， 得到标题化合物， 为 无色油状物 (1.31g)。
MS(ES)C13H16BrNO3 计算值 313， 315 ； 实测值 314， 316[M+H]+。
制备例 32
9- 溴 -5-[2-( 乙氧基 )-2- 氧代乙基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
在 0℃下， 向 (9- 溴 -2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-5- 基 ) 乙酸乙酯 ( 制备例 31)(12.3g， 39.2mmol) 的四氢呋喃 (200ml) 溶液中加入三乙胺 (4.77g， 47.1mmol)， 然 后加入焦碳酸二叔丁基酯 (9.42g， 43.2mmol)。2 分钟后， 除去冰浴， 并将反应混合物在室温 下静置过周末。 蒸发溶剂， 并将残余物通过色谱法纯化， 使用 3-15％乙酸乙酯的环己烷溶液 洗脱， 得到产物， 为无色油状物 (15.7g)。MS(ES)C18H24BrNO5 计算值 413， 415 ； 实测值 ： 414， 416[M+H]+。
制备例 33
9- 氰 基 -5-[2-( 乙 氧 基 )-2- 氧 代 乙 基 ]-2， 3- 二 氢 -1， 4- 苯 并 氧 氮 杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
将 9- 溴 -5-[2-( 乙 氧 基 )-2- 氧 代 乙 基 ]-2， 3- 二 氢 -1， 4- 苯 并 氧 氮 杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 32)(1.02g， 2.47mmol) 的 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF)(7ml) 溶液在真空下除气 15 分钟， 然后加入氰化锌 (348mg， 2.98mmol) 和四 ( 三苯基 膦 ) 合钯 (0)(285mg， 0.247mmol)， 并在氮气下将生成的黄色混合物于 100 ℃搅拌 5 小时。 将冷却的混合物过滤， 并用 DMF 洗涤。将滤液蒸发， 并将残余物在乙酸乙酯和盐水之间分 配。 将合并的有机萃取液用盐水洗涤， 并将有机相干燥， 并蒸发。 通过快速色谱法纯化， 使用 20％乙酸乙酯的环己烷溶液洗脱， 得到标题化合物， 为无色固体 (760mg)。MS(ES)C19H24N2O5 计算值 360 ； 实测值 361[M+H]+。
制备例 34
5-[2-( 乙氧基 )-2- 氧代乙基 ]-9-[-( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
将 9- 氰 基 -5-[2-( 乙 氧 基 )-2- 氧 代 乙 基 ]-2， 3- 二 氢 -1， 4- 苯 并 氧 氮 杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 33)(1.08g， 3.0mmol)、 羟基胺盐酸盐 (521mg， 7.5mmol) 和碳酸氢钠 (630mg， 7.5mmol) 在乙醇 (15ml) 中的混合物回流 5 小时。 将反应混合 物冷却至室温， 通过′ celite′过滤， 并蒸发溶剂。将残余物通过色谱法纯化， 使用 0-5％ 甲醇的二氯甲烷溶液洗脱， 得到标题化合物， 为无色泡沫状物质 (0.968g)。 MS(ES)C19H27N3O6 + 计算值 393 ； 实测值 394[M+H] 。
制备例 35
9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[2-( 乙氧基 )-2- 氧代乙基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
在 氮 气 下， 向 5-[2-( 乙 氧 基 )-2- 氧 代 乙 基 ]-9-[( 羟 基 氨 基 )( 亚 氨 基 ) 甲 -4(5H)- 甲 酸 1， 1- 二 甲 基 乙 基 酯 ( 制 备 例 34)基 ]-2， 3- 二 氢 -1， 4- 苯 并 氧 氮 杂(826mg， 2.09mmol) 和三乙胺 (255mg， 2.52mmol) 的 N， N- 二甲基甲酰胺 (21ml) 溶液中加入 3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯甲酰氯 ( 制备例 41)(401mg， 2.09mmol)。 将该混合物在室 温下搅拌 10 分钟， 然后于 120℃搅拌 20 分钟。20 分钟后， 再加入三乙胺 (51mg.0.504mmol) 和 3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯甲酰氯 (80.2mg， 0.418mmol)， 并将混合物于 120 ℃ 搅拌 6 小时。将该混合物冷却至室温， 并将溶剂蒸发。将残余物溶于乙酸乙酯中， 并将该 溶液用 2N 氢氧化钠、 然后用盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4) 并蒸发。将残余物通过色谱法纯化， 使用 20％乙酸乙酯的环己烷溶液洗脱， 得到标题化合物， 为泡沫状物质 (740mg)。MS(ES) + 35 C29H34 ClN3O7 计算值 571 ； 实测值 572[M+H] 。
制备例 36
(9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-4-{[(1， -5- 基 ) 乙酸钠盐1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[2-( 乙氧基 )-2- 氧代乙基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 35)(120mg， 0.21mmol)、 乙醇 (1mL) 和 2M 氢氧化钠 (2ml) 的混 合物于 60℃搅拌 1 小时。将反应混合物冷却， 并蒸发溶剂。将残余物悬浮于水 (2mL) 中， 并 用乙酸乙酯 (2x2mL) 萃取。将合并的萃取液干燥 (Na2SO4) 并蒸发。将残余物用乙醚研磨， 得到标题化合物， 为无色固体 (90mg)。
MS(ES)C27H30ClN3O7 计算值 543 ； 实测值 544[M+H]+。
制备例 37
9-(5-{3- 氰 基 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[2-( 乙氧基 )-2- 氧代乙基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 1， 1- 二甲基乙基酯
-4(5H)- 甲酸i) 将草酰氯 (152mg， 105μl， 1.2mmol) 加入到搅拌下的 3- 氰基 -4-[(1- 甲基乙 基 ) 氧基 ] 苯甲酸 (WO2001002355 ； 205mg， 1mmol) 的无水二氯甲烷 (5ml) 溶液中， 随后加入 N， N- 二甲基甲酰胺 (1 滴， 催化剂 )， 并将反应混合物在室温下搅拌 1 小时。然后将溶剂蒸 发， 并将残余物真空干燥 30 分钟。
ii) 将粗的酰基氯 ( 步骤 i)(1mmol) 的乙腈 (5ml) 溶液滴加到搅拌下的 5-[2-( 乙
氧基 )-2- 氧代乙基 ]-9-[( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 34)(393mg， 1mmol) 和三乙胺 (121mg， 167μl， 1.2mmol) 的乙腈 (5mL) 溶液中， 并将混合物在室温下搅拌 1 小时， 然后加热回流 72 小时。 将反应混合物冷却， 并蒸发溶剂。将残余物通过色谱法纯化， 使用 15-25％乙酸乙酯的环己 烷溶液洗脱， 得到标题化合物， 为无色油状物 (180mg)。
MS(ES)C30H34N4O7 计算值 562 ； 实测值 563[M+H]+。
制备例 3833101945865 A CN 101945873
说明书-5- 基 ) 乙酸31/51 页(9-(5-{3- 氰基 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-4-{[(1，1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 9-(5-{3- 氰 基 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[2-( 乙氧基 )-2- 氧代乙基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 37)(170mg， 0.30mmol)、 2M 氢氧化钠 (2mL) 和乙醇 (4ml) 的混合 物于 60℃搅拌 1 小时。将反应混合物冷却至室温， 并将乙醇蒸发。将残余物用水 (5mL) 稀 释， 并用冰醋酸酸化。 将该混合物用乙酸乙酯 (3x5mL) 萃取。 将合并的萃取液干燥 (Na2SO4) 并蒸发。将残余物在高真空下干燥， 得到标题化合物， 为无色泡沫状物质 (150mg)。MS(ES) + C28H30N4O7 计算值 534 ； 实测值 535[M+H] 。
制备例 39 9-(5-{5- 氯 -6-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ]-3- 吡 啶 基 }-1， 2， 4二 -4(5H)- 甲酸唑 -3- 基 )-5-[2-( 乙氧基 )-2- 氧代乙基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 1， 1- 二甲基乙基酯
i) 将草酰氯 (152mg， 105μl， 1.2mmol) 加入到搅拌下的 5- 氯 -6-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ]-3- 吡啶甲酸 (WO9702244 ； 215mg， 1mmol) 的无水二氯甲烷 (5ml) 溶液中， 随后加入 DMF(1 滴， 催化剂 )， 并将反应混合物在室温下搅拌 1 小时。蒸发溶剂， 并将残余物真空干燥 30 分钟。
