用于治疗神经退行性疾病的组合物和方法
本申请于2012年8月27日提交为PCT国际专利申请，以美国公司Cognition Therapeutics,Inc.的名义作为除美国之外的所有指定国的申请人，以美国公民Susan M.Catalano、Gilbert Rishton和Nicholas J.Izzo,Jr.仅作为美国指定的申请人，并要求2011年8月25日提交的美国临时专利申请序列号61/527,584的优先权，该申请整体并入本文以供参考。
技术领域
本发明涉及新的与σ-2受体结合的二芳基氨基化合物，涉及包括这样的化合物的药物组合物，并涉及用其抑制或恢复神经元细胞中的突触丧失、调节神经元细胞中的膜运输变化以及治疗认知衰退和神经退行性疾病和病症的方法。
背景技术
存在五种目前FDA批准用于治疗AD的药物。四种是胆碱酯酶抑制剂：他克林(![]()
Sciele)、多奈哌齐(![]()
Pfizer)、卡巴拉汀(![]()
Novartis)和加兰他敏(![]()
Ortho-McNeil-Janssen)。多奈哌齐、卡巴拉汀和加兰他敏是他克林(第一代化合物，因其肝毒性潜能很少开进药方)的后继者，它们在AD的所有阶段在提供认知和功能的症状改进方面大略同等有效。第五个批准的药物是美金刚(![]()
Forest)，其是低亲和性、使用依赖的N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体拮抗剂，提供相似益处，但对严重AD仅适度。这些化合物的临床效果较小且是非永久性的，并且目前没有结论性的数据支持其作为疾病调修剂的用途。参见例如Kerchner等人,2010,Bapineuzumab,Expert Opin Biol Ther.,10(7):1121-1130。明显地，需要另外可选的治疗AD的方法。
人β淀粉样蛋白(Abeta或Aβ)是在患有阿尔茨海默病的患者大脑中发现的不溶性淀粉样斑块沉积的主要成分。该斑块由Abeta的纤 维状聚集物组成。β淀粉样蛋白原纤维与阿尔茨海默病的晚期相关联。
早期阿尔茨海默病(AD)的认知特点是特别不能形成新记忆。早期记忆丧失被视为是由可溶Αβ寡聚体引起的突触障碍。这些寡聚体阻断长时程增强效应(对突触可塑性的经典实验范式)，并且它们在AD大脑组织和转基因AD模型中显著升高。已推测，早期记忆丧失源自神经元死亡之前的突触障碍，并且突触障碍源自可溶Αβ寡聚体的作用而不是原纤维的作用。Lacor等人,Synaptic targeting by Alzheimer's-related amyloidβoligomers,J.Neurosci.2004,24(45):10191-10200。
Abeta是整合膜蛋白淀粉样前体蛋白(APP)的剪切产物，被发现集中于神经元的突触中。Abeta的可溶形式存在于阿尔茨海默患者的大脑和组织中，且其存在与疾病进展相关。Yu等人,2009,Structural characterization of a soluble amyloid beta-peptide oligomer,Biochemistry,48(9):1870-1877。可溶β淀粉样蛋白寡聚体已证实为引起阻断学习和记忆的神经元突触的改变。
较小的可溶Αβ寡聚体干扰大量对正常突触可塑性而言关键的信号传导通路，最终导致棘(spine)和突触丧失。Selkoe等人,2008,Soluble oligomers of the amyloid beta-protein impair synaptic plasticity and behavior,Behav Brain Res192(1):106-113。阿尔茨海默病作为突触可塑性疾病开始和持续。
可溶Αβ寡聚体的存在被认为是患有前阿尔茨海默病的大脑中早期认知衰退的原因。已知β淀粉样蛋白寡聚体结合于神经元突触且σ-2受体大量存在于神经元和神经胶质。
本发明部分基于如下宽泛的发现，即满足某些条件的σ-2受体拮抗剂抑制可溶Αβ寡聚体的有害作用。在一些实施方式中，使用σ-2受体拮抗剂和组合物来治疗或预防受试者中的突触功能障碍。
发明内容
本发明部分基于以下宽泛的发现，即σ-2拮抗剂，优选还表现出特定治疗表型的其它方面的一种拮抗剂，如下所述参与抑制并且抑制β淀粉样蛋白(“Abeta”或“Αβ”)肽和寡聚体及其其它可溶种类的作用， 因此可以用于治疗与Abeta-诱导的病理学例如阿尔茨海默病相关的包括疾病和障碍的病症。可溶Abeta寡聚体表现为与特异受体结合并干扰对正常突触可塑性而言关键的信号传导通路的可逆药理学配体，最终导致棘和突触丧失。已发现，与σ-2受体结合且表现为功能性神经元拮抗剂的化合物表现出与Abeta寡聚体的药理学竞争。因此，本文所述的σ-2拮抗剂化合物可以降低或防止Abeta寡聚体作用例如Abeta诱导的细胞毒性。本发明还包括用于抑制Abeta寡聚体或其它可溶Abeta种类对神经元细胞的作用，且更广泛而言，β淀粉样蛋白病理学的方法，包括使细胞与根据本发明的σ-2拮抗剂接触。在一些实施方式中，提供用于治疗阿尔茨海默病早期的方法，包括施用治疗有效量的σ-2功能性拮抗剂。
在一个实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是由式I表示的新化合物或其药学上可接受的盐：
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其中
R1和R2独立选自H、OH、卤素、CN、NO2、NH2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、C3-7环烷基、NH(C1-4烷基)、N(C1-4烷基)2、NH(C3-7环烷基)、NHC(O)(C1-4烷基)、(R16)(R17)N-C1-4亚烷基-O-、SH、S(C1-6烷基)、C(O)OH、C(O)O(C1-4烷基)、C(O)(C1-4烷基)和C(O)NH(C1-4烷基)，或者R1和R2连接在一起形成-O-C1-2亚甲基-O-基团，其中
R16和R17独立为H、C1-4烷基或苄基，或者R16和R17与氮一起 形成选自![]()
和![]()
的环，其中
X是CH2、N或O且R18不存在或者是H、未被取代的苯基或被OH、卤素、CN、NO2、NH2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基取代的苯基；并且
其中R1和R2的至少一者不是H；
R3选自
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和![]()
其中
R6、R7、R8、R9、R10和R20独立选自H、OH、卤素、CN、NO2、NH2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、C3-7环烷基、NH(C1-4烷基)、N(C1-4烷基)2、NH(C3-7环烷基)、NHC(O)(C1-4烷基)、SH、S(C1-6烷基)、S(O)2-C1-6烷基、C(O)OH、C(O)O(C1-4烷基)、C(O)(C1-4烷基)和C(O)NH(C1-4烷基)；并且
n是1-4
R4是C1-6烷基；
R4'是H或C1-6烷基；并且
R5是H、C1-6烷基和C(O)O(C1-4烷基)、C(O)(C1-4烷基)或C(O)(C1-4卤代烷基)；或
R3和R5与氮一起形成选自
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和![]()
的环，其中
R11、R12、R14、R15和R19独立选自H、OH、卤素、CN、NO2、NH2、
C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基，并且
Y是CH、N或O；并且
R13不存在或是H、C1-6烷基、C3-6环烷基、未被取代的苯基或被OH、卤素、CN、NO2、NH2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基取代的苯基、或未被取代的苄基或被OH、卤素、CN、NO2、NH2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基取代的苄基。
在另一更具体的实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是由式II表示的新化合物或其药学上可接受的盐：
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其中
R1和R2独立选自H、OH、卤素、CN、NO2、NH2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、C3-7环烷基、NH(C1-4烷基)、NH(C1-4烷基)2、NH(C3-7环烷基)、NHC(O)(C1-4烷基)、SH、S(C1-6烷基)、C(O)OH、C(O)O(C1-4烷基)、C(O)(C1-4烷基)和C(O)NH(C1-4烷基)，或R1和R2连接在一起形成-O-C1-4亚甲基-O-，并且其中R1、R2、R4、R5和R6的至少一者不是H；
R3选自H、卤素和C1-6卤代烷基；
R4＝C1-6烷基；
R5是H、C1-6烷基和C(O)O(C1-4烷基)、C(O)(C1-4烷基)、C(O)(C1-4卤代烷基)；且
R6、R7、R8和R9独立选自H、OH、卤素、CN、NO2、NH2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基。
在一些实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂与σ-2受体结合并且抑制Αβ寡聚体与神经元特别是突触的结合。在一些实施方式中，σ-2拮抗剂与Αβ寡聚体竞争结合至神经元特别是突触，或以其他方式中断Αβ寡聚体结合神经元的能力，例如通过干扰Αβ寡聚体形成或结合至Αβ寡聚体或可能地干扰Αβ寡聚体在伴随结合至神经元时开始运动信号转导机制的能力。在某些实施方式中，σ-2拮抗剂由此抑制非致死Αβ病理效应(“非致死Αβ病理”或“非致死β淀粉样蛋白病理”)，除其它之外包括膜运输缺陷、突触功能障碍、动物中的记忆和学习缺陷、突触数目的减少、树突棘长度或棘形态的改变、或长时程增强效应(LTP)缺陷。换句话说，本发明者观察到，本文说明的在其它检定中具有活性的本发明的σ-2拮抗剂具有将神经元恢复到正常状态或干扰 Αβ寡聚体诱导的突触功能障碍的能力。不拘泥于理论，本发明的σ-2拮抗剂干扰Αβ寡聚体结构、Αβ寡聚体与神经元的结合或Αβ寡聚体诱导的分子信号转导机制中的一种或多种，这可用于对抗Αβ寡聚体的非致死效应以及治疗早期阶段的可溶Αβ寡聚体相关的病理。
在一个实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是功能性神经元拮抗剂且用于抑制神经元细胞中的突触丧失的方法中，该丧失与细胞暴露于一种或多种Abeta寡聚体或其它Abeta复合物，或更广泛而言，包括单体或寡聚或其它可溶复合形式的Abeta肽(如下所述)的Abeta种类相关，该方法包括使所述细胞与一定量的一种或多种σ-2拮抗剂接触，该一定量可有效避免或减少所述丧失或使所述细胞中的突触数目部分或完全恢复到暴露前的水平。
在另一实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂用于调节神经元细胞中膜运输变化的方法中，所述变化与所述细胞暴露于一种或多种Abeta种类相关，该方法包括使所述细胞与一定量的一种或多种σ-2拮抗剂接触，该一定量可有效避免或减少所述膜运输变化，或使其保持在或接近所述细胞暴露于所述Abeta种类之前所观察到的水平。
在另一实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂用于治疗认知衰退的方法中，包括对受试者施用一种或多种本发明的σ-2拮抗剂。
在又一实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是功能性神经元σ-2拮抗剂，其用于治疗认知衰退或神经退行性病症或突触功能和/或数量缺陷的方法中，该方法包括对受试者施用一种或多种本发明的σ-2拮抗剂。
在一些实施方式中，本公开内容提供用于抑制β淀粉样蛋白寡聚体诱导的神经元细胞的突触功能障碍，以及用于抑制由神经元暴露于Abeta寡聚体所引起的海马长时程增强效应的阻抑的包括σ-2受体拮抗剂的组合物和方法。
本发明提供对抑制认知衰退或治疗神经退行性疾病的化合物进行鉴定的方法，该方法包括
使细胞与结合至σ-2受体的化合物接触，并确定所述化合物是否具有至少一种以下附加特性：
(a)其抑制中枢神经元中的突触丧失，所述丧失与神经元暴露于Abeta寡聚体相关；
(b)其抑制中枢神经元中的膜运输异常，该异常与所述细胞暴露于一种或多种Abeta寡聚体相关；
(c)其抑制阿尔茨海默病动物模型中Abeta寡聚体介导的认知效应；或
(d)其抑制阿尔茨海默病动物模型中基于海马的空间学习和记忆衰退。
这样的对非致死β淀粉样蛋白病理的抑制包括抑制认知衰退、抑制神经元细胞中的突触丧失、和抑制神经元细胞中的膜运输变化的方法。
附图说明
图1A是示出在膜运输检定中与含有甲臜的胞内囊泡在体外保持21天的初级海马和皮层培养物的显微照片，其中甲臜得自货物(cargo)四唑盐染料的内吞作用和化学还原。
图1B是示出具有胞外甲臜晶体的同批培养物的显微图，其中胞外甲臜晶体在甲臜胞吐时在神经元和胶质细胞细胞膜的外部形成，且其中细胞在膜运输检定中已经暴露于Abeta寡聚体。该图示出人Abeta1～42寡聚体改变货物染料产物甲臜的表型(胞内囊泡vs.胞外晶体)，因此造成细胞膜运输缺陷。
