一种化合物及其应用于单胺氧化酶活性的荧光检测方法.pdf

本发明公开了一种新化合物及其制备方法，所述的化合物可以作为荧光探针，应用于单胺氧化酶活性的荧光检测方法中。本发明提供一种新的化合物作为荧光探针，所用荧光探针的制备所需要的设备简单，操作过程简便，原料来源都已商品化容易得到，并且所制备的单胺氧化酶荧光探针性质很稳定，纯度也很高，而且本发明提供的荧光探针在用于单胺氧化酶活性的荧光检测方法时，与以前所用的检测单胺氧化酶活性的基本方法相比，其精确度、灵敏度和检测速率都有很大的提高，耗时则仅需几分钟。

1.  一种如式(I)所示的化合物：

式(I)中，R₂为如式(II)～式(VI)所示的荧光基团之一：
；
式(I)中，R₁为C1～C10的烷基、C2～C10的烯基、C3～C10的炔基、苯基、苄基或含有下列一个或两个以上取代基的芳香基，所述的取代基为C1～C5的烷基、卤素、羧基、硝基、叠氮基、C2～C5的酯基、C2～C5的烯基；式(IV)或式(VI)中，R₃、R₄或R₅各自独立为H、C1～C6的烷基、卤素、羧基、硝基、叠氮基、C2～C5的酯基或C2～C5的烯基。

2.  如权利要求1所述的化合物，其特征在于所述的R₁为CH₃、C₂H₅、C₃H₅、C₃H₃或苄基。

3.  如权利要求1所述的如式(I)所示的化合物的制备方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：(a)如式C所示的4-卤代吡啶和卤代烃R₁X反应，得到式A所示的1-取代-4-卤代吡啶盐，所述X为F、Cl、Br或I，Y为Cl、Br或I；(b)有机溶剂中，步骤(a)得到的式A所示的1-取代-4-卤代吡啶盐与荧光化合物H-R₂在碱性物质的作用下，反应得到式B所示的吡啶类化合物，所述的碱性物质为无机碱性物质或有机碱性物质；(c)步骤(b)得到的式B所示的吡啶类化合物与硼氢化钠进行还原反应得到式(I)所示的化合物；

R₂为如式(II)～式(VI)所示的荧光基团之一：

R₁为C1～C10的烷基、C2～C10的烯基、C3～C10的炔基、苯基、苄基或含有下列一个或两个以上取代基的芳香基，所述的取代基为C1～C5的烷基、卤素、羧基、硝基、叠氮基、C2～C5的酯基、C2～C5的烯基；式(IV)或式(VI)中，R₃、R₄或R₅各自独立为H、C1～C6的烷基、卤素、羧基、硝基、叠氮基、C2～C5的酯基或C2～C5的烯基。

4.  如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的无机碱性物质为碳酸钾、碳酸钠、甲醇钠、氢氧化锂、氢氧化钾、氢氧化钠或氢化钠；所述的有机碱性物质为三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、吡啶或哌啶；所述的有机溶剂为DMF、DMSO、CH₃CN或C1～C5的脂肪醇。

5.  如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：
(a)如式C所示的4-卤代吡啶在-10～50℃下，与卤代烃R₁X反应10～15小时，反应结束后即得到式A所示的1-取代-4-卤代吡啶盐，所述X为F、Cl、Br或I；(b)步骤(a)得到的式A所示的1-取代-4-卤代吡啶盐与荧光化合物H-R₂在碱性物质的作用下，以DMF为溶剂，室温下反应12～16小时，反应结束后反应液过滤，取滤饼得到式B所示的吡啶类化合物，所述的碱性物质为Na₂CO₃、K₂CO₃、NaOH、LiOH、KOH、三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、吡啶或哌啶；(c)步骤(b)得到的式B所示的吡啶类化合物在-10～30℃温度下，与硼氢化钠进行还原反应，反应结束后反应液分离处理得到式(I)所示的化合物纯品；所述4-卤代吡啶、荧光化合物H-R₂、卤代烃R₁X、碱性物质、硼氢化钠的物质的量之比为1∶1∶6～10∶1～10∶1～20。