ii) 将粗的酰基氯 ( 步骤 i)(1mmol) 的乙腈 (5ml) 溶液滴加到搅拌下的 5-[2-( 乙
氧基 )-2- 氧代乙基 ]-9-[( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 34)(393mg， 1mmol) 和三乙胺 (121mg， 167μl， 1.2mmol) 的乙腈 (5mL) 溶液中， 并将混合物在室温下搅拌 1 小时， 然后加热回流 72 小时。 将反应混合物冷却， 并蒸发溶剂， 并将残余物通过色谱法纯化。使用 15-25％乙酸乙酯的环己烷溶液洗脱， 得到标题化合物， 为浅黄色油状物 (180mg)。 35
MS(ES)C28H33 ClN4O7 计算值 572 ； 实测值 573[M+H]+。
制备例 40
(9-(5-{5- 氯 -6-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ]-3- 吡 啶 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-4-{[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 -5- 基 ) 乙酸
将 9-(5-{5- 氯 -6-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ]-3- 吡 啶 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[2-( 乙氧基 )-2- 氧代乙基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 39)(170mg， 0.30mmol)、 2M 氢氧化钠 (5mL) 和乙醇 (8ml) 的混合 物于 60℃搅拌 1 小时。将反应混合物冷却至室温， 并将乙醇蒸发。将残余物用水 (10mL) 稀 释， 并用冰醋酸酸化。 将该混合物用乙酸乙酯 (3x5mL) 萃取。 将合并的萃取液干燥 (Na2SO4) 并蒸发。将残余物在高真空下干燥， 得到标题化合物， 为无色泡沫状物质 (150mg)。MS(ES) + 35 C26H29 ClN4O7 计算值 544 ； 实测值 545[M+H] 。
制备例 41
3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯甲酰氯
向 圆 底 烧 瓶 中 装 入 3- 氯 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 甲 酸 (Paragos ProductList， 10.2g， 47.5mmol)、 二氯甲烷 (158mL) 和草酰氯 (8.29ml， 95mmol)。将反应 混合物在冰 / 水浴中冷却至 0℃， 随后加入 N， N- 二甲基甲酰胺 (0.158mL)。将该溶液温热 至环境温度过夜。蒸发溶剂得到标题化合物， 为米色固体 (11.4g)。δH(CDCl3， 400MHz) ： 1.44(6H， d)， 4.73(1H， 七重峰 )， 6.98(1H， d)， 8.0(1H， dd)， 7.98(1H， d).
制备例 42
9- 氰基 -5-(2- 羟基乙基 )-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
向 9- 氰 基 -5-[2-( 乙 氧 基 )-2- 氧 代 乙 基 ]-2， 3- 二 氢 -1， 4- 苯 并 氧 氮 杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 33)(282mg， 0.78mmol) 的乙醇 (5ml) 溶液中加入 2.0M 硼氢化锂的 THF 溶液 (0.587ml， 1.17mmol)。在室温下搅拌 1 小时后， 加入乙醚 (5ml)。 30 分钟后， 加入 2.0M 硼氢化锂的 THF 溶液 (0.500ml， 1.0mmol)， 并将反应混合物在室温下 搅拌 3 天。将悬浮液溶于甲醇 (40mL) 中， 并于 0℃用 2M 盐酸终止。蒸发大部分的溶剂。将 残余物用乙酸乙酯稀释， 并用盐水洗涤。将有机相干燥， 并蒸发， 得到标题化合物 (224mg)。 + MS(ES)C17H22N2O4 计算值 318 ； 实测值 319[M+H] 。
制备例 43
9- 氰基 -5-[(2E)-4-( 乙氧基 )-4- 氧代 -2- 丁烯 -1- 基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并 氧氮杂
-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯在氮气下， 于 -78 ℃， 用 5 分钟的时间， 向草酰氯 (777mg， 0.54ml， 6.12mmol) 的二 氯甲烷 (25ml) 溶液中加入二甲基亚砜 (552mg， 0.50ml， 7.07mmol) 的二氯甲烷 (5ml) 溶液。
10 分钟后， 加入 9- 氰基 -5-(2- 羟基乙基 )-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 42)(1.50g， 4.71mmol) 的二氯甲烷 (10ml) 溶液。将反应混合 物于 -78℃搅拌 70 分钟， 然后用 2 分钟的时间滴加三乙胺 (1.43g， 1.97ml， 14.1mmol)。将 该混合物温热至室温。40 分钟后， 加入 ( 三苯基膦 (triphenylphosphorylidene)) 乙酸乙 酯 (1.97g， 5.65mmol) 的二氯甲烷 (20ml) 溶液。将反应混合物在室温下搅拌 1 小时。蒸 发溶剂， 并将残余物在乙酸乙酯和盐水之间分配。分离有机相， 干燥， 并蒸发。通过色谱法 纯化， 使用 0-50％乙酸乙酯的环己烷溶液洗脱， 得到标题化合物， 为无色油状物。(1.76g)。 + 实测值 387[M+H] 。 MS(ES)C21H26N2O5 计算值 386 ；
制备例 44
9- 氰 基 -5-[4-( 乙 氧 基 )-4- 氧 代 丁 基 ]-2， 3- 二 氢 -1， 4- 苯 并 氧 氮 杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
将 9- 氰基 -5-[(2E)-4-( 乙氧基 )-4- 氧代 -2- 丁烯 -1- 基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯 -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 43)(780mg， 2.02mmol) 和 10％钯 /并氧氮杂碳、 50％水浆 (430mg) 在乙醇 (30ml) 中的混合物在氢气气氛下搅拌 90 分钟。将反应混合 物通过 ‘celite’ 过滤， 并将滤液蒸发， 得到标题化合物 (680mg)。MS(ES)C21H28N2O5 计算值 + 388 ； 实测值 389[M+H] 。
制备例 45
5-[4-( 乙氧基 )-4- 氧代丁基 ]-9-[( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
将 9- 氰 基 -5-[4-( 乙 氧 基 )-4- 氧 代 丁 基 ]-2， 3- 二 氢 -1， 4- 苯 并 氧 氮 杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 44)(750mg， 1.93mmol)、 羟基胺盐酸盐 (335mg， 4.83mmol) 和碳酸氢钠 (405mg， 4.83mmol) 在乙醇 (10ml) 中的混合物于 70℃搅拌 24 小时。 将反应混合物冷却， 并通过 ‘celite’ 过滤。将滤液蒸发， 得到无色树胶状物 (814mg)， 其不 + 需进一步纯化用于制备例 46。MS(ES)C21H31N3O6 计算值 421 ； 实测值 422[M+H] 。
制备例 46
9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[4-( 乙氧基 )-4- 氧代丁基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
将草酰氯 (152mg， 105μl， 1.20mmol) 加入到搅拌下的 3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯甲酸 (Paragos Product List， 215mg， 1.00mmol) 的无水二氯甲烷 (10ml) 溶液中，随后加入 DMF(1 滴 )， 将反应混合物在室温下搅拌 1 小时， 然后将溶剂蒸发， 并将残余物真 空干燥 30 分钟。将粗的酰基氯 (1.00mmol) 的乙腈 (5ml) 溶液滴加到搅拌下的 5-[4-( 乙 氧基 )-4- 氧代丁基 ]-9-[( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 45)(270mg， 0.64mmol) 和三乙胺 (121mg， 167μl， 1.2mmol) 的乙腈 (5mL) 溶液中， 并在室温下搅拌 1 小时。将反应混合物加热回流 72 小时， 然后冷却至室温， 并将溶剂蒸发。将残余物通过色谱法纯化， 使用 15-25％乙酸乙酯的环己 烷溶液洗脱， 得到无色油状的标题化合物 (70mg)。MS(ES)C31H3835ClN3O7 计算值 599 ； 实测值 600[M+H]+。
制备例 47
9-(5-{3- 氰 基 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[4-( 乙氧基 )-4- 氧代丁基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 1， 1- 二甲基乙基酯
