丹酚酸B 相关申请案
本案主张于2001年8月30日美国临时申请案60/316,167号的优先权，其内容在本文引用作为参考。
背景技术
Ross于1993 Nature 362：801-809文中公开了氧化低密度脂蛋白(oxLDL)为致粥状瘤过程中的一种关键物质。而Harada-Shiba等人于1998 J.Biol.Chem.273：9681-9687文中公开了氧化低密度脂蛋白可于过渡金属的存在下由自氧化反应生成，或由细胞调节性机制及酶调节机制而生成。其招致了动脉粥样硬化过程中的早期变化，如巨噬细胞及平滑肌细胞转变为泡沫细胞、血管细胞附近的不同的发炎前驱组织细胞因子和生长因子的生产，以及血管细胞的增生和迁移等。Morel等人则于1984Arteriosclerosis 4：357-364文中公开了由于上述变化引发了动脉壁内的一连串细胞反应而导致了动脉病变的形成。此外，由于氧化低密度脂蛋白的毒性亦影响了动脉粥样硬化过程的较后阶段。因此，可转换氧化低密度脂蛋白的药剂的发现提供了治疗或防止由氧化低密度脂蛋白引发的疾病或相关症状的有效治疗法。
发明内容：
本发明的特征之一为一种发现自中药(如丹参)的化合物(例如丹酚酸B)作为治疗或预防氧化低密度脂蛋白所引发的疾病的药剂的用途。
一方面，本发明的特征为一种氧化低密度脂蛋白所引发的对心血管系统的炎性损伤的治疗方法。上述方法包括对需要其的主体给予有效量的含丹酚酸B(salvianolic acid B)的组合物。该对心血管系统的炎性损伤导致动脉粥样硬化。上述主体可为动物或为人，例如为一具有氧化低密度脂蛋白引发心血管系统炎性损伤的人类患者。
在一些实施方案中，丹酚酸B占上述组合物重量的0.01％-80％。上述组合物可为营养医学组合物或为药学组合物。在其他实施方案中，自丹参浓缩富集所述丹酚酸B。
在此，“治疗”定义包括存在疾病的治疗，改善病症，缓和病症，或防止病症的发展或进展。
另一方面，本发明的特征为一种氧化低密度脂蛋白所引发的对心血管系统炎性损伤的治疗方法，包括：对需要其的主体给予有效量的含第一、第二和第三中药萃取物的组合物，其中自丹参浓缩富集所述第一中药萃取物，自当归浓缩富集所述第二中药萃取物，和自甘草浓缩富集所述第三中药萃取物。在一些实施方案中，所述第一、第二及第三中药萃取物的比例分别在2∶0∶0至2∶2∶2(例如2∶1∶1)之间。
本发明的另一特征为一种含有第一、第二及第三中药萃取物的组合物(例如为营养医学组合物或药学组合物)。自丹参浓缩富集所述第一中药萃取物，自当归浓缩富集所述第二中药萃取物，和自甘草浓缩富集所述第三中药萃取物。在一些实施方案中，所述第一、第二及第三中药萃取物的比例分别在2∶0∶0至2∶2∶2(例如2∶1∶1)之间。上述组合物可进一步包含包含有药用载体。
另一方面，本发明的特征为一种物理性创伤(例如内皮细胞的损伤)引发的对心血管系统损伤的治疗方法。上述方法包括对需要其的主体给予有效量的含丹酚酸B的组合物。上述对心血管系统的损伤可以导致再狭窄。在一些实施方案中，自丹参浓缩富集所述第一中药萃取物，且其占组合物(例如营养医学组合物或药学组合物)重量的0.01％-80％。
本发明的另一方面为一种含有丹酚酸B和药用载体的药物组合物。上述药物组合物可用于治疗前述的疾病。组合物中的丹酚酸B可由有机化学品的合成或自天然来源的纯化而得到，并以一种药用盐类的形式存在。上述药用盐类可形成于丹酚酸B上的带负电取代基(例如羧酸脂)和阳离子间。适当的阳离子包括但不局限于钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和诸如四甲基铵离子的铵离子。
通过下列的详细描述，本发明的其他优点或特征会更加明显。
发明的详细描述