图1C是示出胞内囊泡的显微图，其中细胞已经暴露于Abeta寡聚体和化合物II二者，化合物II为本发明的选择性高亲和性σ-2拮抗剂化合物。该图示出化合物II能够阻抑由Abeta寡聚体引起的膜运输缺陷，并将膜运输表型恢复至正常。
图1D示出膜运输检定的定量结果，其中y轴表示在施用货物四唑盐染料后在指定时间包含在胞内囊泡中的甲臜产物的量(归一化为媒介物处理的值)。红色的圈表示Abeta寡聚体处理的培养物，蓝色方块表示媒介物处理的对照培养物，且黑色或灰色方块表示用多种浓度的cpd II+Abeta和cpd IXa、IXb+Abeta处理的培养物给出的值(当化合物在Abeta寡聚体之前添加时(预防))。在横坐标中使用化合物的对数浓度。该图示出化合物以剂量依赖的方式抑制Abeta寡聚体对膜运输的作用。
图1E示出与图1D的图类型相同但化合物在Abeta寡聚体之后添加(治疗)的膜运输检定剂量响应曲线。在横坐标中使用化合物的对数浓度。该图示出化合物以剂量依赖的方式抑制Abeta寡聚体对膜运输的作用。
图1F示出在多种浓度的单独合成Abeta寡聚体(EC50820nM)的存在下并具有多种浓度的化合物II和在各个浓度的所得囊泡(作为％媒介物)的与图1D的图类型相同的膜运输检定。通过递增浓度的化合物II的存在，表现出EC50的右移(Schild斜率＝-0.75)。该图表明，cpd II在药理学上与寡聚体竞争靠近介导膜运输的分子靶标，因此化合物II的存在使得合成Abeta寡聚体具有更小的突触毒性。
图1G示出在多种浓度的单独合成Abeta寡聚体的存在下并具有多种浓度的化合物混合物IXa、IXb和在各个浓度的所得囊泡(作为％媒介物)的与图1D的图类型相同的膜运输检定。通过递增浓度的化合物混合物IXa、IXb的存在，表现出EC50的右移(Schild斜率＝-0.51)。该图表明，cpd混合物IXa、IXb在药理学上与寡聚体竞争靠近介导膜运输的分子靶标，因此化合物混合物IXa、IXb的存在使得合成Abeta寡聚体具有更小的突触毒性。
图1H示出在多种浓度的单独的得自人类阿尔茨海默病患者的Abeta寡聚体的存在下并具有多种浓度的化合物II和在各个浓度的所得囊泡(作为％媒介物)的与图1D的图类型相同的膜运输检定。通过递增浓度的化合物II的存在，表现出EC50的右移。该图表明，cpd II在药理学上与寡聚体竞争靠近介导膜运输的分子靶标，因此化合物II的存在使得人类阿尔茨海默病相关的Abeta寡聚体具有更小的突触毒性。
图1I示出在多种浓度的单独的得自人类阿尔茨海默病患者的Abeta寡聚体的存在下并具有多种浓度的化合物混合物IXa、IXb和在各个浓度的所得囊泡(作为％媒介物)的与图1D的图类型相同的膜运输检定。通过递增浓度的化合物混合物IXa、IXb的存在，表现出EC50的右移。该图表明，cpd混合物IXa、IXb在药理学上与寡聚体竞争靠近介导膜运输的分子靶标，因此化合物混合物IXa、IXb的存在使得人类阿尔茨海默病相关的Abeta寡聚体具有更小的突触毒性。
图1J示出在多种浓度的单独合成Abeta寡聚体的存在下并具有多种浓度的化合物CF和在各个浓度的所得囊泡(作为％媒介物)的与图1D的图类型相同的膜运输检定。通过递增浓度的化合物CF的存在，表现出EC50的右移。该图表明，cpd CF在药理学上与寡聚体竞争靠近介导膜运输的分子靶标，因此化合物CF的存在使得合成Abeta寡聚体具有更小的突触毒性。
图1K示出在多种浓度的单独合成Abeta寡聚体的存在下并具有多种浓度的化合物W和在各个浓度的所得囊泡(作为％媒介物)的与图1D的图类型相同的膜运输检定。通过递增浓度的化合物W的存在，表现出EC50的右移。该图表明，cpd W在药理学上与寡聚体竞争靠近介导膜运输的分子靶标，因此化合物W的存在使得合成Abeta寡聚体具有更小的突触毒性。
图1L示出使用从阿尔茨海默病患者中分离的Abeta寡聚体的膜运输检定结果。化合物CF(20微摩尔浓度)表现出与分离自AD患者的Abeta寡聚体在药理学上竞争靠近介导膜运输的分子靶标，因此化合物CF的存在使得人类阿尔茨海默病相关的Abeta寡聚体具有更小的突触毒性。
图1M是显示在以下物质的存在下所识别(和定量)神经元的甲臜填充囊泡的百分比的运输检定结果的条形图，即在(i)单独媒介物(第一条)；(ii)来自人阿尔茨海默病患者脑的Abeta寡聚体制剂(第二条，与第一条相比为显著降低)；(ii)本文公开的化合物II+Abeta寡聚体(第三条，比第二条显著更高)；以及(iv)化合物II而无Abeta寡聚体(第四条，与第一条没有显著不同)的存在下。该图表明，化合物II阻抑由人类阿尔茨海默病相关的Abeta寡聚体所引起的膜运输缺陷，并将膜运输表型恢复至正常，但是当不存在Abeta寡聚体而仅有其自身给药时不影响膜运输。
图1N是与图J类型相同但是示出使用从年龄匹配的组织学正常的人脑中分离的Abeta寡聚体制剂而产生的数据的条形图。该图表明，得自正常人脑的Abeta寡聚体并不显著影响膜运输，且cpd II在存在或不存在该寡聚体时不会进一步影响膜运输。
图2A是药代动力学数据的图，其中示出单一皮下(空心三角)和静脉(i.v.)(空心圆圈)施用化合物II时从血浆中(左纵坐标，ng/mL)中得到的以及在单一i.v.施用化合物II(填充圆圈)时在脑中(右纵坐标，ng/g)得到的化合物II的浓度。已知化合物II经过首过代谢，因此皮下给药；然而，在急性给药后，化合物II为高度脑穿透性。该图表明，cpd II在急性皮下给药时为高度脑穿透性。
图2B是药代动力学数据的图，其中示出在每天一次皮下施用不同量的化合物II(0.5mg/kg/天：填充的下三角；0.35mg/kg/天：填充的上三角；以及0.1mg/天填充的正方形)并持续5天时在血浆(左纵坐标)中得到的以及在皮下施用相同量(分别是空心下三角、空心上三角和空心正方形)的化合物II时在大脑(右纵坐标)中得到的化合物II浓度。已知化合物II经过首过代谢，因此皮下给药；然而，在慢性给药后，化合物II为高度脑穿透性。该图表明，cpd II在慢性皮下给药时为高度脑穿透性。
图2C是药代动力学数据的图，其中示出在化合物CB的单一急性经口给药(10mg/kg/天)时在血浆(左纵坐标，实心三角)和脑(右纵坐标，空心三角)中得到的在单一急性经口给药后获得的化合物CB的浓度。化合物CB在急性经口给药后为高度脑穿透性并表现出50％的生物可得性，血浆半衰期为3.5小时。该图表明，cpd CB在急性经口给药时为高度脑穿透性。
图2D是药代动力学数据的图，其中示出在每天一次经口施用化合物CB时(10mg/kg/天，直立的三角)或30mg/kg/天(反转的三角)时在慢性每天一次经口给药并持续5天后获得的在血浆(左纵坐标，实心三角)和脑(右纵坐标，空心三角)中得到的化合物CB的浓度。化合物CB在慢性经口给药后为高度脑穿透性并在高达5天的每天一次经口给药时表现出脑/血浆比为3。该图表明，cpd CB在慢性经口给药时为高度脑穿透性。
图3A-板块A是不存在化合物IXa、IXb时暴露于Abeta寡聚体体外保持21天的初级海马和皮层培养物的荧光显微图；Abeta(经单克隆抗体6E10免疫标记而可视化)与突触处的包括神经元突触后棘的细胞膜结合。
图3A-板块B处于与图3A-板块A中所见相同的视野，示出与阴性对照(未示出)相比，突触数量(经突触素免疫标记而可视化)在Abeta寡聚体的存在下减少。
图3A-板块C是不存在化合物IXa、IXb时暴露于Abeta寡聚体体外保持21天的初级海马和皮层培养物的较低分辨率的荧光显微图；Abeta(经单克隆抗体6E10免疫标记而可视化)与突触处的包括神经元突触后棘的细胞膜结合。
图3A-板块D示出存在化合物IXa、IXb时暴露于Abeta寡聚体体外保持21天的初级海马和皮层培养物的同批次培养物；与包括神经元突触后棘的细胞膜结合的Abeta量在视觉上减少。
图3B-板块A是存在化合物IXa、IXb时暴露于Abeta寡聚体体外保持21天的初级海马和皮层培养物的同批次培养物的荧光显微图；与包括神经元突触后棘的细胞膜结合的Abeta量在视觉上减少。该图表明，化合物IXa、IXb的存在(i)使得与包括神经元突触后棘的细胞膜结合的Abeta寡聚体的含量显著减少。在化合物II的存在下可以见到相似的保护作用(数据未示出)。
图3B-板块B处于与图3A-板块C中所见相同的视野，示出突触数量(经突触素免疫标记而可视化)在化合物IXa、IXb的存在下恢复，其与图3B相比具有增加的可视突触素。该图表明，化合物混合物IXa、IXb显著地阻断Abeta寡聚体引发的突触丧失。在化合物II的存在下可以见到相似的保护作用(数据未示出)。
图3C是以突触丧失检定实验的条形图对图3A-板块A～D所示数据的定量结果。突触丧失提供对于认知功能的最紧密相关。在突触丧失检定中，与媒介物相比，Abeta寡聚体在体外引起18.2％突触丧失。化合物II或化合物混合物IXa、IXb的存在完全消除该突触衰退。当化合物仅以媒介物而不含Abeta寡聚体给药时，不起作用。具体而言，通过对神经元的荧光显微图的突触素-免疫标记区域的数量、强度和面积的基于图像操作的定量来计算突触计数，其表示为与阴性对照(媒介物)的百分比，其中神经元暴露于单独媒介物(第一条)、媒介物与化合物IXa、IXb或媒介物与化合物II(分别为第二条和第三条，示出化合物对突触数量没有作用)、Abeta寡聚体(第四条，示出与第一条 相比有显著的突触计数降低)以及化合物IXa、IXb或II存在下的Abeta寡聚体(第五条和第六条，示出与第一条相比没有突触数量的降低)。该图表明，化合物IXa、IXb和II表现出保护性作用并阻断Abeta寡聚体引发的突触数量减少。
图3D是以Abeta结合强度的条形图对图3A-板块A～D中所示数据的定量结果，通过在将Abeta单独添加至媒介物(第一条)以及在Abeta与化合物II或化合物混合物IXa、IXb共存下它们显著降低时的荧光显微图的6E10免疫标记区的数量、强度和面积的基于图像处理的定量来计算Abeta结合强度。该图表明，化合物IXa、IXb和II降低与细胞膜结合的Abeta的量。
图4是记忆表现的条形图，记忆表现通过体内条件性恐惧检定中僵立行为的百分比而测量，僵立行为在基线训练和训练后24小时对施用单独媒介物(第一条)、媒介物+Abeta寡聚体(第二条)、化合物II+Abeta寡聚体(第三条)和单独化合物II(第四条)的小鼠并且在施用单独媒介物(第一条)、媒介物+Abeta寡聚体(第二个显著降低的条)、化合物II+Abeta寡聚体(第三条)和单独化合物II之后24小时时进行测量。与媒介物(N＝18)相比，Abeta寡聚体(单一的200纳摩尔海马内注射)在3～4月龄雄性野生型C57BL/6小鼠(N＝16)中产生记忆形成的显著缺陷。化合物II(在寡聚体一小时前单次2微摩尔海马内注射)消除由Abeta寡聚体引起的记忆缺陷(N＝11)。单独化合物没有作用，且没有观察到不利的行为效应。该图表明，化合物II可以预防Abeta寡聚体引发的记忆缺陷，而当仅其自身给药时对记忆表现没有作用。
图5是与图4相同类型的条形图，示出当动物用(i)单独媒介物(第一条)、(ii)Abeta寡聚体(第二条，示出测试动物获取新记忆的能力有显著降低)、(iii)化合物IXa和IXb的混合物(第三条，示出对Abeta寡聚体引发的记忆缺陷的完全(且统计学显著的)抑制)、或(iv)化合物IXa和IXb的混合物(不存在Abeta寡聚体)(第四条，示出对记忆无作用)处理时，通过在与产生图4相同的情境条件性恐惧检定中的僵立行为而测量的记忆表现。没有观察到不利的行为作用。 该图表明，化合物混合物IXa、IXb可以预防Abeta寡聚体引发的记忆缺陷，而当仅其自身给药时对记忆表现没有作用。
图6A示出来自正常患者、路易体痴呆症(DLB)患者或阿尔茨海默病(AD)患者的人额皮层组织切片中(左板块)的[3H]-(+)-喷他佐辛(σ-1受体配体)的放射自显影结合，其中BS是特异性结合，且BNS是非特异性结合；(右板块)示出来自对照(正常)、DLB或AD患者的放射自显影实验的[3H]喷他佐辛的平均特异性结合的图。与年龄匹配的与AD中神经元丧失度平行的对照脑相比，阿尔茨海默病脑中的σ-1受体在统计学上更低。该图表明，σ-1受体表达可以在阿尔茨海默病脑中保持恒定。
图6B示出来自正常患者、路易体痴呆症(DLB)患者或阿尔茨海默病(AD)患者的相邻人额皮层组织切片中(左板块)的[125I]-RHM-4(σ-2受体配体)的放射自显影结合；(右板块)示出来自对照(正常)、DLB或AD患者的放射自显影实验的[125I]RHM-4的平均特异性结合的图。与年龄匹配的对照脑相比，阿尔茨海默病和路易体痴呆症脑中的σ-2受体没有在统计学上更低，尽管在这些疾病中看到神经元损失。该图表明，成活的神经元和/或神经胶质中的σ-2受体表达可能在DLB和阿尔茨海默病脑中上调。
图6C示出(左板块)在猴的额皮层、猴的海马或人颞叶皮层中σ-2配体对18.4nM[3H]-RHM-1(一种σ-2受体配体)的替代，以及(右板块)具有和不具有1μM西拉美新与化合物IXa、IXb和II中各一组时的[3H]-RHM-1的结合密度图。该图表明，化合物II和IXa、IXb混合物竞争性地替代已知的放射性标记的σ-2配体例如猴和人脑组织切片中σ-2受体的[3H]-RHM-1，因此两种化合物均与σ-2受体结合。
图7A示出在用σ化合物处理48小时的SKOV-3人卵巢癌细胞系中，MTS检定中σ-2受体激动剂对细胞成活性的肿瘤细胞细胞毒性。σ-2激动剂(西拉美辛、SV-119、WC-26)杀死肿瘤细胞。σ-2拮抗剂(RHM-1、IXa与IXb、和II)仅在不存在激动剂时在高得多的浓度下杀死肿瘤细胞。该图表明，cpd II和IXa、IXb在该检定中表现与已知的σ-2拮抗剂相似，因此暗示着它们是肿瘤细胞中的σ-2拮抗剂。