-4(5H)- 甲酸将草酰氯 (152mg， 105μl， 1.20mmol) 加入到搅拌下的 3- 氰基 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯甲酸 (WO2001002355 ； 205mg， 1.00mmol) 的无水二氯甲烷 (10ml) 溶液中， 随后加入 DMF(1 滴 )， 将反应混合物在室温下搅拌 1 小时。蒸发溶剂， 并将残余物真空干燥 30 分钟。 将粗的酰基氯 (1.00mmol) 的乙腈 (5ml) 溶液滴加到搅拌下的 5-[4-( 乙氧基 )-4- 氧代丁
基 ]-9-[( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1，1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 45)(270mg， 0.64mmol) 和三乙胺 (121mg， 167μl， 1.20mmol) 的乙 腈 (5mL) 溶液中， 并在室温下搅拌 1 小时。然后将反应混合物加热回流 72 小时， 然后冷却 至室温， 并将溶剂蒸发。将残余物通过色谱法纯化， 使用 15-25％乙酸乙酯的环己烷溶液洗 实测值 591[M+H]+。 脱， 得到无色油状的标题化合物 (120mg)。MS(ES)C32H38N4O7 计算值 590 ；
制备例 48
9-(5-{5- 氯 -6-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ]-3- 吡 啶 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[4-( 乙氧基 )-4- 氧代丁基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 1， 1- 二甲基乙基酯
-4(5H)- 甲酸
将草酰氯 (152mg， 105μl， 1.20mmol) 加入到搅拌下的 5- 氯 -6-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ]-3- 吡啶甲酸 (WO9702244 ； 215mg， 1.00mmol) 的无水二氯甲烷 (10ml) 溶液中， 随后加 入 DMF(1 滴 )。将反应混合物在室温下搅拌 1 小时。蒸发溶剂， 并将残余物真空干燥 30 分 钟。将粗的酰基氯 (1.00mmol) 的乙腈 (5ml) 溶液滴加到搅拌下的 5-[4-( 乙氧基 )-4- 氧 代丁基 ]-9-[( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 -4(5H)- 甲酸1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 45)(270mg， 0.64mmol) 和三乙胺 (121mg， 167μl， 1.20mmol) 的 溶液乙腈 (5mL) 中， 并在室温下搅拌 1 小时。将反应混合物加热回流 72 小时， 然后冷却至 室温， 并将溶剂蒸发。 将残余物通过色谱法纯化， 使用 15-25％乙酸乙酯的环己烷溶液洗脱， 得到无色油状的标题化合物， 将其静置固化 (147mg)。.MS(ES)C30H3735ClN4O7 计算值 600 ； 实 + 测值 601[M+H] 。
制备例 49
4-(9-(5-{3- 氰 基 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-4-{[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 -5- 基 ) 丁酸
将 9-(5-{3- 氰 基 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[4-( 乙氧基 )-4- 氧代丁基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 47)(120mg， 0.20mmol)、 2M 氢氧化钠 (2mL) 和乙醇 (2ml) 的混 合物于 50℃搅拌 2 小时。将反应混合物冷却至室温， 并将溶剂蒸发。将残余物用水 (10mL) 稀释， 并用冰醋酸酸化。将该混合物用乙酸乙酯 (3x5mL) 萃取， 并将合并的有机物干燥， 并 蒸发。将残余物用异己烷 / 乙醚的混合物研磨， 得到固体的标题化合物 (80mg)。MS(ES) + C30H34N4O7 计算值 562 ； 实测值 563[M+H] 。
制备例 50
4-(9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 439二唑 -3- 基 )-4-{[(1，101945865 A CN 101945873说明书-5- 基 ) 丁酸37/51 页1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[4-( 乙氧基 )-4- 氧代丁基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 46)(70mg， 0.12mmol)、 2M 氢氧化钠 (2mL) 和乙醇 (2ml) 的混 合物于 50℃搅拌 2 小时。将反应混合物冷却至室温， 并将溶剂蒸发。将残余物用水 (10mL) 稀释， 并用冰醋酸酸化。将该混合物用乙酸乙酯 (3x5mL) 萃取， 并将合并的有机物干燥， 并 蒸发。将残余物用异己烷 / 乙醚的混合物研磨， 得到固体的标题化合物 (63mg)。MS(ES) + 35 C29H34 ClN3O7 计算值 571 ； 实测值 572[M+H] 。
制备例 51 4-(9-(5-{5- 氯 -6-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ]-3- 吡 啶 基 }-1， 2， 4二唑 -3- 基 )-4-{[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 -5- 基 ) 丁酸
将 9-(5-{5- 氯 -6-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ]-3- 吡 啶 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[4-( 乙氧基 )-4- 氧代丁基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 48)(145mg， 0.24mmol)、 2M 氢氧化钠 (2mL) 和乙醇 (2ml) 的混 合物于 50℃搅拌 2 小时。将反应混合物冷却至室温， 并将溶剂蒸发。将残余物用水 (10mL) 稀释， 并用冰醋酸酸化。将该混合物用乙酸乙酯 (3x5mL) 萃取， 并将合并的有机物干燥， 并 35 蒸发。将残余物用异己烷研磨， 得到固体的标题化合物 (l47mg)。MS(ES)C28H33 ClN4O7 计算 + 值 572 ； 实测值 573[M+H] 。
制备例 52
9- 氰基 -5-(2- 氧代乙基 )-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯在 -78℃下， 将二甲基亚砜 (0.504g， 6.45mmol) 的二氯甲烷 (3ml) 溶液滴加到草酰 氯 (710mg， 5.59mmol) 的二氯甲烷 (40ml) 溶液中。15 分钟后， 用 5 分钟的时间加入 9- 氰
基 -5-(2- 羟基乙基 )-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 42)(1.37g， 4.30mmol) 的二氯甲烷 (20ml) 溶液， 并将混合物于 -78℃搅拌 1 小时， 然后 加入三乙胺 (1.31g， 12.91mmol)， 并将混合物再搅拌 5 分钟。 用 45 分钟的时间， 将该混合物 温热至室温。蒸发溶剂， 并将残余物在水和乙酸乙酯之间分配。将有机萃取液用盐水洗涤， 并干燥 (MgSO4)。蒸发溶剂， 得到粗的标题化合物， 为浅黄色油状物。将其在随后的步骤中 以粗物质使用。
C17H20N2O4 计算值 316 ； 实测值 317[M+H]+。 制备例 53 1 ∶ 1 的 9- 氰 基 -5-[(2Z)-3-( 甲 氧 基 )-2- 丙 烯 -1- 基 ]-2， 3- 二 氢 -1， 4- 苯 -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯和 9- 氰基 -5-[(2E)-3-( 甲氧基 )-2- 丙 -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯并氧氮杂
烯 -1- 基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂在 0 ℃下在氮气下， 将二异丙基氨基化锂 (LDA)(0.5M 的 THF 溶液 ； 5.16mmol) 滴 加到甲氧基甲基二苯基氧化膦 (1.376g， 5.59mmol) 的无水 THF(20ml) 溶液中。将该混合 物于 0 ℃搅拌 10 分钟， 随后冷却至 -78 ℃。然后滴加 9- 氰基 -5-(2- 氧代乙基 )-2， 3- 二
氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 52)(1.36g， 4.30mmol)的 THF(10ml) 溶液。将该混合物搅拌 5 分钟， 除去冰浴， 并用 40 分钟的时间将该混合物温 热至室温。加入饱和的氯化铵， 并将反应混合物用乙醚萃取。将合并的有机萃取液用盐水 洗涤， 干燥 (MgSO4) 并蒸发， 得到浅黄色泡沫状物质。 将该物质溶于 THF(30ml) 中， 然后分批 加入氢化钠 (60％ ； 430mg， 4.30mmol)， 并将混合物搅拌过夜。于 0℃加入甲醇 (3ml)， 并将 混合物在氯化铵和乙醚之间分配。将有机萃取液用盐水洗涤， 并干燥 (MgSO4)。蒸发溶剂， 并将残余物通过色谱法纯化， 使用 5-25％乙酸乙酯的环己烷溶液洗脱， 得到标题化合物的 实测值 345[M+H]+。 1 ∶ 1 混合物， 为无色油状物 (624mg)。MS(ES)C19H24N2O4 计算值 344 ；