6.  如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的步骤(c)中，反应液分离处理方法为：反应结束后，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用乙酸乙酯萃取，取有机层经过干燥、过滤、蒸干，即得所述式(I)所示的化合物粗品，式(I)所示的化合物粗品进行柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为5∶1的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，得到式(I)所示的化合物纯品。

7.  如权利要求1所述的如式(I)所示的化合物作为荧光探针，应用于单胺氧化酶活性的荧光检测。

8.  如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的单胺氧化酶活性的荧光检测的方法为：以如式(I)所示的化合物作为荧光探针，单胺氧化酶水解荧光探针形成荧光物质，测定荧光强度，从而获得单胺氧化酶活性强度。

9.  如权利要求8所述的单胺氧化酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述的方法为：将待测单胺氧化酶活性的样品溶于浓度50mM，pH值为7.4的PBS缓冲液中得到待测单胺氧化酶活性的样品溶液，待测单胺氧化酶活性的样品溶液按体积比1∶10加入pH值为7.4～9.0的硼酸缓冲液中，25～40℃恒温预热5～10分钟后，加入荧光探针的DMSO溶液，得到反应液，反应液立即加入96孔筛板中，观测荧光强度变化，获得单胺氧化酶活性强度数据，所述方法中加入荧光探针的DMSO溶液的量要使反应液中荧光探针的终浓度为5～600umol/L。

10.  如权利要求8所述的单胺氧化酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述的方法为：将待测单胺氧化酶活性的样品用浓度50mM，pH值为7.4的PBS缓冲液溶于离心管中得到待测单胺氧化酶活性的样品溶液，待测单胺氧化酶活性的样品溶液按体积比1∶10加入浓度50mM、pH值为7.4的硼酸缓冲液中，35℃恒温预热后，加入荧光探针的DMSO溶液，得到荧光探针的终浓度为50～500μmol/L的反应液，反应液立即在96孔筛板中用全功能荧光分光光度计检测荧光强度，分析荧光强度与时间的关系后获得单胺氧化酶活性强度数据。

一种化合物及其应用于单胺氧化酶活性的荧光检测方法
(一)技术领域
本发明涉及一种新化合物，所述的化合物可以作为荧光探针，应用于单胺氧化酶活性的荧光检测方法中。
(二)背景技术
单胺氧化酶是一类线粒体膜结合酶，它在大脑和周围神经组织中催化生物体内的胺类化合物，氧化脱氨生成相应的醛。研究表明单胺氧化酶在代谢多巴胺的过程中，伴随产生自由基和过氧化氢等内源性物质，其表达量的异常与帕金森病和抑郁症有着极其密切的关系。此外测定分析患者血液中单胺氧化酶活性，对于急、慢性肝炎，肝硬化早期诊断具有重要价值。因此寻找高灵敏度的单胺氧化酶的检测方法具有较大的科研和临床应用价值。然而目前临床诊断中所用的荧光试剂采取非直接法检测单胺氧化酶的活性，准确性不高。
目前有多种方法检测单胺氧化酶的活性：紫外法，分光光度法，放射性法以及荧光法等。前两种方法的灵敏度不高，而放射性法虽具有较高的灵敏度，但是它需要放射性标记的化合物，操作上有一定的危险性。
因此，设计出一种更为快速、灵敏、有效的单胺氧化酶的检测方法是相当必要和迫切的，而荧光探针作为一种非放射性的标记技术，因其具有较好的安全性和较高的灵敏度而被广泛应用于细胞内、外酶蛋白活性的检测。目前虽然有一些通过荧光探针检测和分析单胺氧化酶的方法，但其制备都较为复杂，缺少一种简单、有效的荧光探针检测方法。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种单胺氧化酶活性的荧光检测方法，方法所用到的荧光探针是一种新化合物，其制备方法简单，性质稳定，检测的精确度、准确度高，检测速度快。
本发明采用的技术方案如下：
一种如式(I)所示的化合物：

