纳米磁性载基因热控释脂质体的制备工艺.pdf

纳米磁性载基因热控释脂质体的制备工艺涉及一种治疗癌症的药物尤其涉及一种纳米磁性载基因热控释脂质体的制备工艺。将硫酸锰、硫酸锌、硫酸亚铁按一定比例粉碎成末，并用氢氧化钠水溶解，经搅拌、干燥、焙烧等步骤得到锰锌铁磁性纳米粒子。得到的锰锌铁磁性纳米粒子用适量聚乙烯亚胺修饰，再与绿色荧光蛋白表达质粒结合得到载基因锰锌铁磁性纳米粒子。在茄形瓶中加入适量二棕榈酰磷脂酰胆碱和胆固醇并用氯仿和无水乙醚溶解，之后将茄形瓶置于旋转蒸发器中蒸发使瓶底形成一均匀薄膜，再加入含有载基因锰锌铁磁性纳米粒子的磷酸盐缓冲液，电动搅拌至薄膜脱落，加甘油反复冻融即得纳米磁性载基因热控释脂质体。

1.  一种纳米磁性载基因热控释脂质体的制备方法，其特征在于：
第一步：将硫酸锰MnSO₄·H₂O、硫酸锌ZnSO₄·7H₂O、硫酸亚铁FeSO₄·7H₂O按摩尔比1∶1∶4混合得到组合物，置于电动粉碎机中粉碎成末，然后按照所述组合物中的金属离子与氢氧化钠NaOH摩尔比1∶2.4称取氢氧化钠并用蒸馏水溶解，再将氢氧化钠水溶液加入到粉末中并用电动搅拌机搅拌三小时，静置12小时后置80℃烤箱中干燥，再置马弗炉内400℃焙烧1小时，冷却后将材料研细成粉末状，用50～60℃蒸馏水浸洗6～8次以去除可溶性硫酸钠无机盐，之后用无水乙醇淋洗，60℃烘干，得锰锌铁磁性纳米粒子MZF-NP，
第二步：用浓度为5g/l的草酸溶液将锰锌铁磁性纳米粒子配成质量分数为4％的磁流体混悬液，超声分散后离心弃上清液，并将离心后的锰锌铁磁性纳米粒子加入到磷酸盐缓冲液中，边超声边加入0.2倍锰锌铁磁性纳米粒子质量的聚乙烯亚胺PEI充分混匀，再超声1小时，磁力搅拌2小时，使反应充分形成稳定的聚乙烯亚胺/锰锌铁纳米粒子(PEI/MZF)，分别用蒸馏水、乙醇反复洗涤6次，干燥后将聚乙烯亚胺/锰锌铁纳米粒子与绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP充分混合，室温放置30分钟，得载基因锰锌铁磁性纳米粒子，
第三步：二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC与胆固醇按质量比5∶3混合置于茄形瓶中，并加入二棕榈酰磷脂酰胆碱中脂质成分10倍体积的氯仿和无水乙醚的混合液，氯仿和无水乙醚体积比为2∶1，超声3分钟使其完全溶解，用薄膜旋转蒸发器在42℃下恒温真空旋转蒸发，直到有机溶剂完全挥发，在茄形瓶内壁形成一均匀薄膜；在磷酸盐缓冲液中加入0.4～0.5倍DPPC与胆固醇总质量的明胶，在60℃±5℃水浴中待明胶溶解后加入1.5～2倍DPPC与胆固醇总质量的载基因锰锌铁磁性纳米粒子，室温超声处理3～5分钟，形成混悬液，将此混悬液加到上述含薄膜的茄形瓶中，电动搅拌震荡至薄膜脱落，转速为2000转/分，再加甘油1ml，混匀，置于-20℃中冷冻1～2小时，37℃融化，超声处理30秒后再置于-20℃中1～2小时，如此反复冻融及超声处理3次即得纳米磁性载基因热控释脂质体。

纳米磁性载基因热控释脂质体的制备工艺
技术领域
本发明涉及一种作为治疗癌症药物的纳米磁性载基因热控释脂质体的制备工艺。
背景技术