图7B示出在用σ-2化合物处理24小时后的神经元培养物中σ-2受体激动剂对细胞核强度变化的神经元细胞细胞毒性。σ-2激动剂(西拉美辛、SV-119、WC-26)造成神经元中的异常细胞核形态。σ-2拮抗剂(RHM-1、IXa与IXb、和II)不会如此。该图表明，cpd II和IXa、IXb在该检定中表现与已知的σ-2拮抗剂相似，因此暗示着它们是初级海马和皮层细胞中的σ-2拮抗剂。
图8A示出SKOV-3人卵巢癌细胞中由σ-2激动剂西拉美新引发的半胱氨酸天冬氨酸酶-3活性，而σ-2受体拮抗剂RHM-1、化合物II、和IXa与IXb不引起半胱氨酸天冬氨酸酶-3活性。Abeta寡聚体造成低水平的半胱氨酸天冬氨酸酶-3激活并引起LTD。高水平的寡聚体和半胱氨酸天冬氨酸酶-3引起细胞死亡。σ-2受体激动剂(SV-119、西拉美新)激活肿瘤细胞和神经元中的半胱氨酸天冬氨酸酶-3；σ-2拮抗剂则不这样(图10A和10B)。该图表明，cpd II和IXa、IXb在该检定中表现与已知的σ-2拮抗剂相似，因此暗示着它们是肿瘤细胞中的σ-2拮抗剂。
图8B示出神经元中由σ-2激动剂西拉美新引发的半胱氨酸天冬氨酸酶-3活性，而σ-2受体拮抗剂RHM-1、化合物II、和IXa与IXb不引起半胱氨酸天冬氨酸酶-3活性。该图表明，cpd II和IXa、IXb在该检定中表现与已知的σ-2拮抗剂相似，因此暗示着它们是初级海马和皮层细胞中的σ-2拮抗剂。
图8C示出SKOV-3人卵巢肿瘤细胞中由σ-2受体激动剂SV-119引发的半胱氨酸天冬氨酸酶-3激活。σ-2受体拮抗剂化合物IXa与IXb以及II、RHM-1不阻断肿瘤细胞中由σ-2受体激动剂SV-119引起的半胱氨酸天冬氨酸酶-3激活。该图表明，cpd II和IXa、IXb在该检定中表现与已知的σ-2拮抗剂相似，因此暗示着它们是肿瘤细胞中的σ-2拮抗剂。
图8D示出在多种浓度激动剂下24小时后神经元培养物中由σ-2受体激动剂SV-119引起的半胱氨酸天冬氨酸酶-3激活。该图表明，σ-2受体拮抗剂化合物IXa、IXb和II阻断而RHM-1不阻断初级海马和皮层细胞中由σ-2受体激动剂SV-119引起的半胱氨酸天冬氨酸酶-3激活。
图9A示出通过体内条件性恐惧检定中僵立行为的百分比而测量的记忆表现，其中在经口施用多种剂量的σ-2受体拮抗剂化合物5.5个月后，在15月龄雄性转基因阿尔茨海默病小鼠模型中，在训练24小时后以1～3分钟测量僵立行为的百分比。与用媒介物处理的Tg动物相比(Mann-Whitney U测试)，记忆缺陷的显著改善发生在用10和30mg/kg/天的CB(p<0.05)和30mg/kg/天的CF(p<0.005)处理的转基因动物中。该图表明，化合物CB和CF在慢性长期给药后逆转转基因阿尔茨海默病小鼠中已建立的记忆缺陷。
图9B示出9月龄雌性转基因(Tg)阿尔茨海默病小鼠的行为数据的条形图，该小鼠在用媒介物p.o.处理39天时，相比于媒介物处理的非转基因同窝仔，在Y-迷宫(％交替)中表现出显著的记忆缺陷(即，媒介物处理的Tg小鼠随机表现(at chance)，媒介物处理的非Tg同窝仔表现得显著更优于机率可见(chance-see)的紧邻于条形柱的星号和线)。用Cpd.CF以30mg/kg/天口服处理Tg动物改善缺陷。没有观察到不利的行为效应。该图表明cmpd CF在慢性短期给药后逆转转基因阿尔茨海默病小鼠中已建立的记忆缺陷。
具体实施方式
定义
在详细描述本发明的化合物、组合物和方法之前，应理解本发明不限于所描述的具体操作、组合物或方法论，因为这些可以变化。还应理解，本说明书使用的术语仅出于描述具体的版本或实施方式的目的，而不意在限制本发明的范围，本发明的范围将由所附权利要求限定。除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管可以将任何与本文描述类似或等同的方法和材料用于本发明实施方式的实施或测试中，但现在将描述优选的方法、装置和材料。
还应理解的是为清楚起见而描述于分开实施方式的上下文中的本发明的某些特征还可以在单个实施方式中组合提供。相反地，为简洁起见而描述于单个实施方式的上下文中的本发明的各种特征还可以单独或以任何合适的亚组合提供。
定义
单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数提及，除非上下文另外有清楚规定。因此，例如，对“细胞”的提及是对一个或多个细胞以及本领域技术人员已知的其等同物的提及，等等。
本文使用的术语“约”是指给定数值加减10％。例如，“约50％”是指45％-55％的范围。
“σ-2配体”是指与σ-2受体结合的化合物，包括激动剂、拮抗剂、部分激动剂、反向激动剂和简单地该受体或蛋白的其它配体的竞争者。
术语“激动剂”是指其存在引起受体的如下生物学活性的化合物，该生物学活性与由该受体的天然出现的配体的存在所引起的生物学活性相同。
术语“部分激动剂”是指其存在引起受体的如下生物学活性的化合物，该生物学活性的类型与由该受体的天然出现的配体的存在所引起的生物学活性相同，但量级更低。
术语“拮抗剂”是指其存在引起受体的生物学活性量级下降的实体，例如化合物。在某些实施方式中，拮抗剂的存在导致受体的生物学活性被完全抑制。σ-2受体的“功能性拮抗剂”是例如如在体外检定例如膜运输检定中或在行为检定中或在需要其的患者中所示地阻断Abeta寡聚体诱导的突触功能障碍的拮抗剂。功能性拮抗剂可以通过抑制例如Abeta寡聚体的结合而直接起作用，或通过干扰由Abeta寡聚体结合σ-2受体引起的下游信号转导而间接起作用。
术语“选择性”或“选择性的”是指相比于非σ受体，对σ-2受体的结合亲和性Ki的差异。σ-2拮抗剂对突触神经元中的σ受体具有高选择性。将对σ-2受体的Ki或对σ-2和σ-1受体两者的Ki与对非σ受体的Ki进行比较。在一方面，σ-2或σ-l/σ-2选择性配体对σ受体的亲和性相比于对非σ受体高至少10倍、20倍、30倍、50倍、70倍、100倍、500倍，或更有选择性。非σ受体是，例如毒蕈碱M1-M4受体、血清素(5-HT)受体、α肾上腺素受体、β肾上腺素受体、阿片样受体、血清素转运体、多巴胺转运体、肾上腺素转运体、多巴胺受体或NMDA受体。
在本申请中，术语“高亲和性”意指在σ受体结合检定中，例如 对于[3H]-DTG，化合物表现出小于600nM、500nM、400nM、300nM、200nM，小于150nM，小于100nM，小于80nM，小于60nM，或优选小于50nM的Ki值，如Weber等人,Proc.Natl.Acad.Sci(USA)83:8784-8788(1986)中公开，其引入本文以供参考，其中测量了化合物对σ-1和σ-2受体位点两者的结合亲和性。特别优选的σ配体对于[3H]-DTG表现出小于约150nM、优选小于100nM、小于约60nM、小于约10nM、或小于约1nM的Ki值。
“Abeta种类”或“Αβ”应包括组合物，该组合物包括含有可溶淀粉样蛋白肽的成分，例如Abeta单体、Abeta寡聚体、Abeta肽(单体、二聚或聚合形式)与其它可溶肽或蛋白的复合物以及其它可溶Abeta组装体(assembly)，包括淀粉样蛋白前体蛋白的任何加工的产物。已知可溶Αβ寡聚体是神经毒性的。甚至已知Αβ1-42二聚体破坏小鼠海马切片中的突触可塑性。在本领域已知的一个理论中，认为原生Αβ1-42单体是神经保护性的，且神经毒性需要Αβ单体自缔合为可溶Abeta寡聚体。然而，某些Αβ突变体单体(北极突变(E22G))被报道为与家族AD相关。参见例如Giuffrida等人,β-Amyloid monomers are neuroprotective.J.Neurosci.200929(34):10582-10587。包括Abeta种类的制剂的非限制性实例公开于美国专利申请序列号第13/021,872号；美国专利公开第2010/0240868号；国际专利申请第WO/2004/067561号；国际专利申请第WO/2010/011947号；美国专利公开第20070098721号；美国专利公开第20100209346号；国际专利申请第WO/2007/005359号；美国专利公开第20080044356号；美国专利公开第20070218491号；WO/2007/126473；美国专利公开第20050074763号；国际专利申请第WO/2007/126473号，国际专利申请第WO/2009/048631号，和美国专利公开第20080044406号，其各自引入本文以作参考。
当结合本发明的化合物使用时，“施用”是指将化合物直接施用到目标组织中或目标组织上或将化合物全身或局部地施用到患者或其它受试者。
本文使用的术语“动物”包括但不限于人类和非人类脊椎动物，例如野生动物、家畜和农畜。
本文使用的术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用，且 是指何动物，包括哺乳动物、小鼠、大鼠、其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、羊、马、灵长类动物、非人灵长类动物、人等。
本文使用的术语“使……接触”是指使分子(或具有更高级结构的分子例如细胞或细胞膜)在一起或结合，使得它们处于允许分子间相互作用例如两个肽或一个蛋白与另一蛋白或其它分子(例如小分子)之间的非共价相互作用的距离内。在一些实施方式中，接触发生在所结合或所接触的分子在共同溶剂中混合并允许自由缔合的溶液中。一些实施方式中，接触可以在细胞处或细胞内或在无细胞的环境中发生。在一些实施方式中，无细胞的环境是由细胞产生的裂解物。在一些实施方式中，细胞裂解物可以是全细胞裂解物、核裂解物、细胞质裂解物及其组合。在一些实施方式中，无细胞的裂解物是从核提取和分离得到的裂解物，其中将细胞群的核从细胞中去除然后裂解。在一些实施方式中，不将核裂解，但仍视为是无细胞的环境。可以通过混合例如涡旋、振摇等使分子在一起。
术语“改善”被用于表示本发明使得提供、应用或施用了本发明的组织的特性和/或身体属性改变。术语“改善”也可以结合疾病状态使用，这样当疾病状态被“改善”时，与疾病状态相关的症状或身体特性减弱、减小、消除、延迟或避免。
术语“抑制”包括阻断、避免某个结果或过程或恢复相反的结果或过程。在预防或治疗方面，通过施用本发明的化合物，“抑制”包括(部分或全部地)保护免受或延迟症状的发作、缓解症状，或保护免受、减弱或消除疾病、病症或障碍。
术语“抑制运输不足”是指阻断细胞优选神经元细胞中可溶Αβ寡聚体诱导的膜运输不足的能力。能够抑制运输不足的化合物在膜运输检定中的EC50<20uM、小于15uM、小于10uM、小于5uM且优选小于1μΜ，且还能够至少50％、优选至少60％、且更优选至少70％地最大抑制可溶Abeta寡聚体诱导的膜运输不足的Abeta寡聚体效应。
在本说明书的各处，本发明化合物的取代基公开为组或范围。具体意图是，本发明的实施方式包括这样的组和范围中的成员的各个和每个各自独立的亚组合。例如，术语“C1-6烷基”具体意在各自独立地公开甲基(C1烷基)、乙基(C2烷基)、C3烷基、C4烷基、C5烷基和 C6烷基。
对于其中变量出现多于一次的本发明的化合物，各个变量可以是选自限定变量的马库什群组的不同组成成分。例如，当结构被描述为具有两个同时存在于同一化合物上的R基团时，则这两个R基团可以表示选自针对R进行限定的马库什群组的不同组成成分。
其中n是整数的术语“n-元”通常描述组成成分中成环原子的数目，其中成环原子的数目是n。例如，吡啶是6-元杂芳环的实例，而噻吩是5-元杂芳基的实例。
本文使用的术语“烷基”意指直链或支链的饱和烃基。实例烷基包括，但不限于，甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如正丙基和异丙基)、丁基(例如正丁基、异丁基、叔丁基)、戊基(例如正戊基、异戊基、新戊基)等。烷基可以含有1至约20、2至约20、1至约10、1至约8、1至约6、1至约4，或1至约3个碳原子。术语“亚烷基”指二价烷基连接基团。亚烷基的实例是亚甲基(CH2)。
本文使用的“卤代烷基”是指具有一个或多个卤素取代基的烷基。实例卤代烷基包括，但不限于，CF3、C2F5、CHF2、CCl3、CHCl2、C2Cl5、CH2CF3等。
本文使用的“芳基”是指单环或多环(例如具有2、3或4个稠环)的芳香烃，例如苯基、萘基、蒽基、菲基、二氢茚基、茚基等。在一些实施方式中，芳基具有6至约20个碳原子。在一些实施方式中，芳基具有6至约10个碳原子。
本文使用的“环烷基”是指非芳香族环烃，包括环化的烷基、烯基和炔基，其含有最多20个成环碳原子。环烷基可以包括单环或多环(例如具有2、3或4个稠环)的环体系以及螺环体系。环烷基可以含有3至约15、3至约10、3至约8、3至约6、4至约6、3至约5或5至约6个成环碳原子。环烷基的成环碳原子可以任选地被氧(oxo)或硫(sulfido)取代。实例环烷基包括，但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环戊烯基、环己烯基、环己二烯基、环庚三烯基、降冰片基、降菔基(norpinyl)、降蒈基(norcarnyl)、金刚烷基等。环烷基的定义中还包括的是具有一个或更多个稠合(即具有共用的键)到环烷基环的芳香环的组成成分，例如，戊烷、戊烯、己烷等 的苯并或噻吩基衍生物(例如2,3-二氢-1H-茚-1-基，或1H-茚-2(3H)-酮-1-基)。优选地，“环烷基”是指含有最高20个成环碳原子的环化烷基。环烷基的实例优选地包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、金刚烷基等。