Men’shikov等人于1952/Gen.Chem.22：1465-1467；Delorme等人于1977 Plant Med.Phytother.11：5-11；Ogihara等人于1997 Bull.Coll.Sci.64：53-59；Lin等人于1999 J.Nat.Prod.62：1500-1503；Crowley和Culvenor于1955 J.Aust.J.Chem.8：464-465；Li等人于1984 Planta.Medica.50：227-228；Lee等人于1987 J.Nat.Prod.50：157-160以及Ai等人于1988 J.Nat.Prod.51：145-149等参考资料中公开了丹酚酸B是发现自中国中药中，如含有至少50种化合物的丹参根部。丹酚酸B可由以下所述的方法自丹参的根部浓缩而得。方法之一为利用含乙醇和水的溶剂萃取。方法之二为首先将经捣碎的丹参根浸泡于适当量的水以溶解其中的丹酚酸B，接着收集上清液部分，并将上清液与键结含丹酚酸B的有机化合物的吸附珠(例如Diaion HP-20)一起温育，及利用例如含10-90％乙醇水溶液的洗涤液将丹酚酸B自吸附珠上洗脱出来。在另一实例中，可由一足够量的乙酸乙酯将丹参根中非水溶性成份去除；然后利用一水和乙醇的混合物(约1∶4，体积比)萃取丹酚酸B，且重复此萃取步骤数次。而上述地萃取液于合并及浓缩后便接着通过一DiaionHP-20分离柱。利用水和甲醇的混合物作为展开溶剂(developing solvent)且分级收集洗脱液。将每一份洗涤液利用薄膜层析法分析。合并上述含有丹酚酸B的级分，故更可利用Sephadex LH-20分离管柱，以80％的甲醇为展开溶剂(developing solvent)以获得含丹酚酸B的产物。
经浓缩的含丹酚酸B产物的纯度可由例如为柱层析法或高效液相色谱法的适当方法所测定。该浓缩富集的产物作为制备营养科学产品的丹酚酸B来源。此类的营养科学产品包括含重量百分比0.01-1％的丹酚酸B的牛奶或饮品或含重量百分比1-80％的丹酚酸B的胶囊或片剂。另外，经浓缩富集的含丹酚酸B产物可作为制备药物组合物的丹酚酸B来源。此外，上述经浓缩富集的丹酚酸B亦可作为品质控制分析的标准试剂。
其他浓缩自如当归或甘草的萃取物可由如水-乙醇醇萃取法或如前述的相似方法等公知方法制备。
本发明是关于含丹酚酸B的组合物，以及关于用以治疗氧化低密度脂蛋白引发的对心血管系统炎性损伤以及物理性创伤(例如percutaneoustransluminal coronary angioplasty：PTCA方法)引发的对心血管系统损伤的含有效量的丹酚酸B药物组合物。上述有效量是定义为给予具有前述疾病而需要治疗的主体的适当量的丹酚酸B以治疗上述主体的疾病。适当量的丹酚酸B可为10毫克/成人/天至1000毫克/成人/天。且此适当量亦可为本领域技术人员，根据要治疗的疾病的种类、服用的方法、赋型剂的用法以及与其他如抗炎剂等具有同用途的治疗方式的使用而变化。
为实行本发明的治疗方法，丹酚酸B可由口服、胃肠外施用，并可由喷射吸入、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道施用，或经植入储库施用。在此“胃肠外”包含皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、关节滑液内、胸骨内、椎管内、疾病部位内及颅内的注射或输注等方式。
而口服的组合物可为任一口腔可接受的药剂形式，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂及水性混悬液、分散液及溶液的形式。以口服的片剂为例，其所使用的载体通常包括乳糖及玉米淀粉。如硬脂酸镁的润滑剂也通常加入。当以胶囊为口服方式时，则包括乳糖或经干燥过的玉米淀粉作为有效的稀释剂。当以水性混悬液或乳剂为口服方式时，此活性成份可结合乳化或混悬剂而混悬或溶解于油相中。如有需要，亦可加入适当的甜味剂、香料剂或着色剂。而鼻用啧雾剂或吸入剂的组合物则可依据公知药用制剂技术，采用苯甲醇或其他合适的防腐剂、以增加生物利用度的吸附剂氟碳化物，和/或其它本领域已知的增溶剂或混悬剂。
