识别血小板膜糖蛋白的单克隆抗体 及其在抗血栓治疗中的应用 【技术领域】
本发明涉及医学免疫领域。更具体地说，本发明涉及可识别血小板表面抗原的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，含有该单克隆抗体的抗血小板药物及其在抗血栓治疗中的应用。
背景技术
1.血栓栓塞所引起或并发的病变，约为癌瘤的3倍之多，而且是最常见的死亡病因之一，是当前严重危害人类健康的疾病。因此防止血栓形成，是当代医学研究的一个重点和热点。作为血栓的主要组成成份，血小板在血栓的形成中起着关键作用。血小板在正常循环血液中处于静息状态。当血管破损暴露出血管内皮下胶原等结构，血小板就会通过其表面膜糖蛋白直接与血浆蛋白如von Willebrand因子(vWF)结合而粘附于血管破损处内皮下组织。粘附的血小板或当血小板受到在凝血过程或组织损伤过程中产生的血小板活化剂作用时发生变形，伸出伪足，进而释放细胞内颗粒内容物。同时血小板膜糖蛋白(GP)IIb-IIIa复合物被激活形成粘附分子受体，该受体与纤维蛋白原(纤原)的结合便能促使血小板之间相互粘附、聚集成团，最终导致在血管破损处形成血小板血栓(Plow EF，Ginsberg MH.Cellular adhesion：GPIIb/IIIa as a prototypic adhesion receptor.Progress in Haemostasis and Thrombosis.1989；9：117-124)。血小板血栓的形成在动脉血栓栓塞性疾病，包括急性心肌梗死等冠状动脉血栓形成的发病过程中起重要作用，因此一类抗血小板药物已成为包括冠心病在内的动脉血栓栓塞性疾病的重要治疗手段(Becker RC.Thrombinantagonists and antiplatelet agents.Am J Cardiol 1992；69：39E；阮长耿。单克隆抗体与血栓性疾病的诊断与治疗。中国科学技术前沿(中国工程院版)2001；第四卷：131-145页.)。目前临床上常用的抗血小板药物有阿斯匹林、双嘧达莫、噻氯匹啶等，但是这些药物只能作用于血小板活化地某一环节，它们的疗效都不如血小板受体GPIIb-IIIa拮抗剂。血小板受体GPIIb-IIIa拮抗剂直接抑制血小板聚集的最终共同途径，阻断纤原与血小板GPIIb-IIIa的结合就能抑制血小板聚集，使血小板血栓不能形成，从而成为临床上强力、高效和特异的抗血小板药物，显示出良好的应用前景。血小板受体GPIIb-IIIa拮抗剂有三类：单克隆抗体，如c7E3，人工合成肽，如Eptifibatide及非肽类小分子物质，如Tirofiban(阮长耿.单克隆抗体与血栓性疾病的诊断与治疗。中国科学技术前沿(中国工程院版)2001；第四卷：131-145页；Verstraete M.Synthetic inhibitors ofplatelet GPIIb/IIIa in clinical development.Circulation.2000；101(6)：76-80)。
单克隆抗体(McAb，单抗)技术始创于1975年，在医学和生物学的基础研究以及疾病的诊断和治疗中发挥了很大作用。但随着单抗在临床上的广泛应用，人们发现鼠源性单抗药物存在一些问题：鼠源性抗体用于人体后产生的人抗鼠抗体(HAMA)反应；抗体分子量较大，抗体分子到达靶部位的量不足；抗体本身效应功能不强等，使抗体治疗效果不理想。针对这些问题，人们对抗体进行人源化改造，如常见的人鼠嵌合抗体，制备单链抗体等小分子量抗体片段以及制备双功能抗体等研究。7E3是1983年美国研究人员制备的一株鼠源性抗膜糖蛋白IIb-IIIa单克隆抗体(Coller BS，Peerschke EI，Scudder LE etal.A murine monoclonal antibody thatcompletely blocks the binging of fibrinogen to platelet producesa thrombas thenic-like state in normal platelet and bind toglycoprotein IIb/IIIa.Journal of Clinical Investigation.1983；72(1)：325-328)。1992年改造为人鼠嵌合抗体片段c7E3(Knight DM，Wagner C，Jordan R，etal.The immunogenicity of the 7E3 murine Fabmonoclonal-antibody fragment variable region in dramaticallyreduced in humans by substitution of human for murine constantregions.M0lecular Immunology.1995；32(16)：1271-1281)。大规模临床观察表明它具有良好的抗栓功能，已通过FDA批准，在国外广泛用于缺血性心脏病的治疗，显示了这类药物良好的应用前景。