式(I)中，R₂为如式(II)～式(VI)所示的荧光基团之一：

式(I)中，R₁为C1～C10的烷基、C2～C10的烯基、C3～C10的炔基、苯基、苄基或含有下列一个或两个以上取代基的苯基或萘基，所述的取代基为C1～C5的烷基、卤素、羧基、硝基、叠氮基、C2～C5的酯基或C2～C5的烯基；式(IV)或式(VI)中，R₃、R₄或R₅各自独立为H、C1～C6的烷基、卤素、羧基、硝基、叠氮基、C2～C5的酯基或C2～C5的烯基。
所述的R₁优选为CH₃、C₂H₅、C₃H₅、C₃H₃或苄基。
所述的R₂优选如式(II)所示的荧光基团。
本发明还提供所述的如式(I)所示的化合物的制备方法，所述的方法包括以下步骤：(a)如式C所示的4-卤代吡啶和卤代烃R₁X反应，得到式A所示的1-取代-4-卤代吡啶盐，所述X为F、Cl、Br或I，Y为Cl、Br或I；(b)有机溶剂中，步骤(a)得到的式A所示的1-取代-4-卤代吡啶盐与荧光化合物H-R₂在碱性物质的作用下，反应得到式B所示的吡啶类化合物，所述的碱性物质为无机碱性物质或有机碱性物质；(c)步骤(b)得到的式B所示的吡啶类化合物与硼氢化钠进行还原反应得到式(I)所示的化合物；