本发明涉及的是一种新型纳米磁性载基因热控释脂质体的制备工艺，通过改良的薄膜分散加高压匀质法制备一种包封有抗肿瘤基因和锰锌铁磁性纳米粒同时具有合适相变温度(41℃～46℃)的新型纳米热控释脂质体，由于包封的锰锌铁磁性纳米粒在交变磁场中具有磁感应升温、控温、恒温特性，因此当温度上升至脂质体的相变温度时，基因可以缓慢释放，实现纳米磁性材料热控释下的基因治疗，同时，由于热控释脂质体的相变温度为41℃～46℃，正是肿瘤热疗的理想温度，从而使这种新型纳米磁性载基因热控释脂质体能以热敏脂质体为中介集热疗、基因治疗于一体，发挥较好的抗肿瘤作用。同时，它还具有磁靶向定位及降低全身毒副作用等优点。
热敏脂质体是近年来兴起的一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型，它可以利用脂质体的载药特性和热疗的双重优势来提高治疗效果，降低毒副作用。其原理是当达到相变温度时，脂质体中的磷脂产生从胶态过渡到液晶态的物理转移，膜的流动性和通透性增加，药物大量扩散到靶器官中，对周围的肿瘤细胞产生较强的杀伤作用，从而达到局部化疗的作用，如果相变温度处于肿瘤热疗温度41℃到46℃之间，可以同时发挥肿瘤热疗的作用。近年来又有学者[1]将磁性材料如右旋糖酐铁等包裹在脂质体发展起来一种新型脂质体-磁性脂质体，除了具备脂质体的特点，它可以在体外磁场的作用下，把抗癌药物选择性地输送和定位于靶区，从而降低药量，减小毒性，提高疗效。包封在磁性脂质体中的磁性材料主要用途在于将脂质体磁性靶向到肿瘤部位，提高了治疗的靶向性，但近年来纳米磁性材料的升温热疗肿瘤作用越来越受到重视，磁性纳米材料能在在交变磁场下产热增强热疗效果，进而改善肿瘤区域内的血液循环和血管的通透性，有利于治疗肿瘤的药物达到肿瘤靶向区域。还有学者直接在磁性纳米材料内加入抗癌物质，达到热疗和药物治疗的双重效果，此过程中磁性材料起到增强产热和靶向药物输送的双重作用。利用磁性纳米材料的另一个突出的优点就是它可以进行自动控温、恒温。由于铁磁性物质本身具有居里温度的特点，当温度升至居里点后铁磁性失去磁性而降温，低于居里点后又恢复磁性而升温，从而达到对肿瘤热疗的自动控温和恒温，这对深部肿瘤的热疗具有重要的意义。我们成功研制出具有自主知识产权的磁性锰锌铁氧体纳米颗粒，它是一种具有较低居里温度的软磁铁氧体材料，在交变磁场照射下可以强烈吸收电磁波能量而升温；当温度达到居里温度时，它转变为非磁性物质而失去吸收电磁波能量的能力，使温度下降，当温度低于居里温度时，又恢复升温锰锌铁氧体纳米微球又恢复磁性升温，如此往复，使温度始终控制在设定的居里温度处，从而实现对肿瘤加热治疗的自动升温和控温，提高治疗效果的稳定性和安全性。我们也研究出了当Mn1-xZnxFe2O4中的x为0.5时，其经过交换散热后能够缓慢升至肿瘤治疗的合适温度(41℃-46℃)并保持恒定不变，达到抗肿瘤而又不损伤正常组织的治疗效果。
磁性纳米材料热疗的前景是十分广阔的，但若是单纯热疗没有结合其他治疗方式，其作用仍显单一。
随着生物化学与分子生物学的不断发展，人们对各种疾病的分子机理有了进一步的认识。在已知的人类疾病中有数千种疾病是与基因相关的，其中包括与单基因相关的先天性遗传疾病和与多基因相关的后天性疾病。导致疾病的原因主要是基因缺陷和基因缺失，把适当的外源基因引入人体细胞内，以弥补缺陷或缺失的基因，表达出相应的蛋白质，从根本上消除产生疾病症状的内在因素，进而产生了一种新的治疗方法一一基因治疗。