然而，单克隆抗体c7E3的不足在于它仅作用于血小板表面的一个抗原决定簇，它仅从一个角度去封闭受体，因而它难以达到完全抑制血小板聚集的作用。因此，临床上，人们一直在寻找新的、能够更有效的抑制血小板聚集的单克隆抗体。
发明简述
本发明的第一个方面是提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原决定簇的单克隆抗体。
本发明的第二个方面是提供了新的、能够产生抗血小板表面糖蛋白特定抗原决定簇的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明的第三个方面是提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原决定簇的单克隆抗体的制备方法。
本发明的第四个方面是提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原决定簇的单克隆抗体片段。
本发明的第五个方面是提供了新的、能够有效抑制血小板聚集的药物组合物。
【附图说明】
图1显示研制产生单抗R813和Y262的杂交瘤细胞的流程图。
图2显示纯化单抗R813和Y262 IgG的电泳分析。
图3显示Western印迹转移电泳图谱，(R813和Y262结果)。
图4显示单抗R813和Y262亲和层析产物电泳分析，其中A为蛋白质标记物，B为R813非还原性产物，C为蛋白质Marker，D为Y262非还原性产物。
图5显示单克隆抗体R813和Y262与血小板结合活性，1为阴性对照，2为阳性对照SZ-22，3为单克隆抗体R813，4为单抗Y262。
图6显示125I标记单克隆抗体R813和Y262的放射免疫竞争抑制试验结果。
图7显示制备单克隆抗体R813和Y262 F(ab′)2的电泳分析。
发明详述
按照本发明的第一个方面，提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原决定簇的单克隆抗体。
我们运用人血小板免疫Balb/c小鼠，研制成功了一批抗血小板GPIIIa或抗血小板GPIIb-IIIa的单克隆抗体(约20个克隆)，经过反复筛选、检测，证明Y262，Y321，Y474和R813能良好地抑制血小板聚集的功能。运用125I标记单克隆抗体的放射免疫竞争抑制试验和流式细胞术平均荧光强度叠加法发现本发明单抗所识别血小板表面糖蛋白的不同抗原决定簇，其中第一组单克隆抗体选自：R813、Y88、Y128、Y474，它们特异性地识别血小板GPIIIa，而第二组单抗选自：Y8、Y262、Y291、Y295、Y321、Y342、Y458、Y585、Y700，它们特异性地识别血小板受体GPIIb-IIIa复合物。优选的本发明第一组单抗是单抗R813，优选的本发明第二组单抗是单抗Y262。
按照本发明的第二个方面，提供了新的、能够产生抗血小板表面糖蛋白特定抗原决定簇的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。具体地说，本发明提供了分别能够产生上述第一组单抗和第二组单抗的杂交瘤细胞系，它选自：产生识别血小板GPIIIa单克隆抗体的杂交瘤细胞R813、Y88、Y128、Y474和产生识别血小板GPIIb-IIIa复合物单克隆抗体的杂交瘤细胞Y8、Y262、Y291、Y295、Y321、Y342、Y458、Y585、Y700。其中优选的是杂交瘤R813和Y262，这两株杂交瘤细胞已按照布达佩斯条约的规定，于2002年4月30日保藏于国际保藏单位—中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号分别为CGMCC No.0740和CGMCC No.0741。