制备例 54
9- 氰 基 -5-[3-( 甲 氧 基 )-3- 氧 代 丙 基 ]-2， 3- 二 氢 -1， 4- 苯 并 氧 氮 杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
在室温下， 将 1 ∶ 1 的 9- 氰基 -5-[(2Z)-3-( 甲氧基 )-2- 丙烯 -1- 基 ]-2， 3- 二 -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯和 9- 氰基 -5-[(2E)-3-( 甲氧 -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯氢 -1， 4- 苯并氧氮杂基 )-2- 丙烯 -1- 基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂( 制备例 53)(625mg， 1.81mmol) 在二氯甲烷 (10ml) 中的混合物快速加入到氯铬酸吡啶 (PCC ； 782mg， 3.63mmol) 的二氯甲烷 (10ml) 悬浮液中。将该混合物搅拌过夜， 然后加入另 外的 PCC(782mg， 3.63mmol)。将反应混合物再搅拌 24 小时， 然后加入另外的 PCC(782mg， 3.63mmol)， 并将混合物再搅拌 24 小时。 将该混合物通过 过滤， 用二氯甲烷洗涤。 蒸 发溶剂， 并将残余物通过色谱法纯化， 使用 5-25％乙酸乙酯的环己烷溶液洗脱， 得到无色油 + 状的标题化合物 (364mg)。MS(ES)C19H24N2O5 计算值 360 ； 实测值 361[M+H] 。
制备例 55 9-[( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-5-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-2， 3- 二氢 -1， -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯4- 苯并氧氮杂
将 9- 氰 基 -5-[3-( 甲 氧 基 )-3- 氧 代 丙 基 ]-2， 3- 二 氢 -1， 4- 苯 并 氧 氮 杂-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 54)(360mg， 1.00mmol)、 羟基胺盐酸盐 (174mg， 2.50mmol) 和碳酸氢钠 (210mg， 2.50mmol) 在甲醇 (10ml) 中的混合物加热回流 24 小时。加 入另一批的羟基胺盐酸盐 (70mg， 1.00mmol) 和碳酸氢钠 (84mg， l.00mmol) 后， 并继续回流 24 小时。将反应混合物冷却， 并通过 过滤。蒸发溶剂， 得到标题化合物， 为无色固体 (393mg)， 其不需进一步纯化而使用。MS(ES)C19H27N3O6 计算值 393 ； 实测值 394[M+H]+。
制备例 56
9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
-4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯
将 9-[( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-5-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-2， 3- 二氢 -1， -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 55)(197mg， 0.50mmol) 的乙腈4- 苯并氧氮杂(5ml) 溶液缓慢地加入到搅拌下的 3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯甲酰氯 ( 制备例 41) (117mg， 0.50mmol) 和三乙胺 (61mg， 84μl， 0.60mmol) 的乙腈 (5mL) 溶液中。将反应混合 物在室温下搅拌 1 小时， 然后加热回流 48 小时。将反应混合物冷却至室温， 并将溶剂蒸发。 将残余物通过色谱法纯化， 使用 20％乙酸乙酯的异己烷溶液洗脱， 得到标题化合物， 为黄色 + 35 油状物 (29mg)。MS(ES)C29H34 ClN3O7 计算值 571 ； 实测值 572[M+H] 。
制备例 57
9-(5-{3- 氰 基 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 1， 1- 二甲基乙基酯
-4(5H)- 甲酸
将 9-[( 羟基氨基 )( 亚氨基 ) 甲基 ]-5-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-2， 3- 二氢 -1， -4(5H)- 甲酸 1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 55)(197mg， 0.50mmol) 的乙腈4- 苯并氧氮杂(5ml) 溶液缓慢地加入到搅拌下的 3- 氰基 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯甲酰氯 ( 使用制备 例 37 中所述的方法制备 )(112mg， 0.5mmol) 和三乙胺 (61mg， 84μl， 0.6mmol) 的乙腈 (5mL) 溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 1 小时， 然后加热回流 48 小时。将反应混合物冷却至 室温， 并将溶剂蒸发。将残余物通过色谱法纯化， 使用 20％乙酸乙酯的异己烷溶液洗脱， 得 + 实测值 563[M+H] 。 到标题化合物， 为黄色油状物 (41mg)。MS(ES)C30H34N4O7 计算值 562 ；
制备例 58
3-(9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 443二唑 -3- 基 )-4-{[(1，101945865 A CN 101945873说明书-5- 基 ) 丙酸41/51 页1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 56)(29mg， 0.05mmol)、 2M 氢氧化钠 (2ml) 和乙醇 (2ml) 的混合 物于 60℃搅拌 2 小时。将反应混合物冷却， 并将乙醇蒸发。将残余物用水 (5mL) 稀释， 并用 冰醋酸酸化。将该溶液用乙酸乙酯 (2x5mL) 萃取。将合并的有机物干燥， 并蒸发， 得到褐色 35 的标题化合物 (24mg)， 将其不需进一步纯化而使用。MS(ES)C28H32 ClN3O7 计算值 557 ； 实测 + 值 558[M+H] 。
制备例 59
3-(9-(5-{3- 氰 基 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-4-{[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 -5- 基 ) 丙酸
将 9-(5-{3- 氰 基 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-5-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-2， 3- 二氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-4(5H)- 甲酸1， 1- 二甲基乙基酯 ( 制备例 57)(41mg， 0.07mmol)、 2M 氢氧化钠 (2ml) 和乙醇 (2ml) 的混 合物于 60℃搅拌 2 小时。将反应混合物冷却， 并将乙醇蒸发。将残余物用水 (5mL) 稀释， 并用冰醋酸酸化。将该溶液用乙酸乙酯 (2x5mL) 萃取。将合并的有机物干燥， 并蒸发， 得到 标题化合物， 为黄色树胶状物质 (36mg)， 其不需进一步纯化而使用。 MS(ES)C29H32N4O7 计算值 + 548 ； 实测值 549[M+H] 。
实施例 13-[7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-1- 基 ] 丙酰胺二唑 -3- 基 )-2， 3，4， 5- 四氢 -1H-2- 苯并氮杂
将 7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-1-[3-( 甲氧基 )-3- 氧代丙基 ]-1， 3， 4， 5- 四氢 -2H-2- 苯并氮杂-2- 甲酸 1，1- 二甲基乙基酯 (0.050g， 0.088mmol) 在 7M 氨的甲醇溶液 (5ml) 中的溶液在室温下搅拌 7 天。将该混合物蒸发， 再溶于 DCM(1mL) 和三氟乙酸 (1.000ml， 13mmol) 中， 然后在室温下搅 拌 30 分钟。将该混合物蒸发， 然后通过 MDAP 纯化。将含产物的级分蒸发至～ 10ml， 用 2M 氢氧化钠水溶液碱化， 并用乙酸乙酯 (30mL) 萃取。将有机物干燥 ( 硫酸镁 )， 蒸发， 并将残 + 1 余物用乙醚研磨， 得到白色固体 (18mg)。m/z(ES+)455[M+H] 。 H NMR(CDCl3)δ1.45(6H， d)， 1.65(1H， m)， 1.82(1H， m)， 2.17(1H， m)， 2.28(1H， m)， 2.47-2.55(2H， m)， 3.07-3.13(3H， m)， 3.36(1H， m)， 3.95(1H， m)， 4.72(1H， m)， 5.3(1H， br s)， 6.1(1H， br s)， 7.06(1H， d)， 7.32(1H， d)， 7.92-7.94(2H， m)， 8.06(1H， dd)， 8.24(1H， d).