R₂为如式(II)～式(VI)所示的荧光基团之一：

R₁为C1～C10的烷基、C2～C10的烯基、C3～C10的炔基、苯基、苄基或含有下列一个或两个以上取代基的芳香基，所述的取代基为C1～C5的烷基、卤素、羧基、硝基、叠氮基、C2～C5的酯基、C2～C5的烯基；式(IV)或式(VI)中，R₃、R₄或R₅各自独立为H、C1～C6的烷基、卤素、羧基、硝基、叠氮基、C2～C5的酯基或C2～C5的烯基。
所述的无机碱性物质优选为碳酸钾、碳酸钠、甲醇钠、氢氧化锂、氢氧化钾、氢氧化钠或氢化钠；所述的有机碱性物质优选为三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、吡啶或哌啶；所述的有机溶剂为DMF、DMSO、CH₃CN或C1～C5的脂肪醇，优选DMF。
较为具体的，本发明所述的如式(I)所示的化合物的制备方法包括以下步骤：(a)如式C所示的4-卤代吡啶在-10～50℃(优选0～5℃)下，与卤代烃R₁X反应10～15小时，反应结束后即得到式A所示的1-取代-4-卤代吡啶盐，所述X为F、Cl、Br或I；(b)步骤(a)得到的式A所示的1-取代-4-卤代吡啶盐与荧光化合物H-R₂在碱性物质的作用下，以DMF为溶剂，室温下反应12～16小时，反应结束后反应液过滤，取滤饼得到式B所示的吡啶类化合物，所述的碱性物质为Na₂CO₃、K₂CO₃、NaOH、LiOH、KOH、三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、吡啶或哌啶；(c)步骤(b)得到的式B所示的吡啶类化合物在-10～30℃(优选0～5℃)温度下，与硼氢化钠进行还原反应，反应结束后反应液分离处理得到式(I)所示的化合物纯品；所述4-溴吡啶、荧光化合物H-R₂、卤代烃R₁X、碱性物质、硼氢化钠的物质的量之比为1∶1∶6～10∶1～10∶1～20。
所述的步骤(c)中，反应液分离处理方法为：反应结束后，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用乙酸乙酯萃取，取有机层经过干燥、过滤、蒸干，即得所述式(I)所示的化合物粗品，式I所示的化合物粗品进行柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为5∶1的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，得到式(I)所示的化合物纯品。
本发明如式(I)所示的化合物可作为荧光探针，应用于单胺氧化酶活性的荧光检测。所述的单胺氧化酶活性的荧光检测的方法为：以如式(I)所示的化合物作为荧光探针，单胺氧化酶水解荧光探针形成荧光物质，测定荧光强度，从而获得单胺氧化酶活性强度。
进一步，所述的单胺氧化酶活性的荧光检测的方法为：将待测单胺氧化酶活性的样品溶于浓度50mM，pH值为7.4的PBS缓冲液中得到待测单胺氧化酶活性的样品溶液，待测单胺氧化酶活性的样品溶液按体积比1∶10加入pH值为7.4～9.0的硼酸缓冲液中，25～40℃恒温预热5～10分钟后，加入荧光探针的DMSO溶液，得到反应液，反应液立即加入96孔筛板中，观测荧光强度变化，获得单胺氧化酶活性强度数据。
所述方法中加入荧光探针的DMSO溶液的量要使反应液中荧光探针的终浓度为5-600umol/L。
较为具体的，所述的单胺氧化酶活性的荧光检测的方法为：将待测单胺氧化酶活性的样品用浓度50mM，pH值为7.4的PBS缓冲液溶于离心管中得到待测单胺氧化酶活性的样品溶液，待测单胺氧化酶活性的样品溶液按体积比1∶10加入浓度50mM、pH值为7.4的硼酸缓冲液中，35℃恒温预热后，加入荧光探针的DMSO溶液，得到荧光探针的终浓度为50～500μmol/L的反应液，反应液立即在96孔筛板中用全功能荧光分光光度计检测荧光强度，分析荧光强度与时间的关系后获得单胺氧化酶活性强度数据。
预热时可在恒温水浴摇床中进行，预热时间以5～10min为宜。检测荧光强度时可在全功能荧光分光光度计中的96孔筛板中检测。
所述的香豆素类化合物以为4-甲基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素为例，所述的单胺氧化酶活性的荧光检测方法按照以下步骤进行：将待测单胺氧化酶活性的样品用浓度50mM，pH值为7.4的PBS缓冲液溶于离心管中得到待测单胺氧化酶活性的样品溶液，取100体积份待测单胺氧化酶活性的样品溶液放入1000体积份50mM pH7.4的硼酸缓冲液中，置于恒温水浴摇床中，35℃预热5min，加入5体积份浓度为0.1M 4-甲基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素，在96孔筛板中用全功能荧光分光光度计检测荧光强度，分析荧光强度与时间的关系后获得单胺氧化酶活性强度数据。
由于荧光强度与酶活强度成线性关系，因此可根据荧光强度的高低来定性判断酶活强度，并且可根据米氏方程将得到的荧光强度换算出单胺氧化酶活性的各种反应常数。
本发明与现有技术相比，其有益效果体现在：
(1)提供一种新的化合物作为荧光探针，所用荧光探针的制备所需要的设备简单，操作过程简便，原料来源都已商品化容易得到，并且所制备的单胺氧化酶荧光探针性质很稳定，纯度也很高(99％以上)；
(2)与以前所用的检测单胺氧化酶活性的基本方法相比，其精确度、灵敏度和检测速率都有很大的提高，耗时则仅需几分钟。
(四)附图说明
图1为实施例5探针选择性试验的检测结果图。
图2为实施例6加入单胺氧化酶抑制剂的对比图。
图3为单胺氧化酶浓度与荧光强度关系图
(五)具体实施方式：
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
实施例1、制备4-甲基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素