按照本发明的第三个方面，提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原决定簇的单克隆抗体的制备方法。该方法包括利用人血小板作免疫原免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合，研制产生识别血小板GPIIIa或IIb-IIIa复合物单克隆抗体的杂交瘤细胞，运用ELISA，FCM，Western印迹，亲和层析等方法鉴定单克隆抗体的抗原决定簇和观察单抗与血小板结合活性，并制备腹水与纯化单克隆抗体。
按照本发明的第四个方面，提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原决定簇的单克隆抗体片段。运用木瓜酶消化法制备单克隆抗体R81 3和Y262 F(ab′)2片段并经过SDS-PAGE鉴定，观察单抗R813和Y262 F(ab′)2片段及其“鸡尾酒”的血小板聚集功能抑制活性。
按照本发明的第五个方面，提供了新的、能够有效抑制血小板聚集的药物组合物，该药物组合物含有一种或多种本发明的单克隆抗体，并根据需要含有药学上可接受的载体或辅助剂。
在本发明的一优选实施方案中，运用125I标记单克隆抗体放射免疫竞争抑制法和流式细胞术平均荧光强光叠加法筛选出针对不同抗原决定簇的抗体R813和Y262。将Y262和R813联合作用于血小板发现此二个单抗联合作用能完全抑制ADP诱导的血小板聚集反应，且抗体用量少(总量6～7μg/ml)。试验结果表明，单抗R813和Y262作用于血小板受体GPIIb-IIIa的不同位点，二者组成的单克隆抗体“鸡尾酒”完全阻断了纤原与血小板受体GPIIb-IIIa的结合，彻底抑制血小板聚集活性。且其F(ab′)2片段仍能达完全抑制血小板聚集活性，生物活性超过c7E3(商品名为Reopro)。使用两株单抗组成单抗的“鸡尾酒”，100％封闭了血小板膜糖蛋白IIb-IIIa的受体功能，这在国际上尚属首创，其生物活性超过了Reopro(c7E3)。Reopro只是作用在血小板受体GPIIb-IIIa的一个位点，从一个角度去封闭受体，达到50％血小板聚集抑制率所需抗体量为5.5ug/ml。我们研制成功的“鸡尾酒”作用于血小板受体GPIIb-IIIa上两个不同位点，在空间构型上全面封闭纤维蛋白原和受体的结合，达到50％抑制率所需的抗体量仅为3.3ug/ml，不仅明显降低了单克隆抗体用量，而且血小板聚集功能抑制作用也大大增强，超过了Reopro(c7E3)。为降低单抗作用时的HAMA反应，同时减小分子量，增加靶部位抗体浓度，我们将单抗R813和Y262用酶解法改造为F(ab’)2片段(有研究表明单纯鼠源性抗体F(ab’)2片段的HAMA反应并不比嵌合抗体大，且其亲和力高，可直接用于治疗)。体外试验表明此二株抗体的F(ab’)2片段联合作用仍能完全阻断血小板受体GPIIb-IIIa功能，完全抑制血小板聚集。
本发明的优点在于：本发明研制了作用于血小板受体GPIIb-IIIa不同位点的单抗R813和Y262，它们均能良好抑制血小板聚集功能，将这二株抗体联合在一起组成“鸡尾酒”可以完全阻断血小板受体GPIIb-IIIa的功能，彻底抑制血小板聚集功能。我们发明的单抗“鸡尾酒”生物活性超过了国际著名的抗血小板药物Reopro且用量少。将抗体用酶解法制备成F(ab’)2片段，保存生物活性的同时也降低了抗体分子量，使到达作用靶部位的抗体量增加。去除Fc端还降低了HAMA反应和减少了因与网状内皮系统结合而导致的血小板破坏。此外，酶解法操作简单，成本低廉。因此，强力高效的生物活性，低廉的成本，简单的操作使得本发明具有巨大的抗栓治疗潜力和市场前景。
以下借助非限制性实施例举例详细描述本发明。
实施例1：产生单抗R813和Y262杂交瘤细胞的制备
1.1材料：
Balb/c小鼠购自Charles River Laboratories Inc.Canada，SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞，慢性骨髓瘤性白血病细胞(K562)，急性淋巴母细胞白血病细胞(MOLF-4)，人急性T细胞白血病细胞(Jurkat E6-1)均购自美国ATCC公司，D-MEM/F12，RPMI1640，L-G lutamine，MEMnon-Es sential，HT Supplement，HAT Suplement，Antibiotic-Antimycotic均为GIBCO公司产品，8-Azaguanie为Sigma公司产品，50％PEG1500Solution为ROCH产品，鼠抗体亚类分型试剂盒为Biorad公司产品，其余试剂为国产分析纯。