实施例 2
3-[7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-1- 基 ] 丙酸盐酸盐二唑 -3- 基 )-2， 3，4， 5- 四氢 -1H-2- 苯并氮杂
将 3-(7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-2-{[(1， 1- 二 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 羰 基 }-2， 3， 4， 5- 四 氢 -1H-2- 苯 并 氮 杂 -1- 基 ) 丙酸 (0.086g， 0.155mmol) 溶于三氟乙酸 (1.0ml， 13.0mmol) 和 DCM(1mL) 的溶液中， 并在室温下搅拌 30 分钟， 然后蒸发至干。 通过 MDAP 纯化， 得到残余物， 将其再溶于 DCM(5ml) 中， 随后加入 1M HCl 的乙醚溶液 (1ml)。将该混合物蒸发， 然后悬浮于乙醚中， 并过滤， 得 + 1 到 白 色 固 体 (21mg)。m/z(ES+)456[M+H] 。 H NMR(d4-MeOD)δ1.42(6H， d)， 2.06(2H， m)， 2.39(1H， m)， 2.48(2H， m)， 2.55(1H， m)， 3.24(2H， m)， 3.46(1H， m)， 3.49(1H， m)， 4.74(1H， m)， 4.84(1H， m)， 7.32(1H， d)， 7.56(1H， d)， 8.07-8.13(3H， m)， 8.21(1H， d).
实施例 3
3-[7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-1- 基 ]-1- 丙醇盐酸盐二唑 -3- 基 )-2， 3，4， 5- 四氢 -1H-2- 苯并氮杂
将 1M 氢化铝锂的 THF 溶液 (0.149ml ， 0.149mmol) 加入到3-[7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4氢 -1H-2- 苯并氮杂二唑 -3- 基 )-2， 3， 4， 5- 四-1- 基 ] 丙酸甲酯 (0.07g， 0.149mmol) 的 THF(3mL) 溶液中， 并将生成的混合物在室温下搅拌 30 分钟， 加入 2M 氢氧化钠水溶液 (10ml)， 然后将混合物萃取 到乙酸乙酯 (20mL) 中， 并将有机相干燥 ( 硫酸镁 )， 蒸发， 并通过 MDAP 纯化。合并所需的 级分， 蒸发， 与乙醇 (20mL) 共沸， 并将残余物再溶于 DCM(4mL) 中。加入 1M HCl 的乙醚溶 液 (1ml)， 然后将混合物蒸发， 并用乙醚研磨， 得到白色固体 (31mg)。m/z(ES+)442[M+H]+。 1 H NMR(d4-MeOD)δ1.42(6H， d)， 1.55-1.75(2H， m)， 2.06(2H， m)， 2.19(1H， m)， 2.39(1H， m)， 3.24(2H， m)， 3.45-3.55(2H， m)， 3.57(2H， m)， 4.68(1H， m)， 4.85(1H， m)， 7.32(1H， d)， 7.59(1H， d)， 8.07-8.13(3H， m)， 8.21(1H， d).
实施例 4
[7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-3- 基 ] 甲醇盐酸盐二唑 -3- 基 )-2， 3， 4，5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-3-( 羟基 甲 基 )-2， 3- 二 氢 -1， 4- 苯 并 氧 氮 杂 0.047mmol) 溶于 4M HCl 的二-4(5H)- 甲 酸 1， 1- 二 甲 基 乙 基 酯 (0.024g，烷溶液 (1.0ml， 4.0mmol) 中， 并在室温下搅拌 1 小时。将该混合物蒸发， 并将残余物用乙醚研磨， 得到白色固体 (20mg)。m/z(ES+)416[M+H]+。1H NMR(d6-DMSO)δ1.36(6H， d)， 3.70-3.75(3H， m)， 4.07(1H， m)， 4.46-4.57(3H， m)， 4.89(1H， m)， 5.52(1H， m)， 7.28(1H， d)， 7.46(1H， d)， 8.05(1H， dd)， 8.11(1H， dd)， 8.19(2H， m)， 9.66(2H， br s).
实施例 5
7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-3- 甲酸盐酸盐二唑 -3- 基 )-2， 3， 4，5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
向 7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-4-{[(1， -3- 甲酸 (0.069g，1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂0.13mmol) 的 1， 4- 二烷 (1ml) 溶液中加入 4M HCl 的二烷溶液 (4.0ml， 16.0mmol)，并将生成的溶液在室温下搅拌 1.5 小时。将该混合物蒸发至干， 并用乙醚研磨， 得到白色 + 1 d)， 4.39-4.56(4H， m)， 固 体 (39mg)。m/z(ES+)430[M+H] 。 H NMR(d6-DMSO)δ1.37(6H， 4.65(1H， m)， 4.89(1H， m)， 7.24(1H， d)， 7.45(1H， d)， 8.02(1H， dd)， 8.11(1H， dd)， 8.14(1H， d)， 8.18(1H， d).