无菌注射剂组合物，例如为无菌的可注射水溶液或可注射油性混悬剂，可依据公知技术由采用适当的分散剂或润湿剂(例如Tween 80)和混悬剂制备而成。此无菌的可注射制备物可为在无毒性非口服的稀释液或溶剂内的无菌可注射溶液或混悬液，例如为1，3-丁二醇溶液。而可采用的适当赋形剂及溶剂为甘露醇、水、Ringer溶液及生理盐水溶液。此外，通常亦采用无菌的凝固油脂作为溶剂或混悬介质(例如合成的单或双甘油酯)。油酸及其甘油酯衍生物等脂肪酸皆适用于注射剂的制备，以作为天然的医药用油脂，如橄榄油或调味油，特别是其聚氧乙烯化形式(polyoxyethylate versions)。此等油性溶液或混悬液亦可包含有一长链的醇类稀释剂或分散剂，或为羧甲基纤维素或相似分散剂。其他常用的表面活性剂如Tweens或Spans或其他常用于医药用固体、液体或其他配药形式制备中的类似乳化剂或生物利用度提高剂(bioavailabilityenhancers)，也可用于制剂的目的。
医药用组合物中的载体必须与制剂中的活性成份相容(优选地，并能稳定的)，且须无害于受治疗的主体。例如，助溶剂如环状糊精，可与丹酚酸B形成特定且更易溶的合成物或可利用一种或多种的助溶剂以作为传递单酚酸B的药用赋形剂。其他的载体包括胶体二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、十二烷基硫酸钠及D&C yellow#10。
无需进一步详述，相信根据上文描述足以实施本发明。因此，下列具体的实施方案仅是举例说明，决不是以任何方式限定本发明的范围。所有本文提及的公开文献在本文全文引用作为参考。
【具体实施方式】
丹酚酸B对氧化低密度脂蛋白引发的对心血管系统炎性损伤的影响
将人类主动脉平滑肌细胞(HASMCs，Cascade biologics，Inc.)置于231培养基(Cascade biologics，Inc.)中，补充以5％的平滑肌生长血清(SMOS)、100单位/毫升的青霉素、100微克/毫升的硫酸链霉素、1.25微克/毫升的两性霉素B，于37℃、5％二氧化碳饱和湿度气氛下培养。上述培养基每四天更换一次，且由0.05％胰蛋白及0.02％EDTA溶液处理上述细胞而将其分离。针对人类主动脉平滑肌细胞(HASMCs)的第4-9节处理并加以研究。并于每次实验前，先移除上述培养基，将细胞清洗后并于具有上述成份(无SMGS)的无血清培养基中培养。
将人类主动脉平滑肌细胞(HASMCs)置于各含有0、1、1.25、10或20微克/毫升的丹酚酸B(经纯化)的上述无血清培养基中培养24小时。然后，加入40微克/毫升的氧化低密度脂蛋白于此培养基中并经过24小时。藉由Boyd于Principle of Practice of Oncology，Devita，J.T.，Hellman，S.和Rosenberg，S.A.(Eds)Vol.3，PPO Update，No.10，1989中所描述使用的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)分析方法来测定细胞毒性影响。此外，另采用2.5微克/毫升的经证实可减低动脉硬化的丙丁酚(probucol)进行上述测试以作对照之用。数据显示，人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)与0、1、1.25、10或20微克/毫升的丹酚酸B及氧化低密度脂蛋白一起培养后的细胞存活力各为23.5％(±7.4％)、68.3(±5.3％)、57.5％(±14.4％)、57.6％(±18.7％)及38.3％(±18.8％)。而采用丙丁酚处理过细胞的细胞存活力则与经20微克/毫升的丹酚酸B处理过细胞表现相似。
氧化低密度脂蛋白引发caspase-3活化的抑制
将人类主动脉平滑肌细胞(HASMCs)与20微克/毫升的氧化低密度脂蛋白培养各6、12、24或48小时，或与1或10微克/毫升的丹酚酸B(经纯化)培养24小时后接着与20微克/毫升的氧化低密度脂蛋白培养24小时。将细胞(3×10
5/每次分析)溶于5微升的0℃苯甲基磺酰化氟及50微升的溶解缓冲液(由20毫摩尔的Tris、pH7.5、150毫摩尔的氯化钠、1毫摩尔的EDTA、1％的Triton X-100、2.5毫摩尔的焦磷酸钠、1毫摩尔的β-甘油磷酸、1毫摩尔Na
3VO