本文使用的“卤代”或“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
本文使用的“烷氧基”是指-O-烷基。实例烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如正丙氧基和异丙氧基)、叔丁氧基等。
本文使用的“卤代烷氧基”是指-O-卤代烷基。实例卤代烷氧基是OCF3。本文使用的“三卤代甲氧基”是指具有三个卤素取代基的甲氧基。三卤代甲氧基的实例包括，但不限于-OCF3、-OCClF2、-OCCl3等。
本文使用的“氨基”是指NH2。
本文使用的“烷基氨基”是指被烷基取代的氨基。
本文使用的“二烷基氨基”是指被两个烷基取代的氨基。
本文使用的C(O)是指C(＝O)。
本文使用的术语“任选地取代”意指取代是任选的，并且因此包括未被取代的和被取代的原子和组成成分两者。“取代的”原子或组成成分表明指定的原子或组成成分上任意的氢可以被来自所指明的取代基的选择代替，条件是不超过指定原子或组成成分的正常价态，并且取代产生稳定的化合物。例如，如果甲基(即CH3)被任选地取代，则碳原子上的3个氢原子可以被所指明的取代基代替。
本文使用的“非致死β淀粉样蛋白效应”是指与Abeta种类接触的细胞的效应，特别是非致死效应。例如，已发现当神经元细胞与可溶β淀粉样蛋白(“Abeta”)寡聚体接触时，寡聚体在体外与神经元细胞的子集上的突触子集结合。该结合可以在例如测量体外Abeta寡聚体结合的检定中被定量。Abeta种类的另一文献记载的效应是突触数目的减少，其已被报道在人海马中为约18％(Scheff等人,2007)且可以被定量(例如，在测量突触数目的检定中)。作为另一例子，已发现，当神经元细胞与β淀粉样蛋白(“Abeta”)寡聚体接触时，膜运输被调节且继而发生膜运输的改变。该异常可以用许多检定包括但不限于MTT检定进行可视化。例如，黄色四唑盐被细胞内吞，且盐被位于内体途径中的囊泡内的酶还原为不溶性紫色甲臜。紫色甲臜的水平反映 出培养物中的活性代谢细胞的数量，并且甲臜量的减少被认为是对培养物中的细胞死亡或代谢毒性的衡量。当通过显微镜观察与黄色四唑盐接触的细胞时，首先在填充细胞的胞内囊泡中可见紫色甲臜。随着时间的推移，囊泡被胞吐，并且当不可溶甲臜暴露于水性介质环境时，甲臜在质膜外表面上沉淀为针状结晶。Abeta种类的其它效应包括认知衰退，例如形成新记忆的能力衰退和记忆丧失，其可以使用动物模型在体内检定中进行测量。
在一些实施方式中，当与阴性对照相比，测试化合物可以将与可溶Abeta寡聚体种类对于神经元细胞相关的效应抑制大于约10％、优选大于15％且优选大于20％时，其被认为可有效治疗认知衰退或与其相关的疾病。在一些实施方式中，当与阳性对照相比，测试剂可以将淀粉样蛋白前体蛋白的加工产物所介导的效应抑制大于约10％、优选大于15％且优选大于20％时，其被认为是有效的。例如，如以下实施例中所示，将Abeta寡聚体结合仅抑制18％可完全抑制突触减少。例如，参见图3C和3D。尽管本说明书关注对Abeta种类非致死效应例如神经元代谢的异常和突触数目减少的抑制，但显示这些与认知功能相关，而且随时间推移预期可引起淀粉样蛋白病理的下游可测症状的减少(与未治疗的受试者相比)，尤其是临床症状，例如1)通过淀粉样蛋白成像剂例如fluorbetapir、PittB或任何其它成像剂而测量的原纤维或斑块聚集，2)通过经FDG-PET检测的葡萄糖代谢减退而测量的突触丧失或细胞死亡，或3)通过经由ELISA的对得自患者的脑脊液、脑组织活检或血浆进行的成像或蛋白/代谢物检测而可检测的大脑或身体内的蛋白表达或代谢物量的改变(例如经ELISA测量的Abeta42、磷酸化tau、全部tau的水平或比率的改变，或ELISA板中可检测的蛋白表达改变的模式)(参见文献：Wyss-Coray T.等人.Modeling of pathological traits in Alzheimer's disease based on systemic extracellular signaling proteome.Mol Cell Proteomics2011年7月8日，其全部引入本文以供参考)，4)通过血管水肿的存在来测量的脑血管异常或通过MRI可检测的微出血和任何其它通过成像技术可检测的症状，以及5)通过任何施用的认知测试例如ADAS-Cog、MMSE、CBIC或任何其它认知测试仪器测量的认知丧失。
本文使用的术语“神经元细胞”可以用来指单个细胞或细胞群。在一些实施方式中，神经元细胞是初级神经元细胞。在一些实施方式中，神经元细胞是永生化或转化的神经元细胞或干细胞。初级神经元细胞是不能分化成其他类型的神经元细胞的神经元细胞，例如神经胶质细胞。干细胞是可以分化成神经元和其它类型的神经元细胞例如神经胶质的细胞。在一些实施方式中，包含至少一种神经元细胞的组合物没有神经胶质细胞。在一些实施方式中，组合物包括少于约30％、25％、20％、15％、10％、5％、或1％的神经胶质细胞，已知其内化和聚集Abeta。初级神经元细胞可以源自动物脑的任何区域。在一些实施方式中，神经元细胞是海马细胞或皮质细胞。可以通过任何方法确定神经胶质细胞的存在。在一些实施方式中，通过GFAP的存在检测神经胶质细胞，并且可以通过针对MAP2用抗体阳性染色来检测神经元。
短语“药学上可接受的”是指通常被认为安全无毒的分子实体和组合物。具体地，本发明的药物组合物中使用的药学上可接受的载体、稀释剂或其它赋形剂是生理学上可耐受的，与其它成分相容的，且在对患者施用时通常不产生过敏或类似不宜反应(例如胃不适、眩晕等)。优选地，本文使用的术语“药学上可接受的”是指被联邦管制机构或州政府批准或列于美国药典或其它通常认可的用于动物尤其是人类的药典中。本文使用的短语“药学上可接受的盐”包括本发明化合物的用于哺乳动物安全有效且具有期望的生物学活性的盐。药学上可接受的盐包括本发明化合物中或根据本发明的方法识别的化合物中存在的酸基或碱基的盐。药学上可接受的酸加成盐包括，但不限于，盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖二酸盐(glucaronate)、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。本发明的某些化合物可以与多种氨基酸形成药学上可接受的盐。合适的碱盐包括，但不限于，铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌、铁和二乙醇胺盐。药学上可接受的碱加成盐也与胺例如有机胺形成。合适的 胺的实例是Ν,Ν'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。
本文使用的术语“治疗的”是指用于治疗、对抗、改良、保护免受或改善受试者的不希望的病症或疾病的试剂。
本文使用的术语“有效量”是指对具体的病症或病理过程的至少一种症状或参数引起可测量的抑制的量。例如，在Abeta寡聚体的存在下提供可测量的较低的突触减少的本发明的σ-2配体的量被认为是有效量，因为其减弱病理过程，即使淀粉样蛋白病理的临床症状没有被改变，至少没有被立即改变。
本发明的化合物或组合物的“治疗有效量”或“有效量”是以适用于任何医疗的合理收益/风险比，对被治疗的受试者赋予治疗效果的预定量。治疗效果可以是客观的(即通过一些测试或标记物可测量的)或主观的(即受试者给出表示或感觉到效果或医师观察到变化)。本发明的化合物的有效量可以广泛地为约0.01mg/Kg至约500mg/Kg、约0.1mg/Kg至约400mg/Kg、约1mg/Kg至约300mg/Kg、约0.05至约20mg/Kg、约0.1mg/Kg至约10mg/Kg、或约10mg/Kg至约100mg/Kg。本文考虑的效果适当地包括医学治疗和/或预防处理。根据本发明施用以获得治疗和/或预防效果的化合物的具体剂量当然根据案例周围的具体环境确定，包括例如施用的化合物、施用途径、其它有效成分的共同施用、受治疗的病症、所采用的具体化合物的活性、所采用的具体组合物、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径、所采用的具体化合物的排泄速率以及治疗时长。施用的有效量由医师鉴于前述相关情况并运用合理的医学判断来确定。本发明的化合物的治疗有效量通常是如下量，使得当其以生理上可耐受的赋形剂组合物施用时，足以在实现有效全身浓度或组织局部浓度。以单剂量或分剂量施用至人或其它动物的本发明化合物的每日总剂量的量可以是例如0.01mg/Kg至约500mg/Kg、约0.1mg/Kg至约400mg/Kg、约1mg/Kg至约300mg/Kg、约10mg/Kg至约100mg/Kg、或更通常约0.1～25mg/kg体重/天。单剂量组合物可以含有这样的量或其因数以组成日剂量。通常，根据本发明的治疗方案包括对需要这样的治疗的患者以单剂量或多剂量每天施用约1mg至约5000mg、10mg至约2000 mg的化合物，20～1000mg，优选20～500mg且最优选约50mg的本发明化合物。
本文使用的术语“治疗”是指治疗处理和预防或防护措施两者，其中目的是保护免受(部分或全部)或减慢(减轻)不期望的生理病症、障碍或疾病，或获得有益的或期望的临床结果，例如部分或完全恢复或抑制已经变得或将会变得异常的参数、值、功能或结果的减退。对于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括，但不限于，减轻症状；减小病症、障碍或疾病的发展程度或活力或速度；稳定(即不恶化)病症、障碍或疾病的状态；延迟病症、障碍或疾病的发作或减慢病症、障碍或疾病的进展；改良病症、障碍或疾病状态；以及缓解(无论是部分还是全部)，不论其是否转化为实际的临床症状的立即减轻，或者增强或改善病症、障碍或疾病。治疗寻求引起临床上显著的响应而无过度水平的副作用。治疗还包括与如果不接受治疗的预期存活相比延长存活。
一般而言，术语“组织”是指统一执行特定功能的相似的专门细胞的任何集合。
本文使用的“认知衰退”可以是动物认知功能的任何负面变化。例如，认知衰退，包括但不限于，记忆丧失(例如行为记忆丧失)、无法获得新记忆、思维混乱、判断受损、人格改变、定向障碍、或其任意组合。因此，可有效治疗认知衰退的化合物可以通过以下而有效：恢复长时程神经元增强效应(LTP)或长时程神经元抑制效应(LTD)或电生理学测量的突触可塑性的平衡；抑制、治疗、和/或减轻神经退行性；抑制、治疗、和/或减轻一般淀粉样变性；抑制、治疗、减轻淀粉样蛋白产生、淀粉样蛋白组装、淀粉样蛋白聚集和淀粉样蛋白寡聚体结合中的一种或多种；抑制、治疗、和/或减轻一种或多种Abeta种类对神经元细胞的非致死效应(例如突触丧失或功能障碍和异常膜运输)；以及其任意组合。此外，该化合物也可以有效地治疗Abeta相关的神经退行性疾病和病症，包括但不限于：痴呆，其包括但不限于包括轻度阿尔茨海默病的阿尔茨海默病(AD)、唐氏综合征、血管性痴呆(脑淀粉样血管病和中风)、路易体痴呆、HIV痴呆、轻度认知障碍(MCI)；年龄相关的记忆损害(AAMI)；年龄相关的认知衰退(ARCD)、 临床前阿尔茨海默病(PCAD)；和非痴呆认知障碍(CIND)。本文使用的术语“天然配体”是指存在于受试者中的可以与蛋白质、受体、膜脂或体内的或在体外复制的其他结合配偶体结合的配体。天然配体可以是合成来源的，但也须在受试者中天然存在而无人为干预。例如，已知Abeta寡聚体在人类受试者中存在。因此，受试者中发现的Abeta寡聚体将被视为天然配体。Abeta寡聚体与结合配偶体的结合可以使用重组或合成技术在体外进行复制，但不管Abeta寡聚体如何制备或制造，Abeta寡聚体仍将被认为是天然配体。也可以与相同的结合配偶体结合的合成小分子如果在受试者中不存在，则其不是天然配体。例如，本文描述的化合物II通常不存在于受试者中，因此将不会被认为是天然配体。
本发明的新化合物
本文描述的化合物可以根据本文所述的方法或记载于WO2011/014880(申请号PCT/US2010/044136)、WO2010/118055(申请号PCT/US2010/030130)、申请号PCT/US2011/026530和WO2012/106426(申请号PCT/US2012/023483)(其各自全部引入本文以供参考)中的方法进行合成。制备这些化合物的其它选择在下面详述。
在一些实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是式I的化合物或其药学上可接受的盐：
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其中
R1和R2独立选自H、OH、卤素、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、(R16)(R17)N-C1-4亚烷基-O-，或R1和R2连接在一起形成-O-C1-2亚甲基-O-基，其中
R16和R17独立为C1-4烷基或苄基，或R16和R17与氮一起形成选
自![]()
和![]()
的环，其中
X是N或O且R18是H或未被取代的苯基；且
其中R1和R2的至少一个不是H；
R3选自
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和![]()
其中
R6、R7、R8、R9和R10独立选自H、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基和S(O)2-C1-6烷基；