实施例 6
3-[7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-3- 基 ] 丙酸盐酸盐二唑 -3- 基 )-2， 3，4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 3-(7-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 苯 基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-4-{[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 -3- 基 ) 丙酸 (0.101g， 0.181mmol) 溶于 4M HCl 的二 烷溶液 (3.0ml， 12.0mmol) 中， 并 烷和乙醚洗涤， 得到白色固体 在室温下搅拌 1 小时， 期间生成固体。将其过滤， 然后用二d)， 2.00(2H， m)， 2.61(2H， m)， (55mg)。m/z(ES+)458[M+H]+。1H NMR(d4-MeOD)δ1.42(6H， 3.86(1H， m)， 4.02(1H， m)， 4.55(2H， s)， 4.59(1H， m)4.84(1H， m)， 7.30(2H， m)， 8.11(1H， dd)， 8.15(1H， dd)， 8.20(2H， m).
实施例 7
[9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-5- 基 ] 乙酸盐酸盐二唑 -3- 基 )-2， 3， 4，5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 4.0M 氯化氢的二烷溶液 (2ml) 加入到 (9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧 烷 (1mL)基 ] 苯基 }-1， 2， 4氢 -1， 4- 苯并氧氮杂二唑 -3- 基 )-4-{[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四 -5- 基 ) 乙酸钠盐 ( 制备例 36)(90mg， 0.17mmol) 的二溶液中。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入乙醚 (10ml)， 并将该混合物搅拌 10 分钟。 将沉淀物滤出， 用乙醚洗涤， 并干燥， 得到标题化合物， 为无色固体 (70mg)。δH(400MHz， d6DMSO)1.37(6H， d)， 3.1-3.7(4H， m)( 包 括 水 峰 )， 4.16-4.27(1H， m)， 4.34-4.45(1H， m)， 4.89(1H， m)， 4.97-5.03(1H， m)， 7.35-7.41(1H， dd)， 7.46(1H， d)， 7.61(1H， d)， 7.96(1H， d)， 35 8.11(1H， d)， 8.18(1H， s)， 10.00(2H， br s)， 12.80(1H， br s).MS(ES)C22H22 ClN3O5 计算值443 ； 实测值 444[M+H]+。
实施例 8
[9-(5-{3- 氰基 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-5- 基 ] 乙酸 .二唑 -3- 基 )-2， 3，4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 4.0M 氯 化 氢 的 二烷 溶 液 (2ml， 8mmol) 加 入 到 搅 拌 下 的 (9-(5-{3- 氰 二唑 -3- 基 )-4-{[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] -5- 基 ) 乙酸 ( 制备例 38)(150mg， 0.28mmol)基 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 的无水二烷 (2ml) 溶液中， 并将该混合物在室温下搅拌 4 小时。 加入乙醚 (10ml)， 得到无色固体。 将该固体滤出， 并用乙醚洗涤， 然后通过 MDAP 纯化， 得到产物， 为无色固体 (78mg)。 δH(400MHz， d6DMSO)1.39(6H， d)， 2.66-2.74(1H， m)， 2.77-2.86(1H， m)， 2.98-3.04(1H， m)， 3.94(1H， m)， 4.09-4.15(1H， m)， 4.40-4.47(1H， m)， 4.98(1H， m)， 7.26(1H， dd)， 7.44(1H， d)， 7.56(1H， d)， 7.80(1H， d)， 8.40(1H， m)， 8.51(1H， m).MS(ES)C23H22N4O5 计算值 434 ； 实测值 + 435[M+H] 。
实施例 9
[9-(5-{5- 氯 -6-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ]-3- 吡啶基 }-1， 2， 4-5- 基 ] 乙酸二唑 -3- 基 )-2，3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 4.0M 氯 化 氢 的 二烷 溶 液 (2ml， 8mmol) 加 入 到 搅 拌 下 的 二唑 -3- 基 )-4-{[(1， 1- 二 -5- 基 ) 乙酸 ( 制备例 40)(9-(5-{5- 氯 -6-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ]-3- 吡啶基 }-1， 2， 4甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 (250mg， 0.46mmol) 的无水二烷 (2mL) 溶液中， 并在室温下搅拌 4 小时。 加入乙醚 (10ml)，得到无色固体， 将其滤出， 并用乙醚洗涤。将该固体通过 MDAP 纯化， 得到标题化合物， 为无 色固体 (169mg)。δH(400MHz， d6DMSO)1.39(6H， d)， 2.66-2.73(1H， m)， 2.77-2.85(1H， m)， 3.07-3.14(1H， m)， 3.93-4.00(1H， m)， 4.08-4.16(1H， m)， 4.40-4.06(1H， m)， 5.45(1H， m)，7.26(1H， dd)， 7.44(1H， m)， 7.80(1H， m)， 8.54(1H， d)， 8.93(1H， d).MS(ES)C21H2135ClN4O5 计算 值 444 ； 实测值 445[M+H]+。
实施例 10
4-[9-(5-{3- 氰基 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-5- 基 ] 丁酸盐酸盐二唑 -3- 基 )-2，3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 4M HCl 的二烷溶液 (1ml) 加入到搅拌下的 4-(9-(5-{3- 氰基 -4-[(1- 甲基乙 二唑 -3- 基 )-4-{[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， -5- 基 ) 丁酸 ( 制备例 49)(80mg， 0.14mmol) 的二 烷 (2mL) 烷溶液 (1ml)， 并基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 45- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 2 小时。加入另外的 4M HCl 的二将该混合物在室温下搅拌 1 小时。蒸发溶剂， 并将无水的乙醚 (2ml) 加入到残余物中， 并将 混合物搅拌 30 分钟。轻轻倒出上清液， 并将无水乙醚 (2ml) 加入到残余物中。搅拌 30 分 钟后， 将该固体滤出， 得到标题化合物， 为无色固体 (37mg)
δ H(400MHz ，d 6 DMSO)1.20-1.30(1H ，m) ， 1.39(6H ，d) ， 1.50-1.60(1H ，m) ， 2.00-2.15(2H， m)， 2.30(2H， t)， 3.35-3.45(1H， m)3.60-3.75(1H， m)， 4.00-4.10(1H， m)， 4.45-4.55(1H， m)， 4.65-4.70(1H， m)， 4.95-5.05(1H， m)， 7.35(1H， dd)， 7.55(1H， d)， 7.70(1H， d)， 7.95(1H， d)， 8.45(1H， m)， 8.50(1H， m)， 9.50-9.80(2H， br m)， 12.1(1H， br + s).MS(ES)C25H26N4O5 计算值 462 ； 实测值 463[M+H] 。