4及1微克/毫升的Leupeptin)中10分钟后，接着于4℃、15000g下离心10分钟由6倍的样品缓冲液(由125毫摩尔Tris-盐酸、pH6.8、4％SDS、20％甘油、100毫摩尔DTT及0.02％溴酚蓝)稀释15微升的含蛋白质上清液以得到样品溶液。将上述样品溶液于100℃下加热5分钟，于冷却至室温并置于12％的SDS-聚丙烯酰凝胶电泳下。然后，再将蛋白质转移至PVDF薄膜，经含5％脱脂牛奶的Tris-Tweens 20(0.1％)缓冲生理盐水于室温下2小时以阻断，且于4℃下与抗兔抗caspase-3抗体(稀释比1∶1000)培养一夜。将上述薄膜利用Tris-Tweens 20(0.1％)缓冲生理盐水冲洗三次，并且经与辣根过氧化物配对的山羊抗兔IgG(0.2微克/毫升)及LumiGLO化学发光检测剂(请参照Bradford于1976 Analytical Biochem 72：248-254)以检测抗体的反应。
于经氧化低密度脂蛋白处理过后，可于人类主动脉平滑肌细胞(HASMCs)内测得经活化的caspase-3(17kD)。然而，于经过丹酚酸B的处理后，并无观察到任何活化的caspase-3。上述结果显示丹酚酸B具有抑制氧化低密度脂蛋白引发的caspase-3活化的作用。
氧化低密度脂蛋白引发IL-1β及IL-1ra生产的抑制
将人类主动脉平滑肌细胞(HASMCs)置于含有0、1、1.25、10或20微克/毫升的丹酚酸B或2.5微克/毫升的丙丁酚中培养24小时，接着用20微克/毫升的氧化低密度脂蛋白进行处理24小时。IL-1生产是采用抗IL-1抗体(例如来自于R&D system的IL-1β或来自Endogen有限公司的IL-1ra ELISA试剂)通过sandwich ELISA测定。其结果显示1、2.5、及10微克/毫升的丹酚酸B具有抑制氧化低密度脂蛋白所引发IL-1β及IL-1ra生产的功效。上述数据亦显示了氧化低密度脂蛋白处理48小时后IL-1β生产增加，且另外24小时后达到一高原区。1、2.5、10微克/毫升丹酚酸B剂量个别对氧化低密度脂蛋白引发IL-1β和IL-1ra生产表现出相似的抑制效果。
细胞因子白介素-1(IL-1)为炎性反应中的主要介体(请参照Dinarello&Wolff于1993 N.Engl.J.Med.328：106-113)。如此，可有效调节IL-1生产的试剂便可应用于治疗IL-1相关的炎性疾病。尤其是当心血管系统中炎性疾病可以导致动脉粥样硬化以及与更严重的心血管疾病密切相关。
含丹酚酸B的组合物；SAGE
SAGE中中药成分的选择
关于SAGE(为丹参、当归及甘草萃取物的缩写)中草药成份的选择是基于下列观察及实验结果。
a.Cu
2+引发人类低密度脂蛋白氧化作用的抑制能力。
b.于高葡萄糖预先处理过的低密度脂蛋白及来自于糖尿患者的低密度脂蛋白的抑制能力(是经观察当归及甘草的水溶液及乙醇萃取物中的生物活性)。在上述分析中，并加入丙丁酚(一种亲脂性抗氧化物及降胆固醇的药物)，trolox(一种水溶性维他命E的相似物)及氨基胍(一种针对糖化反应及糖化促进的氧化反应的抑制剂)以作为阳性对照；
c.经比较不同豆科的中国中药植物对于低密度脂蛋白氧化作用的抑制的生化分析、其活性、及考虑毒物学的低毒性，甘草具有不错的表现；以及
d.SAGE(为丹参、当归及甘草萃取物的缩写)具有较低的毒物学考虑。
SAGE对于氧化低密度脂蛋白引发的对心血管系统炎性损伤的影响
将七个月ApoE(-)小鼠分为两组。于对照组(CT组)中的动物将以含有0.15％(w/w)胆固醇食物(对照食物)喂养。而测试组将以更含有0.6％的SAGE(自丹参、当归及甘草的萃取物，比例分别为2∶1∶1)的对照食物喂养。上述喂养的周期为四个月。
上述小鼠的主动脉弓将被移除，并固定于4％聚甲醇的含磷生理盐水内三小时，接着利用蜡包埋并贴覆于聚-L-赖氨酸显微镜玻片上。经原位杂交分析法检验发现有粥状硬化斑以及上述粥状硬化斑内的IL-1β的mRNA及IL-1ra的mRNA的表达。