20世纪90年代以来，世界各国纷纷将人类基因组研究列为国家重大研究项目，随着人类基因组研究的迅速进展，人们对生命基因基础的认识将达到一个新的水平，而对于基因导入载体的研究也越来越多。近年来，脂质体作为基因导入的载体倍受研究者的重视，它具有可自然降解、无免疫原性、可重复转染等优点，被称为基因治疗领域内最有希望的基因转染载体，Vieweg等将脂质体与包含有IL-2基因的质粒融合形成脂质体-DNA复合体，将其与前列腺癌细胞一起孵育，结果发现前列腺癌细胞内IL-2水平明显升高。脂质体可携带各种基因片段，保护基因不被核酸酶降解，并且脂质与细胞膜融合将目的基因导入细胞后，脂质即被降解，具有独特的优越性，因此，脂质体介导的基因转移方法被美国癌症协会批准为应用于临床基因治疗的第一方案。另外，非病毒基因载体中的聚乙烯亚胺(PEI)也倍受关注，它是一种具有最高正电荷密度的有机大分子，由于分子中含有大量的亚胺基，PEI具有很强的缓冲能力，PH范围宽。在中性水体系中PEI能充分质子化，形成“质子棉球”，从而可以捕获DNA.科学家认为PEI也是基因治疗的高度有效的载体，可进行体内外寡核昔酸和质粒的传递。因此，将基因治疗通过一些特定的方式与其他治疗肿瘤的方法结合起来是一种极具应用前景的治疗肿瘤的药物剂型。
基于以上研究成果我们首先将锰锌铁磁性纳米材料用PEI修饰后高效捕获抗肿瘤基因，然后采用改良的薄膜分散加高压匀质法制备热敏脂质体，将载抗肿瘤基因的锰锌铁磁性纳米粒包封于其中，解决脂质体的相变温度问题，制备成纳米磁性载基因热控释脂质体，利用锰锌铁氧体在交变磁场中自动升温、恒温性能达到热敏脂质体的相变温度(41℃～46℃)，实现包封于脂质体中的基因的控缓释，达到热疗、基因治疗共同抗肿瘤的目的，另外，包封的磁性材料在脂质体中起导向和定位作用，使脂质体在外加磁场作用下，随血液循环聚集到靶器官，使治疗的靶向性和专一性增强。本研究期望通过脂质体集基因治疗、热疗、热控释、磁靶向等优点为一体，为肿瘤的治疗开拓了新的思路。
发明内容
本发明提供一种纳米磁性载基因热控释脂质体的制备方法，利用本发明可获得磁响应性强，粒径较小(100nm左右)、分散性较好，磁性纳米材料控缓释、并包含基因治疗功能的脂质体。
本发明采用如下技术方案来解决其技术问题：
一种作为治疗癌症药物的纳米磁性载基因热控释脂质体的制备方法：
第一步：将硫酸锰MnSO₄·H₂O、硫酸锌ZnSO₄·7H₂O、硫酸亚铁FeSO₄·7H₂O按摩尔比1∶1∶4混合得到组合物，置于电动粉碎机中粉碎成末，然后按照所述组合物中的金属离子与氢氧化钠NaOH摩尔比1∶2.4称取氢氧化钠并用蒸馏水溶解，再将氢氧化钠水溶液加入到粉末中并用电动搅拌机搅拌三小时，静置12小时后置80℃烤箱中干燥，再置马弗炉内400℃焙烧1小时，冷却后将材料研细成粉末状，用50～60℃蒸馏水浸洗6～8次以去除可溶性硫酸钠无机盐，之后用无水乙醇淋洗，60℃烘干，得锰锌铁磁性纳米粒子MZF-NP，
第二步：用浓度为5g/l的草酸溶液将锰锌铁磁性纳米粒子配成质量分数为4％的磁流体混悬液，超声分散后离心弃上清液，并将离心后的锰锌铁磁性纳米粒子加入到磷酸盐缓冲液中，边超声边加入0.2倍锰锌铁磁性纳米粒子质量的聚乙烯亚胺PEI充分混匀，再超声1小时，磁力搅拌2小时，使反应充分形成稳定的聚乙烯亚胺/锰锌铁纳米粒子(PEI/MZF)，分别用蒸馏水、乙醇反复洗涤6次，干燥后将聚乙烯亚胺/锰锌铁纳米粒子与绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP充分混合，室温放置30分钟，得载基因锰锌铁磁性纳米粒子，