R20是H；且
n是1-4
R4是C1-6烷基；
R4’是H或C1-6烷基；且
R5是H、C1-6烷基和C(O)O(C1-4烷基)、C(O)(C1-4烷基)或C(O)(C1-4卤代烷基)；或
R3和R5与氮一起形成选自
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和![]()
的环，其中
R11和R12独立选自H、卤素、和C1-6卤代烷基，且
Y是CH或N；
R13是H、C1-6烷基、C3-6环烷基、未被取代的苯基或被C1-6卤代烷基取代的苯基、或未被取代的苄基；
R14和R15独立选自H和卤素；
R19是H。
在一些实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是式I的化合物或其药学上可接受的盐：
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其中
R1和R2独立选自H、OH、卤素、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、(R16)(R17)N-C1-4亚烷基-O-，或R1和R2连接在一起形成-O-C1-2亚甲基-O-基，其中
R16和R17独立为C1-4烷基或苄基，或R16和R17与氮一起形成选自![]()
和![]()
的环，其中
X是N或O且R18不存在或者是H或未被取代的苯基；且
其中R1和R2的至少一个不是H；
R3选自
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![]()
和![]()
其中
R6、R7、R8、R9和R10独立选自H、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基和S(O)2-C1-6烷基；
R20是H；且
n是1-4
R4是C1-6烷基；
R4’是H或C1-6烷基；且
R5是H、C1-6烷基和C(O)O(C1-4烷基)、C(O)(C1-4烷基)或C(O)(C1-4卤代烷基)；或
R3和R5与氮一起形成选自
![]()
和![]()
的环，其中
R11和R12独立选自H、卤素、和C1-6卤代烷基，且
Y是CH或N；
R13是H、C1-6烷基、C3-6环烷基、未被取代的苯基或被C1-6卤代烷基取代的苯基、或未被取代的苄基；
R14和R15独立选自H和卤素；且
R19是H。
在一些实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是式I的化合物或其药学上可接受的盐：
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其中
R1选自OH、OMe、F、Cl、CF3、(R16)(R17)N-亚乙基-O-，其中
R16和R17各自是甲基、异丙基、正丁基或苄基，或R16和R17与氮一起形成选自![]()
或![]()
的环，其中
X是N或O且R18不存在或是未被取代的苯基；且
R2是H、Cl、F、CF3、OMe、OCF3或
R1和R2连接在一起形成-O-C1-2亚甲基-O-基
R3选自
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和![]()
其中
R6是H、F、Cl、Me、异丙基、叔丁基、OMe、CF3、或S(O)2Me，
R7和R8独立地为H、OMe、F、Cl、或CF3；
R9和R10独立选自H、OMe、F、和Cl，
R20是H；且
n是1
R4是Me；
R4'是H或Me；且
R5是H；或
R3和R5与氮一起形成选自
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和![]()
的环，其中
R11和R12独立选自H、Cl、和CF3，且
Y是CH或N；
R13是H、Me、环己基、未被取代的苯基或被CF3取代的苯基、或未被取代的苄基
R14和R15独立选自H和Cl；且
R19是H。
在一些实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是式I的化合物或其药学上可接受的盐：
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其中
R1选自OH、OMe、F、Cl、CF3、(R16)(R17)N-亚乙基-O-，其中
R16和R17各自是甲基、异丙基、正丁基或苄基，或R16和R17与氮 一起形成选自![]()
或![]()
的环，其中
X是N或O且R18不存在或是未被取代的苯基；且
R2是H、Cl、F、CF3、OMe、OCF3或
R1和R2连接在一起形成-O-C1-2亚甲基-O-基
R3选自
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其中
R6是H、F、Cl、Me、异丙基、叔丁基、OMe、CF3、或S(O)2Me，
R7和R8独立地为H、OMe、F、Cl、或CF3，
R9和R10独立选自H、OMe、F、和Cl，且
n是1
R4是Me；
R4’是H；且
R5是H；或
R3和R5与氮一起形成选自
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和![]()
的环，其中
R11和R12独立选自H、Cl、和CF3，且
Y是CH或N；
R13是H、Me、环己基、未被取代的苯基或被CF3取代的苯基、或未被取代的苄基
R14和R15独立选自H和Cl；且
R19是H。
在一些更加具体的实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是式Ia的化合物或其药学上可接受的盐：
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其中R4’是H且剩余基团如以上针对式I的化合物所限定。
在一些实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是式IIa的化合物或其药学上可接受的盐：
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其中
R1＝卤素、C1-6卤代烷基或OH；
R2＝H、卤素或C1-6卤代烷基，或R1和R2连接在一起形成-O-亚甲基-O-基；
R3＝C1-6卤代烷基；且
R4＝C1-6烷基。
在一些更加具体的实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是式IIa的化合物或其药学上可接受的盐：
![]()
其中
R1＝Cl、F、CF3、或OH；
R2＝H、Cl、F、CF3，或R1和R2连接在一起形成-O-亚乙基-O-基；
R3＝CF3；且
R4＝甲基。
在一些更加具体的实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是式IIb的化合物或其药学上可接受的盐：
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其中R1-R4如以上针对式IIa的化合物所限定。
本发明的具体示例性化合物在下表中给出：
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或其药学上可接受的盐。
用于本发明的优选的盐包括上述化合物的盐酸盐，包括以下：
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这些已根据本文提供的一般方法合成，且具有任何附加步骤的具体合成实例在本领域技术内熟知。数个这些化合物已在如本文所详述的多个检定中进行检测，且已被发现为具有活性。所测试的化合物参考WO2010/110855中公开的化合物还显示出增加的生物利用度。
化合物II具有下式：
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在一些实施方式中，上述的各个通式可以含有去除式II的化合物的条件。
在一些实施方式中，上述的各个通式可以含有去除以下化合物的一种或多种的条件：
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和
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在另一实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是式VIIIa的化合物或其药学上可接受的盐：
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其中：
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是单键或双键；
R1是C1-6烷基、C1-6卤代烷基、未被取代的苄基或被卤素、C1-6烷基、或C1-6卤代烷基取代的苄基；
R2是H，或
R1和R2与氮一起形成环![]()
其中
X是CH、N、或O，且
R4不存在，或是H、C1-6烷基、或未被取代的苯基或被卤素、C1-6烷基、或C1-6卤代烷基取代的苯基；且
R3是C1-4烷基、卤素、或C1-6卤代烷氧基。
在一些实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是式VIIIa的化合物或其药学上可接受的盐：
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其中：
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是单键或双键；
R1是异丁基、苄基、或被氯、甲基或CF3取代的苄基；
R2是H，或
R1和R2与氮一起形成环![]()
其中
X是CH、N、或O，且
R4不存在，或是H、异丙基、或未被取代的苯基；且
R3是邻-Me、间-Me、对-Me、对-F、或对-OCF3。
在一些更加具体的实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是式VIIIb的化合物或其药学上可接受的盐：
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其中R1-R3如以上针对式VIIIa所限定。
在一些更加具体的实施方式中，本发明的σ-2拮抗剂是式VIIIc的 化合物或其药学上可接受的盐：
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其中R1-R3如以上针对式VIIIa所限定。
本发明的具体示例性化合物在下表中给出：
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和
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或其药学上可接受的盐。
用于本发明的优选的盐包括上述化合物的盐酸盐，包括以下：
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和![]()
在一些实施方式中，各个上述通式可以含有去除以下化合物的一种或多种的条件：
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另外公开的是式IXa和IXb的化合物，其为非对映体的混合物。
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σ-2拮抗剂
不受理论的约束，提议σ-2受体是神经元中Abeta寡聚体的受体。文献中已提议可溶Abeta寡聚体的多种受体，包括朊蛋白、胰岛素受体、β肾上腺素能受体和RAGE(晚期糖化终产物的受体)。Laurén,J.等人,2009,Nature,457(7233):1128-1132；Townsend,M.等人,J.Biol.Chem.2007,282:33305-33312；Sturchler,E.等人,2008,J.Neurosci.28(20):5149-5158。实际上，很多研究者相信，Abeta寡聚体可以与多于一种的受体蛋白结合。不受理论的约束，基于本文呈现的证据，本发明的发明者假定出(不必须排他地)位于神经元中的Abeta寡聚体的其他受体。
不受理论的约束，Abeta寡聚体是与σ蛋白复合物结合并造成异常运输和突触丧失的σ受体激动剂。本文表明，在神经元的该相互作用和/或σ受体功能中起拮抗作用的高亲和性σ-2配体将与Abeta寡聚体竞争并使神经元应答回复至正常。这些配体被认为是功能性σ-2受体拮抗剂并如此称谓或更简单地称为σ-2受体拮抗剂或σ-2拮抗剂。
在一些实施方式中，本发明的σ-2受体拮抗剂化合物对于以下方面作为神经细胞中的功能性拮抗剂：抑制可溶Aβ寡聚体诱导的突触丧失和抑制可溶Aβ寡聚体诱导的膜运输检定中的缺陷；表现出在σ-2受体处的高亲和性；以及具有与任何其他非σ受体相比的对于一种或多种σ受体的高选择性；以及表现出良好的药物样特性。
在一些实施方式中，如在本说明书中公开的，本文详述的满足某些体外检定标准的σ-2受体功能性拮抗剂将在一种或多种相关的动物行为模型中表现出行为效力，或被预测具有行为效力。在一些实施方式中，行为效力确定在10mg/kg口服(p.o.)或更低。