0.1mmol(15.8mg)4-溴吡啶在0℃下与0.6mmol(85.2mg)碘甲烷反应12小时，反应结束后即得到1-甲基-4-溴吡啶盐，将1-甲基-4-溴吡啶盐、0.1mol(14.6mg)香豆素、0.2mmol(10.8mg)甲醇钠在20ml DMF溶剂中，室温下反应12小时，反应结束后反应液过滤，取滤饼在0℃温度下，与0.2mmol(7.2mg)硼氢化钠进行还原反应，反应结束后反应液中加入饱和NaCl水溶液，用乙酸乙酯萃取，取有机层经过干燥、过滤、蒸干，得到粗品，粗品进行柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为5∶1的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.4的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，得到4-甲基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素纯品25.1mg，收率92.6％，纯度99.6％(核磁共振)；
1HNMR(CDCl3，500MHz)
δ2.97-3.00(m，2H，J＝2.83Hz，)，2.61-2.66(t，2H，J＝5.75Hz)，2.33-2.35(s，3H)，2.36-2.36(s，3H)，5.09-5.12(t，1H，J＝3.25Hz)，6.10-6.12(s，1H)，6.89-6.93(m，2H，J＝2.5Hz)，7.44-7.77(d，1H，J＝8.5Hz)
13CNMR(150MHz，CDCl3)
δc160.45(C)，154.88(C)，152.32(C)，150.39(C)，115.18(C)，112,83(CH)，107.45(CH)，105.93(CH)，77.36(CH)，77.10(CH)，76.49(CH)，52.90(CH2)，51.97(CH2)，45.29(CH3)，27.22(CH2)，18.70(CH3)
实施例2：制备4-烯丙基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素

与实施例1的方法和条件相同，所不同的是，将0.6mmol(85.2mg)碘甲烷改为0.6mmol(100.8mg)丙烯酰碘，其他操作和方法同实施例1，制得4-烯丙基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素26.5mg，收率89.2％，纯度99.7％。
1HNMR(CDCl3，500MHz)
δ2.42-2.43(d，3H，J＝1.0Hz)，2.43-2.47(s，2H)，2.80-2.86(t，2H，J＝5.5Hz)，3.15-3.12(s，2H)，3.21-3.25(d，2H，J＝6.5Hz)，5.15-5.153(t，1H，J＝3.5Hz)，5.23-5.32(m，2H，J＝4.8Hz)，5.92-6.02(m，1H，J＝4.2Hz)，6.18-6.22(s，1H)，6.98-7.00(d，1H，J＝2.5Hz)，7.01-7.05(m，1H，J＝3.7Hz)，7.54-7.57(d，1H，J＝9.0Hz)
13CNMR(150MHz，CDCl3)
26.57(CH3)，49.03(CH2)，50.39(CH2)，60.28(CH2)，76.75(C)，77.00(C)，77.26(C)，105.70(C)，106.72(C)，112.46(C)，114.87(C)，115.01(CH)，125.59(CH)，133.90(CH)，150.35(C)，152.46(C)，154.55(C)，159.00(C)
实施例3制备4-苄基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素