实施例 11
4-[9-(5-{5- 氯 -6-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ]-3- 吡啶基 }-1， 2， 4-5- 基 ] 丁酸盐酸盐二唑 -3- 基 )-2，3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 4M HCl 的二烷溶液 (1ml) 加入到搅拌下的 4-(9-(5-{5- 氯 -6-[(1- 甲基 二 唑 -3- 基 )-4-{[(1， 1- 二 甲 基 乙 基 ) 氧 基 ] 羰 -5- 基 ) 丁酸 ( 制备例 51)(100mg， 0.17mmol) 的 烷乙 基 ) 氧 基 ]-3- 吡 啶 基 }-1， 2， 4基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂 二烷 (2mL) 溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 2 小时。加入另外的 4MHCl 的二溶液 (1ml)， 并将混合物在室温下搅拌 1 小时。蒸发溶剂， 并将无水乙醚 (2ml) 加入到该 残余物中， 并将混合物搅拌 30 分钟。轻轻倒出上清液， 并将无水乙醚 (2ml) 加入到残余物 中。搅拌 30 分钟后， 将该固体滤出， 得到标题化合物， 为无色固体 (21mg)。δH(400MHz， m)， 1.40(6H， d)， 1.50-1.60(1H， m)， 1.95-2.05(2H， m)， 2.30(2H， t)， d6DMSO)1.20-1.30(1H， 3.35-3.45(1H， m)3.60-3.72(1H， m)， 4.00-4.10(1H， m)， 4.48-4.56(1H， m)， 4.65-4.70(1H， m)， 5.40-5.50(1H， m)， 7.40(1H， dd)， 7.68-7.72(1H， m)， 7.94-7.99(1H， m)， 8.55(1H， d)， 35 8.94(1H， d)， 9.40-9.80(2H， br m)， 12.1(1H， br s).MS(ES)C23H25 ClN4O5 计算值 472 ； 实测 + 值 473[M+H] 。
实施例 12
4-[9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-5- 基 ] 丁酸盐酸盐 .二唑 -3- 基 )-2， 3，4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 4M HCl 的二烷溶液 (1ml) 加入到搅拌下的 4-(9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙 二唑 -3- 基 )-4-{[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， -5- 基 ) 丁酸 ( 制备例 50)(60mg， 0.10mmol) 的二 烷 (2ml) 烷溶液 (1ml)，基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 45- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 2 小时。加入另外的 4M HCl 的二并在室温下继续搅拌 1 小时。蒸发溶剂， 并将无水乙醚 (2ml) 加入到该残余物中， 并将混 合物搅拌 30 分钟。轻轻倒出上清液， 并将无水乙醚 (2ml) 加入到残余物中。搅拌 30 分钟 后， 将该固体滤出， 得到标题化合物， 为无色固体 (9mg)。δH(400MHz， d4MeOH)1.42(6H， d)， 1.43-1.55(1H， m)， 1.65-1.75(1H， m)， 2.10-2.20(1H， m)， 2.25-2.35(1H， m)， 2.40(2H， t)， 3.50-3.60(1H， m)3.80-3.92(1H， m)， 4.10-4.20(1H， m)， 4.55-4.64(1H， m)， 4.68-4.77(1H， m)， 4.80-4.90(1H， m)( 被 H2O 部分遮蔽 )， 7.32(1H， d)， 7.38-7.44(1H， dd)， 7.62-7.68(1H， 35 m)， 8.07-8.14(2H， m)， 8.20(1H， s).MS(ES)C24H26 ClN4O5 计算值 471 ； 实测值 472[M+H]+。
实施例 13
3-[9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 450二唑 -3- 基 )-2， 3，101945865 A CN 101945873说明书48/51 页4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
-5- 基 ] 丙酸， 甲酸盐
将 4M HCl 的二烷溶液 (1ml) 加入到 3-(9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 烷 (1mL) 溶液苯基 }-1， 2， 44- 苯并氧氮杂二唑 -3- 基 )-4-{[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四氢 -1， -5- 基 ) 丙酸 ( 制备例 58)(25mg， 0.04mmol) 的无水二中。将反应混合物在室温下搅拌 1 小时。蒸发溶剂， 并将残余物用乙醚研磨， 得到树胶状物 质， 将其通过 MDAP 纯化， 得到标题化合物， 为无色玻璃状物质 (8mg)。
δ H(400MHz ，d 4 MeOH)1.42(6H ，d) ， 2.30-2.52(4H ，m) ， 3.52-3.59(1H ，m) ， 3.76-3.84(1H， m)， 4.18-4.27(1H， m)， 4.42-4.50(1H， m)， 4.69-4.75(1H， m)， 4.80-4.87(1H， m) ， 7.31(1H ， d) ， 7.38-7.43(1H ， dd) ， 7.58(1H ， d) ， 8.05-8.13(2H ， m) ， 8.19-8.21(2H ， + 35 m).MS(ES)C23H24 ClN3O7 计算值 457 ； 实测值 458[M+H] 。
实施例 14
3-[9-(5-{3- 氰基 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-5- 基 ] 丙酸， 甲酸盐二唑 -3- 基 )-2，3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 4M HCl 的二烷溶液 (1ml) 加入到 3-(9-(5-{3- 氰基 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧 烷 (1mL)基 ] 苯基 }-1， 2， 4氢 -1， 4- 苯并氧氮杂二唑 -3- 基 )-4-{[(1， 1- 二甲基乙基 ) 氧基 ] 羰基 }-2， 3， 4， 5- 四 -5- 基 ) 丙酸 ( 制备例 59)(40mg， 0.07mmol) 的无水二溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 2 小时。蒸发溶剂， 并将残余物用乙醚研磨， 随后通过 MDAP 纯化， 得到标题化合物， 为无色玻璃状物质 (13mg)。δ H(400MHz ，d 4 MeOH)1.45(6H ，d) ， 2.30-2.42(3H ，m) ， 2.47-2.55(1H ，m) ， 3.52-3.58(1H， m)， 3.80-3.88(1H， m)， 4.16-4.25(1H， m)， 4.47-4.55(1H， m)， 4.71-4.78(1H， m)， 4.92-5.00(1H， m( 部 分 被 溶 剂 遮 蔽 ))， 7.38-7.46(2H， m)， 7.57-7.61(1H.m)， 8.07-8.11(1H， m)， 8.15-8.20(1H， br s)， 8.39-8.44(1H， m)， 8.46(1H， s).MS(ES)C24H24N4O5 + 计算值 448 ； 实测值 449[M+H] 。
实施例 15