在一些实施方式中，本公开内容提供预测高亲和性σ-2受体配体的行为效力的体外检定平台。根据该体外检定平台，配体以高亲和性与σ-2受体结合；作为与神经元中Abeta寡聚体诱导效应相关的功能性拮抗剂；抑制中枢神经元中Abeta寡聚体诱导的突触丧失或降低Abeta寡聚体对神经元的结合以抑制突触丧失；以及在不存在Abeta寡聚体时不影响运输或突触数量。在体外检定中的这种活性模式被称为“治疗表型”(therapeutic phenotype)。σ-2受体拮抗剂阻抑成熟神经元中的 Abeta寡聚体效应而在不存在Abeta寡聚体时不影响正常功能的能力满足治疗表型的标准。现在公开了具有治疗表型的选择性σ-2拮抗剂能够够阻抑Abeta寡聚体诱导的突触功能障碍。
在一些实施方式中，具有治疗表型且同时具有以下特征的高亲和性的选择性σ-2拮抗剂适合用作用于治疗有需求的患者中的Abeta寡聚体诱导的突触功能障碍的治疗候选物：在σ受体处的高亲和性；相比于其他非σCNS受体，对于σ受体的高选择性；对于σ-2受体有更高的亲和性或可比的亲和性，例如在σ-2和σ-1受体处为一个数量级内；对于σ受体的与其他中枢神经系统中的相关受体相反的选择性，以及良好的药物样特性。药物样特性包括可接受的脑穿透性(穿越脑血屏障的能力)、良好的血浆中稳定性和良好的代谢稳定性，例如通过对肝脏微粒体的暴露而测量的。不受理论的约束，高亲和性的σ-2受体拮抗剂与Abeta寡聚体竞争，和/或停止病理σ受体信号转导，引起阿尔茨海默病。
在一些实施方式中，具有治疗表型且同时具有以下特征的σ-2拮抗剂适合用作用于治疗有需求的患者中的Abeta寡聚体诱导的突触功能障碍的治疗候选物：在σ受体处的高亲和性；相比于其他非σCNS受体，对于σ受体的高选择性；对σ-2受体的高亲和性或在σ-2和σ-1受体处可比的亲和性；以及良好的药物样特性。药物样特性包括高的脑穿透性、血浆稳定性和代谢稳定性。
在一些实施方式中，在结合活性研究中，至多约600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、150nM、100nM，优选为至多约75nM，优选为至多约60nM，优选为至多约40nM，更优选为至多10nM，最优选为至多1nM的IC50或Ki值表明对于σ受体结合位点的高结合亲和性。
在一些实施方式中，相比于其他非σCNS或靶标受体，对σ受体具有高于约20倍、30倍、50倍、70倍或优选高于100倍选择性的、且具有良好的药物样特性(包括脑穿透性和良好的代谢和/或血浆稳定性)并且具有治疗表型的在σ-2受体处具有高亲和性(优选Ki小于约600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、150nM、100nM、70nM、60nM、50nM、30nM或10nM)的σ-2受体拮抗剂被预测为具有行 为效力并且可以用于在需要其的患者中治疗Abeta寡聚体诱导的突触功能障碍。
本文所用的术语“脑穿透性”是指药物、抗体或片段穿越血脑屏障的能力。在一些实施方式中，动物药物代谢动力学(pK)研究例如小鼠药物代谢动力学/血脑屏障研究可以用于确定或预测脑穿透性。在一些实施方式中，多个浓度的药物可以例如以3、10和30mg/kg例如p.o.施用5天，并且多个pK特性在例如动物模型中测量。在一些实施方式中，确定剂量相关的血浆和脑中含量。在一些实施方式中，脑Cmax>100、300、600、1000、1300、1600或1900ng/mL。在一些实施方式中，良好的脑穿透性被定义为，脑/血浆比为>0.1、>0.3、>0.5、>0.7、>0.8、>0.9、优选>1、更优选>2、>5或>10。在其他实施方式中，良好的脑穿透性被定义为，在预定时间段后高于约0.1％、1％、5％、高于约10％、优选高于约15％的所施用剂量透过BBB。在某些实施方式中，剂量为经口施用(p.o.)。在其他实施方式中，剂量为经静脉施用(i.v.)，在测量pK特性之前。检定和脑穿透性在实施例7中描述，且化合物II的数据显示在图2A和2B中，已知化合物II进行首过代谢，因此皮下给药；尽管如此，化合物II在急性和慢性给药后均为高度脑穿透性。化合物II的脑/血浆比>8。
本文所用的术语“血浆稳定性”是指化合物在血浆中例如通过酶(如水解酶和酯酶)的降解。可以采用多种体外检定中的任一种。药物在血浆中孵育不同时间段。在各个时间点剩余的百分比母化合物(分析物)反映出血浆稳定性。较差的血浆稳定性特征可能趋于具有较低的生物利用度。良好的血浆稳定性可以定义为，在30分钟后剩余高于50％分析物，在45分钟后剩余高于50％分析物，且优选为在60分钟后剩余高于50％分析物。
本文所用的术语“代谢稳定性”是指化合物在首过代谢(口服药物的肠或肝降解或结合)后有活性的能力。这可以例如在体外通过将化合物暴露于小鼠或人的肝微粒体而评测。在一些实施方式中，良好的代谢稳定性是指化合物暴露于小鼠或人肝微粒体时，t1/2>5min、>10min、>15分钟、>20分钟、优选为>30分钟。在一些实施方式中，良好的代谢稳定性是指内在清除率(Clint)<300uL/min/mg，优选为≤200 uL/min/mg，更优选为≤100uL/min/mg。
本发明的新化合物的盐、溶剂化物、立体异构体、衍生物、前药和活性代谢物
本发明还包括式I化合物的盐、溶剂化物、立体异构体、前药和活性代谢物。
术语“盐”可以包括游离碱的酸加成盐或加成盐。优选地，盐为药学上可接受的。可以用于形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括，但不限于得自无毒无机酸以及得自无毒有机酸的盐，无机酸为例如硝酸、磷酸、硫酸或氢溴酸、氢碘酸、氢氟酸、亚磷酸，有机酸为例如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷双酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸、和醋酸、马来酸、琥珀酸或柠檬酸。这些盐的非限制性实例包括萘二磺酸盐、苯磺酸盐、硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、醋酸盐、三氟醋酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲烷磺酸盐等。也包括氨基酸的盐例如精氨酸盐等以及葡糖酸盐、半乳糖醛酸盐(参见，例如Berge等人“Pharmaceutical Salts,”J.Pharma.Sci.1977；66:1)。
式I化合物的酸加成盐可以通过使游离碱形式与足量的所需酸接触而制备，以传统方式产生盐。这些游离碱形式可以通过使盐形式与碱接触并以传统方式分离游离碱而再生。这些游离碱形式在某些物理特性例如在极性溶剂中的溶解度方面不同于它们各自的盐形式，但除此以外，这些盐对于本发明目的而言等同于它们各自的游离碱。
还包括全盐(total salt)和偏盐(partial salt)，即相对于每摩尔的式I化合物的酸具有1、2或3优选为2当量的碱的盐，或者相对于每摩尔的式I化合物的碱具有1、2或3当量优选为1当量的酸的盐。
出于分离或纯化的目的，也可以使用药学上不可接受的盐。然而，仅有药学可接受的非毒性盐为治疗使用，因此它们是优选的。
药学可接受的碱加成盐是与金属或胺形成的，例如碱金属和碱土金属或有机胺。用作阳离子的金属的实例为钠、钾、镁、钙等。合适的胺的实例为Ν,Ν'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。
所述酸性化合物的碱加成盐通过使游离酸形式与足量的所需碱接触而制备，以传统方式生产盐。游离酸形式可以通过使盐形式与酸接触并分离游离酸而再生。
本发明的化合物可以同时具有碱性和酸性中心，因此可以处于两性离子或内盐的形式。
通常而言，式I化合物的药学可接受盐可以容易地通过使用合适的所需酸或碱而制备。盐可以从溶液中沉淀并通过过滤而收集或者可以通过蒸发溶剂而回收。例如，酸例如盐酸的水溶液可以被加至式I化合物的水性混悬液中，并将所得的混合物蒸发至干(冻干)而获得固体的酸加成盐。或者，式I化合物可以溶解在合适的溶剂例如醇(如异丙醇)中，且酸可以加到同一溶剂或另一合适溶剂中。所得的酸加成盐可以在之后直接沉淀，或通过添加极性较小的溶剂例如二异丙醚或己烷而沉淀，并通过过滤而分离。
有机化学领域的技术人员将认识到，很多有机化合物可以与溶剂(有机化合物在该溶剂中反应，或从其中沉淀或结晶)形成复合物。这些复合物被称为“溶剂化物”。例如，与水的复合物被称为“水合物”。本发明化合物的溶剂化物在本发明的范围内。式I化合物的盐可以形成溶剂化物(例如，水合物)，且本发明也包括所有这些溶剂化物。词语“溶剂化物”的意思对于本领域技术人员熟知为通过溶剂和溶质的相互作用(即，溶剂化作用)形成的化合物。用于制备溶剂化物的技术在领域内已良好建立(参见，例如Brittain.Polymorphism in Pharmaceutical solids.Marcel Decker,New Youk,1999)。
本发明也包括式I化合物的N氧化物。术语“N氧化物”是指，对于含有另外未取代的sp2N原子的杂环，N原子可以具有共价结合的O原子，即-N→O。这些N氧化物取代的杂环的实例包括吡啶基N氧化物、嘧啶基N氧化物、吡嗪基N氧化物和吡唑基N氧化物。
式I的化合物可以具有一个或多个手性中心，且基于单独取代基的 性质，它们也可以具有几何异构体。在空间上原子排布不同的异构体被称为“立体异构体”。不是互为镜像的立体异构体被称为“非对映体”，且相互为彼此的非重叠镜像的那些被称为“对映体”。当化合物具有手性中心时，一对对映体是可能的。对映体可以通过其非对称中心的绝对构型而特征化，并且通过Cahn和Prelog的R—和S-序列法则或者通过分子旋转偏振光的平面的方式而描述，并命名为右旋或左旋(即，分别为(+)或(-)异构体)。手性化合物可以以单独对映体或对映体的混合物存在。含有等比例对映体的混合物称为“外消旋混合物”。含有非等比例对映体的混合物被描述为具有“对映体过量”(ee)的R或S化合物。混合物中一种对映体的过量程度经常用下式确定的％对映体过量(％ee)值描述：
％ee＝(R)-(S)/(R)+(S)
对映体的比率也可以通过“光学纯度”来定义，其中将对映体混合物旋转平面偏振光的度数与单独光学纯的R和S化合物做比较。光学纯度可以使用下式确定：
光学纯度＝对映体主要/(对映体主要+对映体次要)。
化合物也可以是本文所述化合物的基本纯的(+)或(-)对映体。在一些实施方式中，含有基本纯的对映体的组合物包含至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的一种对映体。在一些实施方式中，含有基本纯的对映体的组合物为至少99.5％的一种对映体。在一些实施方式中，组合物仅包含本文所述化合物的一种对映体。
本发明包括式I化合物的所有单个异构体。说明书和权利要求书中特定化合物的描述或命名意在包括单独对映体及其混合物、外消旋物或其他。用于确定立体异构体的立体化学和拆分(resolution)或立体定位合成的方法为本领域熟知。具体而言，在通式I和II的化合物中显示有手性中心，其产生一组对映体。其他手性中心可以视取代基情况而存在。
对于很多应用，优选执行立体选择性合成和/或使反应产物进行合适的纯化步骤，从而来制备基本光学纯的材料。用于制备光学纯的材料的合适的立体选择性合成程序为领域内熟知，用于将外消旋混合物纯化为光学纯的级分的程序也如此。本领域技术人员还将意识到，本 发明化合物可以以多晶型存在，其中化合物能够以不同形式结晶。用于识别和分离多晶型的适当方法为本领域已知。
非对映体在物理特性和化学反应性上均有区别。非对映体的混合物可以基于溶解度、分级结晶或色谱特性例如薄层层析、柱层析或HPLC而分离成对映体对。
将非对映体的复杂混合物纯化为对映体通常需要两个步骤。在第一个步骤中，将非对映体的混合物拆分成对映体对，如上所述。在第二个步骤中，对映体对进一步被纯化为富集了一种或另一种对映体的组成物，更优选拆分为含有纯对映体的组成物。对映体的拆分通常需要与手性试剂例如溶剂或柱基质进行反应或分子相互作用。可以例如通过与第二试剂(即，拆分剂)的纯对映体的反应，将对映体混合物(例如外消旋混合物)转化为非对映体的混合物而达到拆分。之后可以分离所得的两种非对映异构产品。分离的非对映体之后可以通过逆转最初的化学转化而再转化为纯的对映体。
对映体的拆分也可以通过它们与手性物质的非共价结合上的差异而实现，例如，通过在纯手性吸附剂上的层析。对映体与层析吸附剂之间的非共价结合产生非对映异构复合物，引起层析体系中移动和结合状态中的差异分区。因此，两种对映体以不同速率经层析体系(例如柱)移动，实现它们的分离。
手性拆分柱在领域内熟知，并市售可得(例如，从MetaChem Technologies Inc.,a division of ANSYS Technologies,Inc.,Lake Forest,CA)。对映体可以使用例如用于HPLC的手性固定相(CSP)而分析和纯化。手性HPLC柱通常含有固定至二氧化硅填充料表面的一种形式的对映体化合物。
D-苯基甘氨酸和L-亮氨酸是I型CSP的实例并利用π-π相互作用、氢键、偶极-偶极相互作用和空间相互作用的组合来实现手性识别。为在I型柱上拆分，分析物对映体必须含有与CSP互补的官能性，从而分析物与CSP进行必要的相互作用。样本应该优选包含一种以下官能团：π-酸或π-碱、氢键供体和/或受体、或酰胺偶极。有时利用衍生化作用将作用位点加至缺乏其的化合物。最常见的衍生化涉及由胺和羧酸形成酰胺。