1.2方法：
正常成人抗凝全血分离出血小板，TEN洗涤3次，PBS悬浮并调血小板数为1×108细胞/毫升，取0.2ml注入8周龄雌性Balb/C小鼠腹腔，4周后重复，再过4周0.2ml血小板悬液注入小鼠尾静脉，3日后处死小鼠，取出脾脏制成脾细胞悬液。将108脾细胞与1×107处于对数生长期的SP2/0-Ag14细胞用常规方法融合，依次用HAT培养基，HT培养基各培养2周，接着换用普通完全培养基。其间对出现细胞克隆者用血小板包被的酶标板做ELISA检测，结果发现有20多个杂交瘤细胞克隆与血小板有显著的结合反应。对与血小板反应阳性的并经过筛选的杂交瘤细胞克隆用有限稀释法进行3次亚克隆，尔后逐步转入24孔板、培养瓶培养，并制备腹水(见图1)。由此获得12株能稳定分泌抗血小板单抗的细胞株，它们是R813、Y8、Y88、Y128、Y262、Y291、Y295、Y321、Y458、Y474、Y585和Y700。采用流式细胞术观察这些抗体与人红细胞，白细胞，慢性骨髓瘤白血病细胞(K562)，急性淋巴母细胞白血病细胞(MOLF-4)和人急性T细胞白血病细胞(Jurkat E6-1)反应，结果显示这12株抗体与这些细胞均无交叉反应。同时对产生这些抗体的细胞进行核型分析表明它们确为杂交瘤细胞。应用单抗亚类分型试剂盒(Biorad)进行分析，结果显示单抗R813、Y128、Y321、Y458、Y474、Y585和Y700为IgG1，Kappa；单抗Y8和Y295为IgG2a，Kappa；单抗Y88、Y262和Y291为IgG2b，Kappa。连续几年对其中两个优选单抗R813和Y262的杂交瘤细胞株动态观察，证明这两株杂交瘤细胞株能长期稳定分泌高效价的单抗。现两株细胞已建成生产细胞库。
实施例2：抗体R813和Y262 IgG的制备和纯化
2.1材料：
Pristane为Sigma公司产品，Balb/C小鼠购自上海实验动物中心，Protein G 1ml预装柱为Pharmacia公司产品，其余试剂均为国产分析纯。
2.2方法：
以1ml Pristane注入雄性10周龄Balb/c小鼠腹腔致敏，一周至二周后分别将R813和Y262杂交瘤细胞1～10×106注入致敏后的小鼠腹腔，一周左右开始观察并收集腹水。小鼠腹水以0.02M PB(pH7.0)4℃透析过夜，随后4℃离心10000转/分×15分去除沉淀，0.2μm滤器过滤。滤过液1ml/次加入Protein G柱，0.02M PB(pH7.0)平衡及洗去杂蛋白，0.1MGly-HCl(pH2.7)洗脱IgG并收集之。收集产物经PBS透析后浓缩定量，并经10％SDS-PAGE鉴定。结果表明腹水中抗体含量约8mg/ml，纯化后抗体纯度在90％以上(见图2)。
实施例3：抗体R813和Y262的血小板结合活性研究
3.1材料：
血小板来自正常成年志愿者全血，GAM-FITC为上海华美公司产品，GAM-HRP为Sigma公司产品，CNBr-Sepharose 4B为Pharmacia产品，蛋白质标记物为上海生化所西巴斯公司产品，蛋白质组成为43KD、66KD、97KD、130KD和200KD，其余试剂均为国产分析纯试剂。
3.2方法：
(1)ELISA法测定抗体R813和Y262与血小板结合活性：健康人抗凝全血，分离出富含血小板血浆(PRP)，TEN溶液洗3次，以5×105血小板/孔包板，4℃过夜，2％BSA-PBS 37℃封闭2小时，0.5％戊二醛固定，0.01％Tween20-PBS洗涤，GAM-HRP为二抗，OPD显色，常规ELISA测定492nm处的戏光A492值。同时以鼠IgG为阴性对照，以SZ-22(抗血小板GPIIbα)为阳性对照。结果表明R813和Y262具有良好的血小板结合活性。
(2)流式细胞术测定抗体R813和Y262与血小板结合活性：5ul PRP(血小板浓度为5×108/ml)加入50ul 1∶100稀释的抗体R813和Y262小鼠腹水，室温放置30分钟，洗涤后加入GAM-FITC，流式细胞仪(CoulterEPICSR，XL)检测。同时以鼠IgG为阴性对照，同样稀释度之SZ-22为阳性对照。结果表明R813和Y262具有血小板结合能力(见图5)。