第三步：二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC与胆固醇按质量比5∶3混合置于茄形瓶中，并加入二棕榈酰磷脂酰胆碱中脂质成分10倍体积的氯仿和无水乙醚的混合液，氯仿和无水乙醚体积比为2∶1，超声3分钟使其完全溶解，用薄膜旋转蒸发器在42℃下恒温真空旋转蒸发，直到有机溶剂完全挥发，在茄形瓶内壁形成一均匀薄膜；在磷酸盐缓冲液中加入0.4～0.5倍DPPC与胆固醇总质量的明胶，在60℃±5℃水浴中待明胶溶解后加入1.5～2倍DPPC与胆固醇总质量的载基因锰锌铁磁性纳米粒子，室温超声处理3～5分钟，形成混悬液，将此混悬液加到上述含薄膜的茄形瓶中，电动搅拌震荡至薄膜脱落，转速为2000转/分，再加甘油1ml，混匀，置于-20℃中冷冻1～2小时，37℃融化，超声处理30秒后再置于-20℃中1～2小时，如此反复冻融及超声处理3次即得纳米磁性载基因热控释脂质体。
与现有技术相比，本发明取得了如下有益效果：
1.采用化学共沉淀法成功制备出锰锌铁氧体磁性纳米粒子，之后用聚乙烯亚胺修饰，制备的聚乙烯亚胺/锰锌铁纳米粒子透射电镜下大小为30～40nm，分散性良好，傅立叶红外光谱分析见聚乙烯亚胺的特征峰【参照图4】。聚乙烯亚胺/锰锌铁纳米粒子体外磁感应升温能力良好，在频率为200kHz、功率为4kW，输出加热电流为300A的交变磁场照射下，在40分钟内升到最高温度45℃，并保持温度恒定，因此可以作为一种磁感应加热纳米粒来治疗肿瘤。
2.本发明通过改良的薄膜分散加高压匀质法制备出纳米磁性载基因热控释脂质体大小更均一，平均粒径在100nm左右，大部分为单室【参照图1】，磁响应性好，稳定性高，相变温度为42.71℃，其载基因载磁性材料的特性均优于用现有方法制备的脂质体。
3.本发明制备的纳米磁性载基因热控释脂质体首次融入基因治疗的作用，由于聚乙烯亚胺是基因治疗的高度有效的载体，制备的聚乙烯亚胺/锰锌铁纳米粒子能高效捕获抗肿瘤基因，验证实验表明，聚乙烯亚胺/锰锌铁纳米粒子能携带pEGFP质粒DNA进入HepG2细胞，使其表达绿色荧光蛋白，在聚乙烯亚胺/锰锌铁纳米粒子高效捕获抗肿瘤基因后，将其再包封入脂质体中作为基因转移载体，这种方法无免疫原性与细胞毒性，不会导致细胞的转化和细胞的死亡，并且在较长的时间内对肝功能和肾功能等器官没有明显的毒副作用。
4.本发明制备的纳米磁性载基因热控释脂质体与以往的磁性脂质体相比，一个最重要的特点是它通过脂质体自身包封的锰锌铁磁性纳米粒子在外界磁场的作用下自动升温到肿瘤的最适治疗温度并且持续控温来实现基因的热控释，它将相变温度和磁性材料升温做了更精确的结合。这种依据本身的性能来实现相变温度的转变的特性，可以使脂质体的释基因的控制变得相对简单便利，同时，交变磁场的作用使脂质体的热控释变得可控性更强，实现肿瘤治疗定时定部位且允许基因缓慢释放，有效地延长作用时间，并维持有效的产物浓度，提高局部的抗肿瘤效果。
5.一定量的纳米磁性载基因热控释脂质体局部注射到移植瘤内，在频率为200kHz、功率为4kW、输出加热电流为300A的交变磁场照射下，可以在15min内使肿瘤区温度迅速升温45℃左右，并在以后的时间里保持恒温，而周围正常组织温度基本不变，表明该方法具有靶向定位加热和恒温的治疗作用，且体内肿瘤的治疗实验证明其治疗效果优于以往的脂质体剂型。