MetaChiral ODMTM是II型CSP的实例。形成溶质-CSP复合物的主要机制是通过吸引相互作用，但是包含配合体也起重要作用。氢键、π-π相互作用和偶极叠合对于MetaChiralTM ODM上的手性拆分较为重要。当溶质分子不包含溶质-柱相互作用所需的基团时，衍生化可能是有必要的。通常对苯甲胺的衍生对于一些强极性分子例如胺和羧酸是所需的，否则，它们会通过非特异性的立体相互作用与固定相强烈反应。
当适用时，式I或II的化合物可以通过例如柱层析分离或硅胶TLC分离而分离成非对映体对。这些非对映体对在本文中提及为具有高TLC Rf的非对映体；和具有低TLC Rf的非对映体。非对映体可以使用本领域熟知的方法(例如本文描述的那些)而进一步富集特定对映体，或拆分为单一对映体。
非对映体对的相对构型可以通过理论模型或法则(例如Cram法则、Felkin-Ahn模型)的应用或使用计算化学程序产生的更可靠的三维模型来进行推导。在很多例子中，这些方法能够预测哪个非对映体是化学转换的能量上有利的产物。作为可替换方法，非对映体对的相对构型可以通过发现一种(或两种)非对映体对中的单个对映体的绝对构型而间接确定。
立体中心的绝对构型可以通过本领域技术人员非常熟知的方法(例如，X射线衍射、圆二色性)而确定。绝对构型的确定也可用于证实理论模型的可预测性，并且可用于拓展这些模型对于经由相似机制反应而制备的相似分子的用途(例如，经由氢化物的酮还原或酮的还原胺化)。
本发明还可以包括由于不直接与环连接的双键上的R2～R3取代基而产生Z-E型的立体异构体及其混合物。当m不是1且m和n不同时，会遇到其他Z-E立体异构体。应用Cahn-Ingold-Prelog优选法则来确定由于双键连接的取代基的双键平面中的各个位置引起的立体异构体是否为Z或E。如果最高优先的2个基团位于经过C＝C键的参考平面的同一侧，则立体异构体被命名为Z(zusammen＝一起)。另一种立体异构体被命名为E(entgegen＝相反)。
E-Z型的立体异构体的混合物可以使用基于这些化合物的不同化 学物理特性的典型纯化方法而分离成(和/或表征)其成分。包括在这些方法中的是分级结晶，通过低、中或高压技术执行的层析，分级蒸馏和任何其他本领域技术人员非常熟知的方法。
本发明也包括式I或II的化合物的前药，即，当施用至哺乳动物受试者时，在体内释放式I或II的活性药物的化合物。前药是药学上有活性的化合物，或者更典型地为通过代谢转化而转化成药学活性剂的非活性化合物。以修饰可以被体内切割从而释放母体化合物的方式，通过修饰式I化合物中存在的官能团来制备式I化合物的前药。在体内，前药容易在生理条件下经历化学变化(例如，被水解或受到天然存在的酶的作用)，引起药学活性剂的释放。前药包括式I或式II的化合物，其中羟基、氨基或羧基与任何可以在体内被切割从而分别再生出游离羟基、氨基或羧基的基团结合。前药的实例包括但不限于式I化合物的酯(例如，乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物)或任何其他在接触到生理pH时或通过酶作用被转化为活性母体药物的衍生物。选择和制备合适的前药衍生物的常规步骤在本领域中记载(参见，例如，Bundgaard.Design of Prodrugs.Elsevier,1985)。
前药可以以与它们所转化的活性成分相同的方式进行施用，或者它们可以以储库形式例如经皮贴剂或其他适用于(通过提供酶或其他合适试剂)将前药随时间缓慢地转化为活性成分并将活性成分运送至患者的储库而进行运送。
除非特别指出，术语“活性成分”被理解为指代本文定义的式I的化合物。
本发明也包括代谢物。本文公开化合物的“代谢物”是在化合物代谢时形成的化合物的衍生物。术语“活性代谢物”是指当化合物代谢时形成的化合物的生物学活性衍生物。术语“代谢的”是指特定物质在生命体内变化的过程总和。简单而言，身体内存在的所有化合物被体内的酶操纵，以从中获取能量和/或将其从身体中除去。特定酶对化合物引起特定结构变化。例如，细胞色素P450催化多种氧化和还原反应，而尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶催化活化的葡糖醛酸分子向芳香醇、脂肪醇、羧酸、胺和游离巯基的转移。其他关于代谢的信息可以从The Pharmacological Basis of Therapeurics，第九版，McGraw-Hill (1996)，11～17页中获得。可以通过将化合物施用至宿主并分析宿主的组织样本、或通过化合物与肝细胞的体外孵育并分析所得化合物来识别本文公开的化合物的代谢物。两种方法均为本领域熟知。
σ-2受体组合物
在一些实施方式中，本发明提供组合物，例如包括σ-2受体的结合检定混合物，其包括含有σ-2受体和式I或式II的σ-2配体化合物(包括但不限于本文特别描述的个别化合物)的组合物。
在一些实施方式中，σ-2受体与σ-2配体化合物复合。在一些实施方式中，包括σ-2受体的组合物是分离的组合物。本文关于σ-2受体所用的术语“分离的组合物”是指无细胞或者以其他方式从其天然环境移出的σ-2受体。在一些实施方式中，天然环境是未被裂解或未以其他方式破坏的细胞。从细胞中分离σ-2受体可以通过常规已知的方法完成，例如分离各种细胞组分并各自测试其中σ-2受体的存在(通过非限制性实例的方式，使用竞争性放射性配体方法)。因此，分离的σ-2受体可以存在于细胞质中或细胞的各种亚区室中，例如线粒体或内质网、内体或溶酶体、或脂筏中，这可以是σ-2受体在其天然环境中的物理位置。脂筏是富含特定组分例如但不限于胆固醇和鞘脂的通常较小(10-200nm)、异质且高度动态的组件。脂筏的其它组分包括但不限于，谷氨酸受体(如离子型(阳离子特异的离子通道)和/或代谢型(G蛋白偶联)，mGluR5)、胆固醇、脂质、BACE、γ-分泌酶、全长APP(淀粉样蛋白前体蛋白)、神经节苷脂(例如神经节苷脂GM1)、细胞朊蛋白、跨膜蛋白识别的淀粉样蛋白-β前体样蛋白1(APLP1)、跨膜蛋白30B(TMEM30B)、α7烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRα7)、晚期糖基化终产物受体(RAGE)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)、神经生长因子受体(NGFR)(例如TrkA和p75神经营养因子受体)、胰岛素受体亚单元、或其任何组合。参见Rushworth等人,International Journal of Alzheimer's Disease,第2011卷,Article ID603052,14页,其全部引入本文以供参考。脂筏可以从细胞中分离且分离的脂筏可以含有σ-2受体。
在一些实施方式中，将σ-2受体暴露于Abeta寡聚体或其它Abeta种类，使得其与β淀粉样蛋白寡聚体缔合或复合。在一些实施方式中， β淀粉样蛋白寡聚体已从细胞中分离。在一些实施方式中，以合成方式制备或在体外制备β淀粉样蛋白寡聚体。在本文中描述β淀粉样蛋白寡聚体和种类的非限制性实例。
在一些实施方式中，包括σ-2受体的组合物额外包括其它受体或其组(panel)。实例为：谷氨酸受体(如离子型(阳离子特异的离子通道)和/或代谢型(G蛋白偶联)，已知GluR5)、α7烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRα7)、晚期糖基化终产物受体(RAGE)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)、神经生长因子受体(NGFR)(例如TrkA和p75神经营养因子受体)、胰岛素受体亚单元、或其任何组合。组合物的其它可能组分包括胆固醇、脂质、BACE、γ-分泌酶、全长APP(淀粉样蛋白前体蛋白)、神经节苷脂(例如神经节苷脂GM1)、细胞朊蛋白、跨膜蛋白、β淀粉样蛋白前体样蛋白1(APLP1)、跨膜蛋白30B(TMEM30B)。
包括σ-2受体、σ-2配体和脂筏或者来自脂筏的蛋白、脂质、胆固醇或其它组分的组合物通过例如从细胞中分离σ-2受体并将σ-2受体与σ-2配体接触来制备。在一些实施方式中，σ-2配体和σ-2受体在足以形成复合物的条件下接触。在一些实施方式中，复合物在β淀粉样蛋白寡聚体的存在下形成。
文献中已提议Abeta寡聚体的多种受体，包括朊蛋白、胰岛素受体、β肾上腺素能受体和RAGE(晚期糖化终产物的受体)。Laurén,J.等人,2009,Nature,457(7233):1128-1132；Townsend,M.等人,J.Biol.Chem.2007,282:33305-33312；Sturchler,E.等人,2008,J.Neurosci.28(20):5149-5158。实际上，很多研究者相信，Abeta寡聚体可以与多于一种的受体蛋白结合。Krafft GA,Klein WL Neuropharmacology(2010)Sep-Oct；59(4-5):230-42。基于本文呈现的以及在与本申请同日提交的共同待决的共同转让申请中的证据，本发明的发明者假定出(不必须排他地)位于神经元中的Abeta寡聚体的其他受体。不受理论的约束，提出σ-2受体是神经元中Abeta寡聚体的受体。在一些实施方式中，本发明提供组合物，其包括神经元中表达的Abeta寡聚体受体以及Abeta寡聚体。这样的组合物还可以包括不是Abeta寡聚体受体的一种或多种神经元蛋白。在一些实施方式中，Abeta寡聚体受体是σ-2受体。在 一些实施方式中，σ-2受体是活化受体。在一些实施方式中，σ-2受体是不活化或失敏受体。在一些实施方式中，组合物包括脂筏蛋白。脂筏蛋白的实例在本文描述但实例是非限制性的。神经元蛋白是在神经元细胞中或任何情况下在中枢神经系统中特异表达的蛋白。在一些实施方式中，神经元蛋白在脑中特异表达。在一些实施方式中，神经元蛋白是在神经元中而不在其它组织或细胞类型中表达的蛋白。在一些实施方式中，神经元蛋白是在神经元中而不在睾丸以外的其它组织或细胞类型中表达的蛋白。在一些实施方式中，额外的蛋白可以促进Abeta寡聚体在神经元中的有害作用。
前述含有σ-2受体的组合物可以在用于识别与该受体结合的其它化合物的检定中采用，这样的化合物因此在使免受、减少或逆转突触丧失或膜运输异常中具有潜在活性，进一步在抑制认知衰退和治疗MCI和阿尔茨海默病中具有活性。例如，这样的检定包括但不限于可以测量标记的σ-2配体被未标记的候选σ-2配体取代的检定。这样的用于识别活性化合物的竞争性结合检定已在制药产业使用了许多年，且为本领域技术人员所知晓。
本发明化合物的用途
在一些实施方式中，本发明提供抑制与神经元细胞暴露于Abeta种类相关的突触数量减少或膜运输异常的方法。本发明也提供在患者中治疗认知衰退和/或神经退行性疾病例如阿尔茨海默病或轻度认知障碍(MCI)的方法，包括向患者施用本文记载的σ-2配体或其药学可接受的盐。在一些实施方式中，抑制或治疗认知衰退和/或神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病)的方法包括抑制或治疗一种或多种选自记忆丧失、思维混乱、判断力受损、人格改变、定向障碍和语言技巧丧失中的认知衰退症状。在一些实施方式中，方法包括抑制或治疗由Abeta寡聚体介导的或与Abeta寡聚体相关的疾病或障碍或病症(参见段落002)。在一些实施方式中，抑制或治疗认知衰退和/或神经退行性疾病例如阿尔茨海默病的方法包括以下的一种或多种：(i)恢复可经电生理学测量检测的长时程增强效应(LTP)、LTD或突触可塑性或者任何在以上术语定义中提及的认知功能的其它负面变化；和/或(ii)抑制或治 疗神经退行性变；和/或(iii)抑制或治疗一般的淀粉样变性；和/或(iv)抑制或治疗淀粉样蛋白产生、淀粉样蛋白组装、淀粉样蛋白聚集和淀粉样蛋白寡聚体结合及淀粉样蛋白沉积中的一种或多种；和/或(v)抑制、治疗和/或减轻一种或多种Abeta寡聚体对神经元细胞的作用，特别是非致死作用。在一些实施方式中，抑制、治疗和/或减轻认知衰退和/或神经退行性疾病例如阿尔茨海默病的方法包括抑制、治疗和/或减轻淀粉样蛋白产生、淀粉样蛋白组装、一种或多种Abeta寡聚体对神经元细胞的活性/作用、淀粉样蛋白积聚、淀粉样蛋白结合和淀粉样蛋白沉积中的一种或多种。在一些实施方式中，抑制、治疗和/或减轻认知衰退和/或神经退行性疾病例如阿尔茨海默病的方法包括抑制、治疗和/或减轻一种或多种Abeta寡聚体对神经元细胞的一种或多种活性/作用。
在一些实施方式中，一种或多种Abeta寡聚体对神经元细胞、淀粉样蛋白积聚、淀粉样蛋白结合和淀粉样蛋白沉积的活性/作用是Abeta寡聚体对膜运输或突触数量的作用。在一些实施方式中，σ-2配体抑制Abeta寡聚体对膜运输或突触数量的作用或Abeta寡聚体结合。
在一些实施方式中，本发明提供治疗蛋白质构象病(proteopathic disease)的方法。在一些实施方式中，方法包括使具有蛋白质构象病的受试者与本发明的结合σ-2受体的σ-2配体或含有该配体的组合物接触。
在一些实施方式中，蛋白质构象病是CNS蛋白质构象病，特征为Abeta蛋白增加，例如MCI、唐氏综合症、黄斑变性或阿尔茨海默病等。
在一些实施方式中，本发明提供通过施用本发明的σ-2配体来治疗一种或多种轻度认知障碍(MCI)或痴呆的方法。在一些实施方式中，本发明提供治疗MCI和痴呆的方法。
在一些实施方式中，本发明提供用本发明的σ-2配体治疗个体，以在受到Abeta种类例如Abeta寡聚体不利影响的功能方面部分地或全部地将受试者的细胞修复到正常表型的方法。实例是可以通过多种方法包括本文所述检定而测量的突触数量减少和膜运输异常。正常的表型可以是例如正常的膜运输。在一些实施方式中，正常的表型是正常的认知能力。“正常”表型可以通过比较受试者的结果与正常受试者的 样本的结果而确定。样本可以少至1个受试者或1个样本，或者可以是多于10个样本或受试者，且标准是基于多个受试者计算的均值。