[9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-5- 基 ] 乙酸二唑 -3- 基 )-4- 甲基 -2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂
将 [9-(5-{3- 氯 -4-[(1- 甲基乙基 ) 氧基 ] 苯基 }-1， 2， 4-二唑 -3- 基 )-4- 甲基 -2， 3， 4， 5- 四氢 -1， 4- 苯并氧氮杂-5- 基 ] 乙酸乙酯 ( 制备例 61)(75mg， 0.15mmol)、乙醇 (0.5mL) 和 2M 氢氧化钠 (1ml) 的混合物在室温下搅拌 2 小时。蒸发溶剂， 并将残余物 用水 (5mL) 稀释， 并用乙醚 (2mL) 洗涤。将水相用冰醋酸中和， 并用乙酸乙酯 (2x3mL) 萃 取。将合并的有机萃取液干燥， 并蒸发。将残余物溶于乙酸乙酯 (1mL) 中， 并用 1M 氯化氢 的乙醚溶液 (1mL) 处理。蒸发溶剂， 并将残余物用乙醚研磨， 得到标题化合物， 为无色固体 (40mg) δH(400MHz， d6DMSO)1.37(6H， d)， 2.78(3H， br.s)， 2.91-4.09(4H， m)( 包 括 水 峰 )， 4.29(1H， t)， 4.49(1H， d)， 4.89(1H， spt)， 4.98(1H， br.s)， 7.39(1H， t)， 7.45(1H， d)， 7.66(1H， d)， 8.00(1H， d)， 8.11(1H， d)， 8.18(1H， s)， 11.94(1H， br s)， 12.38(1H， br + 35 s).MS(ES)C23H24 ClN3O5 计算值 457 ； 实测值 458[M+H] 。
S1P1 GTPγS 试验的膜的制备
所有膜制备的步骤都在 4℃下进行。 稳定表达人 S1P1 受体的大鼠肝癌细胞或稳定 表达人 S 1P3 受体的大鼠嗜碱性白血病细胞 (RBL) 生长至 80％汇合， 然后收集至 10ml 的磷 酸盐缓冲液 (PBS) 中， 并在 1200rpm 下离心 5 分钟。除去上清液后， 将沉淀物 (pellet) 重 悬浮， 并在玻璃韦林氏 (Waring) 搅切器内在 200ml 的缓冲液 (50mM HEPES， 1mM 亮肽酶素， 25μg/ml 杆菌肽， 1mM EDTA， 1mM PMSF， 2μM 胃蛋白酶抑制剂 A) 中通过两个 15 秒的破裂 (burst) 将细胞均质化。 在第一次破裂后， 将搅切器浸在冰中 5 分钟， 且在最后一次破裂后， 将搅切器浸在冰中 10-40 分钟以消散泡沫。然后将该物质在 500g 下旋转 20 分钟， 并将上 清液在 48,000g 下旋转 36 分钟。将沉淀物重悬于与上述相同， 但不含有 PMSF 和胃蛋白酶 抑制剂 A 的缓冲液中。然后将该物质强制通过 0.6mm 针头， 制成所需的体积， ( 通常为初始 细胞沉淀物体积的 4 倍 )， 等分试样， 并在 -80℃下冷冻保藏。
S1P1 GTPγS 试验的另一种膜的制备
所有步骤都在 4 ℃下进行。在玻璃韦林氏搅切器内在 200ml 的缓冲液 (50mM HEPES， 1mM 亮肽酶素， 25μg/ml 杆菌肽， 1mM EDTA， 1mM PMSF， 2μM 胃蛋白酶抑制剂 A) 中通 过两个 15 秒的破裂 (burst) 将细胞均质化。在第一次破裂后将搅切器浸入冰中 5 分钟， 并 在最终的破裂后， 将搅切器浸在冰中 10-40 分钟以消散泡沫。然后将该物质在 500g 下旋转 20 分钟， 将上清液在 48000g 下旋转 36 分钟。将沉淀物重悬于与上述一样但是不含 PMSF 和 胃蛋白酶抑制剂 A 的缓冲液中。然后将该物质强制通过 0.6mm 的针头， 得到所需体积 ( 通 常为初始细胞沉淀物体积的 4 倍 )， 等分试样并于 -80℃冷冻储存。
S1P1 GTPγS 试验
将人 S1P1 大鼠肝癌膜 (1.5μg/ 孔 ) 粘附于试验缓冲液 (HEPES 20mM， MgCl210mM， NaCl 100mM， 使用 KOH 5M 调节 pH 为 7.4， 还加入 GDP 10μMFAC( 最终试验浓度 ) 和皂苷 90μg/ml FAC) 中的麦胚凝集素 (WGA) 涂覆的闪烁迫近测定 (SPA) 珠上 (0.125mg/ 孔 )。
于冰上预偶联 30 分钟后， 将珠与膜悬浮液分加至白色 Greiner 聚丙烯 LV384 孔 板中 (5μl/ 孔 )， 其中含有 0.1μl 的化合物。然后将用试验缓冲液制成的 5μg/ 孔的 35 [ S]-GTPγS(0.5nM 最终放射性配体浓度 ) 加至激动剂板上。然后在 1000rpm 下离心最终 的试验混合物 (cocktail)(10.1μl)5 分钟， 立即在 Viewlux 读出器上读数。
将所有的测试化合物以 10mM 的浓度溶于 DMSO 中， 并使用四倍 (1 in 4) 稀释步骤 用 100％ DMSO 制备， 得到 11 点的剂量反应曲线。将稀释液转移至测定板上， 确保 DMSO 浓度 对于所有试验在整个板上是恒定的。
所有数据都对各板上 16 个高和 16 个低对照孔的平均值标准化。然后应用四参数 曲线拟合。
S1p1 GTPγS 试验的另一方法
将表达 S1P1 的 RH7777 膜 (1.5μg/ 孔 ) 通过 23G 针头来均质化。然后将它们粘 附于试验缓冲液 (HEPES 20mM， MgCl2 10mM， NaCl 100mM， 使用 KOH 5M 调节 pH 为 7.4) 中的 WGA- 涂覆的 SPA 珠上 (0.125mg/ 孔 )。还加入 GDP 10μM FAC 和皂苷 90μg/ml FAC。
于冰上预偶联 30 分钟后， 将珠与膜悬浮液分加至白色 Greiner 聚丙烯 LV 384 孔 板中 (5μl/ 孔 )， 其中含有 0.1μl 的化合物。然后将用试验缓冲液制成的 5μg/ 孔的 35 [ S]-GTPγS( 对于 S1P1， 最终放射性配体浓度为 0.5nM ； 对于 S1P3， 最终放射性配体浓度为 0.3nM) 加至板上。 然后将最终的试验混合物 (cocktail)(10.1μl) 密封， 在离心机上旋转， 然后在 Viewlux 仪器上直接读数。
本发明的实施例化合物的 pEC50 ＞ 5。实施例 4-7 和 9-14 的化合物的 pEC50 ＞ 7。实施例 6 和 12-14 化合物的 pEC50 ＞ 8。
S1P3
将来自大鼠嗜碱性白血病细胞 (RBL-2H3) 的 S1P3 膜 (1.5μg/ 孔 ) 粘附于试验缓 冲液 (HEPES 20mM， MgCl23mM， NaCl 100mM， 使用 KOH 5M 调节 pH 为 7.4， 还加入 GDP 10μM FAC 和皂苷 90μg/ml FAC) 中的 WGA- 涂覆的 SPA 珠上 (0.125mg/ 孔 )。
于冰上预偶联 30 分钟后， 将珠与膜悬浮液分加至白色 Greiner 聚丙烯 LV384 孔 板中 (5μl/ 孔 )， 其中含有 0.1μl 的化合物。然后将用试验缓冲液制成的 5μg/ 孔的 35 [ S]-GTPγS(0.5nM 的最终放射性配体浓度 ) 加至激动剂板上。在 1000rpm 下离心最终的试验混合物 (10.1μl)5 分钟， 然后立即在 Viewlux 读出器上读数。
将所有的测试化合物以 10mM 的浓度溶于 DMSO 中， 并使用四倍 (1 in 4) 稀释步骤 在 100％ DMSO 中制备， 得到 11 点的剂量反应曲线。将稀释液转移至测定板上， 确保 DMSO 浓 度对于所有试验在整个板上是恒定的。
所有数据都对各板上 16 个高和 16 个低对照孔的平均值标准化。然后应用四参数 曲线拟合。
S1P3 GTPγS 试验的另一方法
将表达 S1P3 的 RBL 膜 (1.5μg/ 孔 ) 通过 23G 针头来均质化。然后将它们粘附于 试验缓冲液 (HEPES 20mM， MgCl210mM， NaCl 100mM， 使用 KOH5M 调节 pH 为 7.4) 中的 WGA- 涂 覆的 SPA 珠上 (0.125mg/ 孔 )。还加入 GDP 10μM FAC 和皂苷 90μg/ml FAC
于冰上预偶联 30 分钟后， 将珠与膜悬浮液分加至白色 Greiner 聚丙烯 LV384 孔 板中 (5μl/ 孔 )， 其中含有 0.1μl 的化合物。然后将用试验缓冲液制成的 5μg/ 孔的 35 [ S]-GTPγS( 对于 S1P1， 最终放射性配体浓度为 0.5nM ； 对于 S1P3， 最终放射性配体浓度 为 0.3nM) 加至板上。然后将最终的试验混合物 (10.1μl) 密封， 在离心机上旋转， 然后在 Viewlux 仪器上直接读数。
实施例化合物具有 pEC50 ＜ 7， 很多化合物具有 pEC50 ＜ 6。实施例 1-3、 7-10 和 12-13 的化合物具有 pEC50 ＜ 5。54