与实施例1的方法和条件相同，所不同的是，将0.6mmol(85.2mg)碘甲烷改为0.6mol(130.8mg)苄基碘，其他操作和方法同实施例1，制得4-苄基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素31.2mg，收率90％，纯度99.3％。
1HNMR(CDCl3，500MHz)
δ2.38-2.43(m，3H，J＝1.0Hz)，2.43-2.46(d，2H，J＝2.5Hz)，2.78-2.88(s，2H)，3.16-3.22(s，2H)，3.72-3.80(d，2H，J＝4.0Hz)，5.14-5.18(t，1H，J＝3.5Hz)，6.18-6.21(d，1H，J＝1.0Hz)，6.96-7.00(d，1H，J＝1.0Hz)，7.01-7.05(m，1H，J＝4.0Hz)，7.30-7.34(t，1H，J＝2.5Hz)，7.35-7.398(t，2H，J＝7.0Hz)，7.41-7.45(d，2H，J＝7.0Hz)，7.55-7.57(d，1H，J＝8.5Hz)
13CNMR(150MHz，CDCl3)，
δc161.04(CH)，159.37(C)，154.88(C)，152.43(C)，150.46(C)，157.92(C)，129.14(CH)，128.37(CH)，127.29(CH)，125.75(CH)115.14(CH)，112.79(CH)，107.72(CH)，105.75(CH)，77.41(CH).77.16(CH)，76.90(CH)，62.03(CH2)，50.90(CH2)，49.47(CH2)，27.15(CH2)，18.76(CH2)
实施例4：
以从大鼠肝提取的单胺氧化酶为例，用实施例1制备的4-甲基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素作为荧光探针检测单胺氧化酶活性：
粗酶的提取：称取大鼠肝5.1254g，用4℃磷酸缓冲液洗3遍，洗去血水，加入4ml的磷酸缓冲液碾磨。在碾磨液中加入10ml磷酸缓冲液匀浆。匀浆后加入100ml 0.3mol/L的蔗糖溶液(预冷3℃)，以3000rpm，离心10min取上层清夜，再10000rpm离心30min，取沉淀，加50ml磷酸缓冲液二次匀浆，均匀分装于10支离心管，得到单胺氧化酶提取液，作为单胺氧化酶的待测样品，-80℃低温保存。
其中粗酶浓度的测定：
取一支离心管，准确量取一定体积V的酶液，将其冻干，称其粉末状固体的质量M，得到粗酶的浓度为M/V。
将从大鼠肝提取的单胺氧化酶的待测样品1mL，用50mL浓度50mM，pH值为7.4的PBS缓冲液溶于离心管中得到待测单胺氧化酶活性的样品溶液，取100μL待测单胺氧化酶活性的样品溶液加入1mL浓度50mM、pH值为7.4的硼酸缓冲液中，置于恒温水浴摇床中，35℃恒温预热5min，加入2.5μl浓度为0.1M的4-甲基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素得到反应液，反应液中荧光探针的终浓度为230μmol/L，反应液立即加入96孔筛板中用全功能荧光分光光度计检测。
实验证明，只要存在微量的单胺氧化酶，就能高效的水解荧光探针，通过全功能微孔板检测系统可以测定，并且随着单胺氧化酶的浓度增大，荧光强度从1000增加到50000(如附图3)，变化的幅度较大，而且单胺氧化酶的浓度与荧光强度成线性关系，通过荧光强度就可以直观地得出单胺氧化酶的活性的变化，再根据米氏方程得到酶的各种反应常数。
实施例5选择性试验
采用与实施例1相同的方法，所不同的是将单胺氧化酶换为下列酶制剂，分别对底物进行作用：脂肪酶(EC 3.1.1.3Type VII from Candidarugosa，和hog pancreas国药集团化学试剂有限公司)，磷酸酶(Phosphatase，Alkaline bovine)，多种蛋白酶(Protease fromAspergillus oryzae，Protease from Aspergillus sojae，Protease frombovine pancreas)和一种复合酶(BS-031江门市莲江区拜奥生物化学厂)，结果显示，只有单胺氧化酶显示强烈的荧光，结果如图1所示，只有单胺氧化酶能使底物转化，也说明了起到水解作用的是我们提取所得的单胺氧化酶，而其他的酶对底物没有作用。
实施例6：
取100μl pH7.4的PBS缓冲液，加入实施例5制得的单胺氧化酶提取液15μl，0.1mM的单胺氧化酶抑制剂--盐酸羟胺溶液2μl，置于35℃恒温水浴摇床中，30分钟后，加入2.5μl 4-甲基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素，在全功能荧光分光光度计中的96孔筛板中用全功能荧光分光光度计检测，实时检测荧光强度。
实验证明，单胺氧化酶的活性被盐酸羟胺抑制后，用我们制备的荧光探针检测不出活性，结果如图2所示。
实施例7～9
采用实施例1的方法，将4-甲基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素分别用以下香豆素类化合物替代作为荧光探针，实施例7为4-乙基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素、实施例8为4-烯丙基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素，实施例9为4-苄基-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)-香豆素，结果表明单胺氧化酶对这类探针具有不同选择性。