(3)Western印迹测定抗体R813和Y262与血小板膜蛋白结合位点：EDTA抗凝全血分离PRP，TEN溶液洗3次，调整血小板数至2×108/ml，加入1mmol/L PMSF，1％Triton X-100裂解血小板后，离心取上清，按60ul/孔加样，进行非还原5％-15％对数梯度SDS-PAGE，转移至硝酸纤维薄膜，2％BSA-PBS封闭后，裁剪成不同条带，加R813和Y262抗体37℃温育2小时，GAM-HRP为二抗，最后加氯萘酚显色。同时以鼠IgG为阴性对照，SZ-22抗体为阳性对照。结果表明，R813作用于血小板GPIIIa，而Y262未见反应(见图3)。
(4)亲和层析测定R813和Y262抗体与血小板膜蛋白作用位点：将CNBr-Sepharose 4B凝胶用1mmol/L盐酸溶胀4小时，偶联缓冲液洗涤3次，将纯化之R813，Y262经充分透析后加入凝胶，4℃振荡16小时。在砂芯漏斗内经偶联缓冲液洗涤，1mmol/L乙醇胺浸泡2次，每次1小时，依次用偶联缓冲液，25mmol/L Tris-HCl，TBS抽滤，最后将偶联后的凝胶装柱。同方法(3)中制备血小板破碎液，将2×109血小板的破碎液循环上样，然后用0.05mol/L二乙胺-5mmol/L EDTA缓冲液洗脱。洗脱物经PBS透析后浓缩用10％SDS-PAGE鉴定。结果表明R813作用抗原为GPIIIa，而Y262作用抗原为GPIIb-IIIa复合物(见图4)。
实施例4：抗体R813与Y262分别与血小板受体GPIIb-IIIa复合物的不同位点作用
4.1材料：
125I购自中国原子能总公司，Sephadex G-25凝胶为phamacia公司产品，其余试剂均为国产分析纯试剂。
4.2方法：
125I标记R813放射免疫竞争抑制试验：30ug R813(1mg/ml)加入10ul0.1mol/LPB pH 7.5；1mGi 125I及5mg/ml ChT 10ul，室温静置1分钟，后加入20mg/ml Na2S2O8 20ul室温静置1分钟，之后加入100ul 0.5％BSA-PBS。该反应物加入0.5％BSA-PBS预平衡的Sephadex G-25凝胶柱，同样溶液洗脱，每管收集10滴。γ计数仪(国营262厂，FJ2008)测定放射性计数，收集第一个放射性峰。同前血小板包板，以不同浓度鼠IgG，R813，Y262与固定浓度125I-R813混合后加入包被板，37℃温育2小时后，洗涤3次，γ计数仪检测放射性计数。结果表明随R813浓度增加，包被每孔放射性计数下降，而放射性计数不随Y262和鼠IgG浓度改变而变化，说明Y262与R813作用抗原位点不同(见图6)。
实施例5：抗体R813与Y262协同封闭血小板GPIIb-IIIa复合物，充分抑制血小板聚集功能
5.1材料：
ADP为上海丽珠东风生物制品公司产品，GAM-FITC为上海华美公司产品，其余试剂均为国产分析纯试剂。
5.2方法：
(1)流式细胞术平均荧光强度叠加实验：5ul PRP分别与抗体R813，Y262及二者混合物作用室温30分钟，洗涤后加入GAM-FITC，流式细胞仪检测。鼠IgG作为阴性对照。结果表明R813与Y262共同作用对阳性细胞平均荧光强度是两个抗体单独作用时之和，说明R813和Y262可以分别作用于血小板GPIIb-IIIa复合物上各自抗原决定簇，从而能对复合物分子产生协同封闭作用(见表1)。
表1单抗R813和Y262流式细胞术平均荧光强度叠加法实验结果
抗体 阳性细胞百分率(％) 平均荧光强度
PBS 3.22 2.61
鼠-IgG 6.48 3.26
SZ-22 90.2 83.1
R813 87.7 185.7
Y262 73.6 130.9
R813+鼠-IgG 86.4 174.8
R813+SZ-22 92.3 255.4
R813+R813 87.6 180.1
R813+Y262 88.1 338.5
(2)R813，Y262及二者协同抑制ADP诱导血小板聚集实验：枸橡酸抗凝健康成人全血，分离PRP，加入不同浓度的抗体R813，Y262及二者混合物，37℃温育5分钟，然后加入ADP(终浓度5umol/L)，检测聚集结果。鼠IgG为阴性对照，Reopro为阳性对照。结果表明R813与Y262均可良好抑制血小板聚集功能，二者联合作用时相同抗体浓度下对血小板聚集抑制作用增强，可完全阻断血小板聚集功能，其抗栓活性超过Reopro。通过计算还可知50％抑制率用量低于Reopro(见表2、3、4)。