杂交DNA探针是采购自R&D。将组织样本置于玻片上，且在相同条件下杂交。在脱蜡后再经过再水合作用后，将上述玻片与0.1摩尔的Tris-盐酸及50毫摩尔的EDTA于37℃下培养5分钟，经由蛋白酶K(1微克/毫升)于37℃下处理15分钟，利用于0.1摩尔三乙醇胺中的0.25％的乙酐将其乙酰化，且于42-50℃下与DNA探针杂交16-20小时。最后，上述玻片清洗后，并与碱性磷酸酯酶酵素的链霉抗生物素反应，且用含氮蓝四唑(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)的缓冲液处理。
在对照组中，IL-1βmRNA及IL-1ra的表达则非常显著。而于SAGE组中，IL-1βmRNA的表达则在统计上为不显著，且并未发现IL-1ra的表达。
丹酚酸B对于心血管系统损伤的影响
将纽西兰白兔随机地分为三组。其中一组兔子以100克/天的含2％胆固醇食物喂养(对照食物，对照组)。另一组兔子则以更含1.5克/天的丙丁酚的上述对照食物喂养，并且第三组兔子则以更含375毫克/天的丹酚酸B的上述对照食物喂养。并于喂养三周后，所有的兔子均接受股骨的动脉摘除手术。在上述手术后，各组均各维持上述喂养食物三周。
经采用摘除自上述兔子的主动脉弓、胸主动脉或腹主动脉片段并将的固定于4％聚甲醇溶液内三小时，并将其转移至盐水内，并进行蜡包埋程序以评估血管组织的改变。并经化学染色组织法将此薄切片(5微米厚)着色。应用LV-2电脑辅助的形质平面测量器以计算内膜及血管中层区域，参见Gordon等人于1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11312-11316。在对照组中，主动脉弓内的内膜对血管中层的比例为0.22(±0.04)。于含丹酚酸B组，上述比例约为0.07；而于丙丁酚组，上述比例约为0.1。再者，在对照组中，胸主动脉内的内膜对血管中层的比例为0.1(±0.02)。于含丹酚酸B组中，上述比例约为0.02；于丙丁酚组中，上述比例为0.3。此外，在对照组中，腹主动脉内的内膜对血管中层的比例为0.58(±0.03)。于含丹酚酸B组中，上述比例约为0.26；于丙丁酚组中，上述比例为0.33。
丹酚酸B和SAGE对心血管系统损伤的影响
将来自于杰克森实验室25周大的ApoE(-)小鼠分为三组。于对照组(CT组)中的动物将以含有0.15％(w/w)的胆固醇食物喂养(对照食物)。而第二组(SB组)将以更含有0.25％丹酚酸B的上述对照食物喂养；而第三组(SAGE组)将以含有0.2％(w/w)SAGE的上述对照食物喂养。而上述喂养的周期为113天。其结果如表一所示。而SAGE则以下列方法制备：
丹参萃取物是由丹参切片及其地根，经乙醇水溶液(水∶乙醇＝4∶1∶v/v)萃取而来。而丹参重量于萃取溶剂的体积比为1∶10(w/v)。
当归萃取物是由乙醇萃取物(1∶10，w/v)所得到。
甘草萃取物是由乙醇萃取物(1∶10，w/v)所得到。
上述丹参萃取物、当归萃取物、甘草萃取物间的分别比例为2∶1∶1，是基于其中药原料的干燥重量比。
表一：于ApoE(-)小鼠中的粥状硬化区
区域 CT(n＝4) SB(n＝6) SAGE(n＝6)
血管中层(103μm2) 20581±18343 9763±2239 10900±3224
内膜(103μm2) 21056±29427 1563±2504 2129±2588
内膜/血管中层(比例) 0.770±0.490 0.128±0.170 0.167±0.143
P值 - 0.0164 0.0195
抑制程度 - 83 78
备注1：上述内膜/血管中层比例是计算自同组中每一动物的每一大动脉切片。并非将内膜厚度平均值除以整组中内血管中层。其结果是以均值±S.D.表示。
备注2：对动脉粥样硬化的抑制程度(％)是与对照组比较而得。
其它实施方案
所有说明书中公开的特征可以以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等同或类似目的的其它备选特征代替。因此，除非另有说明，公开的每个特征只是一系列等同或类似特征的一个实例。
从上述说明书，本领域技术人员可以确定本发明的必要技术特征，在不偏离其精神和范围下，可以对本发明进行多种改变和修饰以适应多种用途和条件。例如，例如，也可以制备结构类似于丹酚酸B的化合物用于本发明。因此，其它的技术方案也在权利要求范围内。