6.一定量的纳米磁性载基因热控释脂质体联合磁感应加热体外作用于肿瘤细胞对细胞具有很强的生长抑制和促凋亡作用，与以往的磁性脂质体治疗肿瘤相比，效果更加显著(P＜0.05)。
7.纳米磁性载基因热控释脂质体是一种能集热疗、基因治疗于一体的新型抗肿瘤制剂，并且具有磁靶向、热控释、针对治疗、副作用小等多重优点，因此是极具应用前景的抗肿瘤新途径。
附图说明
图1是本发明制得的纳米磁性载基因热控释脂质体。
图2是PEI/MZF转移pEGFP质粒进入HepG2细胞的绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况。
图3是纳米磁性载药载基因热控释脂质体的升温曲线，说明其具有稳定升温并恒定控温的功能。
图4是傅立叶红外光谱分析，上方的曲线是锰锌铁纳米粒子，下方曲线为聚乙烯亚胺/锰锌铁纳米粒子，可见聚乙烯亚胺的特征峰。
具体实施方式
实施例  一种作为治疗癌症药物的纳米磁性载基因热控释脂质体的制备方法：
第一步：将硫酸锰MnSO₄·H₂O、硫酸锌ZnSO₄·7H₂O、硫酸亚铁FeSO₄·7H₂O按摩尔比1∶1∶4混合得到组合物，置于电动粉碎机中粉碎成末，然后按照所述组合物中的金属离子与氢氧化钠NaOH摩尔比1∶2.4称取氢氧化钠并用蒸馏水溶解，再将氢氧化钠水溶液加入到粉末中并用电动搅拌机搅拌三小时，静置12小时后置80℃烤箱中干燥，再置马弗炉内400℃焙烧1小时，冷却后将材料研细成粉末状，用50～60℃蒸馏水浸洗6～8次以去除可溶性硫酸钠无机盐，之后用无水乙醇淋洗，60℃烘干，得锰锌铁磁性纳米粒子MZF-NP，
第二步：用浓度为5g/l的草酸溶液将锰锌铁磁性纳米粒子配成质量分数为4％的磁流体混悬液，超声分散后离心弃上清液，并将离心后的锰锌铁磁性纳米粒子加入到磷酸盐缓冲液中，边超声边加入0.2倍锰锌铁磁性纳米粒子质量的聚乙烯亚胺PEI充分混匀，再超声1小时，磁力搅拌2小时，使反应充分形成稳定的聚乙烯亚胺/锰锌铁纳米粒子(PEI/MZF)，分别用蒸馏水、乙醇反复洗涤6次，干燥后将聚乙烯亚胺/锰锌铁纳米粒子与绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP充分混合，室温放置30分钟，得载基因锰锌铁磁性纳米粒子，
第三步：二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC与胆固醇按质量比5∶3混合置于茄形瓶中，并加入二棕榈酰磷脂酰胆碱中脂质成分10倍体积的氯仿和无水乙醚的混合液，氯仿和无水乙醚体积比为2∶1，超声3分钟使其完全溶解，用薄膜旋转蒸发器在42℃下恒温真空旋转蒸发，直到有机溶剂完全挥发，在茄形瓶内壁形成一均匀薄膜；在磷酸盐缓冲液中加入0.4～0.5倍DPPC与胆固醇总质量的明胶，在60℃±5℃水浴中待明胶溶解后加入1.5～2倍DPPC与胆固醇总质量的载基因锰锌铁磁性纳米粒子，室温超声处理3～5分钟，形成混悬液，将此混悬液加到上述含薄膜的茄形瓶中，电动搅拌震荡至薄膜脱落，转速为2000转/分，再加甘油1ml，混匀，置于-20℃中冷冻1～2小时，37℃融化，超声处理30秒后再置于-20℃中1～2小时，如此反复冻融及超声处理3次即得纳米磁性载基因热控释脂质体。