表2.不同浓度单抗对血小板聚集的影响
第一次试验
试验次数 对照 单抗
PBS R813 Y262 7E3
浓度(ug/ml) 0 2.5 5.0 2.5 5.0 2.5 5.0
血小板聚集百分率(％)
1 82％ 63％ 74％ 69％ 75％ 69％ 37％
2 86％ 75％ 46％ 81％ 65％ 53％ 22％
平均值 84％ 69％ 60％ 75％ 70％ 61％ 29.5％
第二次试验
试验次数 对照 单抗
PBS R813 Y262 7E3
浓度(ug/ml) 0 5.0 10.0 5.0 10.0 5.0 10.0
血小板聚集百分率(％)
平均值 59％ 53％ 22％ 64％ 28％ 47％ 43％
第三次试验
试验次数 对照 单抗
PBS R813 Y262
浓度(ug/m l) 0 5.0 10.0 5.0 10.0
血小板聚集百分率(％)
1 61％ 60％ 23％ 67％ 54％
2 72％ 68％ 40％ 58％ 52％
平均值 66.5％ 64％ 31.5％ 62.5％ 53.5％
表3.单抗R813、Y262及其“鸡尾酒”(DiMab)对血小板聚集的影响
第一次试验
试验次数 对照 单抗
PBS Dimab R813 Y262
浓度(ug/m l) 0 10 10 10
血小板聚集百分率(％)
1 73％ 0％ 42％ 62％
2 77％ 0％ 51％ 54％
平均值 75％ 0％ 46.5％ 58％
第二次试验
试验次数 对照 单抗
PBS Dimab
浓度(ug/ml) 0 0.625 1.25 2.50 5.0 10.0
血小板聚集百分率(％)
1 62％ 67％ 55％ 61％ 30％ 4％
2 74％ 70％ 63％ 61％ 17％ 5％
3 67％ 88％ 66％ 58％ 25％ 7％
平均值 67.7％ 75％ 61.3％ 60％ 24％ 5.3％
第三次试验
试验次数 对照 单抗
PBS Dimab 7E3
浓度(ug/ml) 0 1.25 2.50 5.0 10.0 1.25 2.50 5.0 10.0
血小板聚集百分率(％)
1 44％ 30％ 19％ 14％ 0％ 54％ 35％ 23％ 5％
2 49％ 38％ 38％ 8％ 0％ 53％ 31％ 28％ 6％
平均值 46.5％ 34％ 28.5％ 11％ 0％5 3.5％ 33％2 5.5％ 5.5％
表4.单抗“鸡尾酒”(DiMab)与7E3的50％血小板聚集抑制率用量
DiMab 7E3
ug/ml 3.13 5.26
实施例6：抗体R813与Y262 F(ab′)2片段制备与鉴定
6.1材料：
木瓜酶为上海丽珠东风生物公司产品，DEAE-52凝胶购自中科院上海生化所西巴斯公司，DTT为Fluka公司产品，其余试剂均为国产分析纯试剂。
6.2方法：
(1)R813和Y262F(ab′)2片段的制备和鉴定：R813与木瓜酶质量比5∶1混匀4℃作用24h，碘乙酰胺(终浓度80mmol/L)终止反应，0.01mol/LTris-HCl pH 8.0透析后，上DEAE-52离子交换柱，0～0.3mol/L NaCl0.01mol/L Tris-HCl pH 8.0洗脱，收集第一峰。Y262与木瓜酶质量比为80∶1混匀4℃作用35分钟，再加入木瓜酶与Y262质量比为1∶160，混匀4℃作用35分钟，接下同R813终止反应并纯化，不同的是收集第2个洗脱峰。将收集物作还原及非还原10％SDS-PAGE。结果表明，经木瓜酶消化后并纯化得到两种抗体之F(ab′)2片段。(见图7)
(2)R813和Y262 F(ab′)2片段抑制ADP诱导的血小板聚集试验：方法同前，结果表明R813和Y262 F(ab′)2片段仍可以协同作用，完全抑制血小板聚集功能。(见表5)
表5.抗体F(ab’)2片段对血小板聚集功能抑制作用
1.25 2.50 5.00 10.00 ug/ml
血小板聚集抑制率(％)
R813 16.2 11.8 76.5 82.4
Y262 35.1 42.9 61.0 55.8
DiMab 17.5 17.5 81.3 100
虽然上面结合实施例对本发明进行了具体描述，但是本领域熟练技术人员均了解，在不背离本发明的原则和精神的情况下，根据本说明书及所附权利要求书中公开的内容，可对本发明做出各种变动和改进。因此，所有这些变动和改进均应包括在所附权利要求书中所要求的保护范围之内。