在一些实施方式中，方法包括向受到认知衰退或神经退行性疾病折磨的受试者施用与σ-2蛋白结合并抑制β淀粉样蛋白病理的化合物或组合物。在一些实施方式中，β淀粉样蛋白病理是膜运输缺陷、突触数量的减少、树突脊数量的减少、树突脊形态的变化、LTP的变化、LTD的变化、动物的记忆和学习措施中的缺陷或其任意组合等。以上用途得自发明者举出的以下证据：
已在本文显示式I和式II内的化合物具体为化合物II抑制神经细胞中与Abeta相关的突触减少，并且当在引入Abeta寡聚体之前或之后添加化合物时，其对伴随着这些细胞暴露于合成制剂或从阿尔茨海默病人脑中分离的制剂(后者在体外介导淀粉样蛋白病理中更有潜力得多)中的Abeta寡聚体时的神经元细胞中的膜运输异常(例如，使用下述的MTT检定)产生抑制。在式I和式II内的其他化合物也显示为抑制膜运输中的异常。化合物II也在本文中示出为抑制在如本文所述的转基因和诱导的阿尔茨海默病动物模型中展现的认知缺陷，其与认知衰退和记忆丧失有关。化合物II以及式I内的其他化合物例如化合物B和II也已经在药物代谢动力学研究中示出为全身性吸收并穿越血脑屏障并为生物可得。由于这些特性，并鉴于大部分作用被归因于淀粉样蛋白病理(例如阿尔茨海默病早期)的发展中的Abeta寡聚体和Abeta组装体的技术现状，预期化合物II将在轻度认知障碍的治疗和防止中以及在阿尔茨海默病的治疗(如本文所述)中有活性。此外，因为与化合物II的结构相似性，并且因为已经证实化合物II的以上体外活性、在以上具体公开的化合物当中的代表性数量的式I和式II内的其他化合物的药物代谢动力学特性和σ-2配体状态，预期式I和式II内的所有化合物在体内相似地有活性。
化合物II行为效力：小鼠条件性恐惧中Abeta寡聚体诱导的记忆缺陷是在哥伦比亚大学Ottavio Arancio博士的实验室中建立的模型(Puzzo’08)。一些药物公司在他们的发现工作中使用该同一模型。情境条件性恐惧是与人认知功能尤其是新记忆创建相关的联想记忆形成的公认模型(Delgado’06)。将Abeta寡聚体在临条件训练前注射到野 生型动物的海马中，在24小时后通过僵立行为对记忆进行评估。详情提供在实施例9中。其中，化合物II能够完全地消除小鼠中的记忆缺陷而不抑制记忆(当单独给药时)或造成任何行为或行动毒性。选择该模型体系是因为寡聚体的海马内施用使得可以快速比较评估化合物活性和脱靶毒性。结果以图表显示在图4中。
化合物II也在两个转基因阿尔茨海默病模型中进行体内测试，以示出化合物在逆转Abeta寡聚体相关的记忆丧失中的作用。具体而言，化合物II修复两个不同突变小鼠模型的能力(该突变小鼠模型随着年龄增长而逐渐发展出以记忆丧失为特征的认知衰退)，以记起记忆丧失发生前获取的技能。此外，化合物II显著抑制野生型小鼠的海马Abeta寡聚体暴露的效应，保留小鼠获取新记忆的能力。
这些行为研究统一证明了，使用两个不同的阿尔茨海默病模型，以两种性别，并按照短期或长期给药，化合物II引起两个不同行为任务中学习和记忆的改善，并且表明了体外检定与体内活性相关。因此，与显示化合物II结合σ-2受体以及其在体外抑制Abeta相关的病理的数据相结合，这些结果表明化合物II可以用于治疗神经退行性疾病例如阿尔茨海默病。式I和式II内的其他化合物也被发现与σ-2受体结合并具有如化合物II的相似体外活性。基于它们与化合物II的相似性，并且具有化合物II类似的Abeta寡聚体的药效团，预计它们具有如化合物II的相似体外活性和体内活性。确实，截止这些化合物已经在体外进行了测试的程度，它们具有如化合物II的同类活性，因此预计它们具有相似的体内活性，因此可用于相同的治疗症状。多种在式I或式II内的其他σ-2配体化合物已经或将在本文所述的突触减少和/或膜运输检定中进行测试，并预期在抑制Abeta寡聚体相关的突触丧失中以及在抑制Abeta寡聚体相关的膜运输异常中具有活性，并且在抑制认知衰退和治疗阿尔茨海默病中具有相似活性。
前述结论基于以下阿尔茨海默病和轻度认知障碍的背景。如本文所讨论的，证据表明，由Abeta寡聚体介导的经膜运输介导的神经元表面受体表达减少是突触可塑性(LTP)的电生理测量的寡聚体抑制以及因此的学习和记忆的基础(参见Kamenetz F,Tomita T,Hsieh H,Seabrook G,Borchelt D,Iwatsubo T,Sisodia S,Malinow R.APP processing and synaptic function.Neuron.2003Mar27；37(6):925-37；和Hsieh H,Boehm J,Sato C,Iwatsubo T,Tomita T,Sisodia S,Malinow R.AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depression and dendritic spine loss.Neuron.2006Dec7；52(5):831-43)。经甲臜形态转变测量由寡聚体引起的膜运输速率变化已经用于细胞系中，以发现Abeta寡聚体-阻抑药物[Maezawa I,Hong HS,Wu HC,Battina SK,Rana S,Iwamoto T,Radke GA,Pettersson E,Martin GM,Hua DH,Jin LW.A novel tricyclic pyrone compound ameliorates cell death associated with intracellular amyloid-beta oligomeric complexes.J Neurochem.2006Jul；98(l):57-67；Liu Y,Schubert D.Cytotoxic amyloid peptides inhibit cellular3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)reduction by enhancing MTT formazan exocytosis.J Neurochem.1997Dec；69(6):2285-93；Liu Y,Dargusch R,Banh C,Miller CA,Schubert D.Detecting bioactive amyloid beta peptide species in Alzheimer's disease.J Neurochem.2004Nov；91(3):648-56；Liu Y,Schubert D.Treating Alzheimer's disease by inactivating bioactive amyloid beta peptide.Curr Alzheimer Res.2006Apr；3(2):129-35；Rana S,Hong HS,Barrigan L,Jin LW,Hua DH.Syntheses of tricyclic pyrones and pyridinones and protection of Abeta-peptide induced MC65neuronal cell death.Bioorg Med Chem Lett.2009Feb l；19(3):670-4.Epub2008Dec24；和Hong HS,Maezawa I,Budamagunta M,Rana S,Shi A,Vassar R,Liu R,Lam KS,Cheng RH,Hua DH,Voss JC,Jin LW.Candidate anti-Abeta fluorene compounds selected from analogs of amyloid imaging agents.Neurobiol Aging.2008Nov18.(Epub ahead of print)]，这样的药物降低啮齿动物体内的Abeta脑含量[Hong HS,Rana S,Barrigan L,Shi A,Zhang Y,Zhou F,Jin LW,Hua DH.Inhibition of Alzheimer's amyloid toxicity with a tricyclic pyrone molecule in vitro and in vivo.J Neurochem.2009Feb；108(4):1097-1108]。因此，上述测试已经在识别化合物以治疗阿尔茨海默病和轻度认知障碍中建立相关性。
在一些实施方式中，关于抑制Abeta寡聚体对神经元(例如脑中的神经元)、淀粉样蛋白组装或其破坏以及淀粉样蛋白(包括淀粉样蛋白寡聚体)结合和淀粉样蛋白沉积的一种或多种作用，化合物具有小于100μM、50μM、20μM、15μM、10μM、5μM、1μM、500nM、 100nM、50nM或10nM的IC50值。在一些实施方式中，关于抑制Abeta种类例如寡聚体对神经元(例如中枢神经元)的活性/作用，化合物具有小于100μM、50μM、20μM、15μM、10μM、5μM、1μM、500nM、100nM、50nM或10nM的IC50值。
在一些实施方式中，本发明化合物对Abeta种类例如寡聚体对神经元(例如脑中神经元)的一种或多种作用(例如淀粉样蛋白(包括淀粉样蛋白寡聚体)与突触的结合以及由Abeta寡聚体介导的膜运输异常)的抑制百分比在10nM至10μM的浓度进行测量。在一些实施方式中，所测量的抑制百分比为约1％至约20％、约20％至约50％、约1％至约50％、或约1％至约80％。抑制可以例如通过在暴露于β淀粉样蛋白种类之前和之后定量神经元的突触数量或者在同时存在σ-2配体和Abeta种类时定量突触数量而评测，其中σ-2配体与Abeta种类暴露同时、或在之前或在之后。作为另一个实例，抑制可以通过存在和不存在Abeta种类以及存在和不存在本发明σ-2配体时确定膜运输并比较测量胞吐速率和程度、内吞速率和程度或其他细胞代谢指标的一个或多个参数而进行评测。本发明的发明者已举出生化检定证据表明本发明的化合物也抑制淀粉样蛋白聚集。
在一些实施方式中，本文所述的化合物与σ-2受体特异性地结合。与特定受体特异性结合的化合物是指相对于另一受体偏好一种受体的化合物。例如，尽管化合物对σ-1和σ-2受体都能结合，但以高出σ-1受体至少10％的亲和性结合时，可以说化合物是对σ-2受体特异性的。在一些实施方式中，对于一种结合配偶体(例如受体)的特异性相对于第二结合配偶体高出至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或1000％。
在一些实施方式中，本发明提供使用标记的σ-2配体在动物中测量β淀粉样蛋白相关的认知衰退的方法。在一些实施方式中，方法包括使动物与本发明的标记σ-2配体接触并测量σ-2活性或表达。在一些实施方式中，方法包括将动物中的σ-2活性或表达与已知具有β淀粉样蛋白诱导的认知衰退的动物进行比较。如果活性或表达与已知具有β淀粉样蛋白诱导的认知衰退的动物相同，称该动物具有相同水平的认知衰退。动物可以根据在多个β淀粉样蛋白诱导的认知衰退阶段中的 已知活性或表达中的相似度来分级。本文所述的任意σ-2配体可以被标记，从而标记的σ-2配体可以在体内使用。
在确定任意上述通式的化合物和上述描述为σ-2拮抗剂的其它化合物是否可有效治疗本文所述的各种病症时，可以使用体外检定。体外检定已与使用化合物II的体内效果相关联。例如，如果与化合物II具有结构相似性的式III-IV的化合物例如在本文所述的体外检定中具有活性，则也可将其用于体内治疗或改善本文所述的病症，包括抑制或恢复突触丧失、调节神经元细胞中的膜运输变化、使免受记忆丧失或恢复、以及治疗认知衰退病症、疾病和障碍例如MCI和阿尔茨海默病。检定部分基于β淀粉样蛋白寡聚体及其在突触处与神经元结合的功能以及β淀粉样蛋白寡聚体在体外对神经元的作用。在一些实施方式中，本发明者认为包括σ-2蛋白的神经元中的Abeta寡聚体受体与本文所述的β淀粉样蛋白组装体结合，且与σ-2蛋白结合的式I、II或VIII的化合物会抑制β淀粉样蛋白组装体与受体的结合。在竞争性放射性配体结合检定中，本发明者已显示本发明的化合物对于σ-2受体具有特异性。发明者也已显示，本发明的化合物抑制Abeta寡聚体与其迄今未识别的受体在神经元表面上的结合。在一些实施方式中，提供方法来确定任何上式的化合物在神经元信号传导中的σ-2配体功效。在一些实施方式中，方法包括使细胞(例如但不限于初级神经元)与σ-2配体结合，以及测定神经元功能。在一些实施方式中，在体外接触细胞。在一些实施方式中，在体内接触细胞。神经元活性可以是信号传导活性、电活性、突触蛋白的产生或释放等。增强或恢复信号传导的σ-2拮抗剂被识别为可有效调节神经元活性的化合物。在一些实施方式中，细胞源自病理学样品。在一些实施方式中，细胞源自具有神经退行性疾病的受试者。在一些实施方式中，神经退行性疾病是MCI或阿尔茨海默病，尤其是轻度阿尔茨海默病。
β淀粉样蛋白组装体和组装体使用方法的实施方式在此处和以下以及WO2011/014880(申请号PCT/US2010/044136)、WO2010/118055(申请号PCT/US2010/030130)和申请号PCT/US2011/026530中描述，其各自全部引入本文以供参考。还可以使用可使用的其它检定，例如膜运输检定和/或条件性恐惧检定。这些方法在本文及WO2011/014880 (申请号PCT/US2010/044136)、WO2010/118055(申请号PCT/US2010/030130)和申请号PCT/US2011/026530中描述，其各自全部引入本文以供参考。
受体结合检定和化合物筛选
本发明还提供对抑制认知衰退或治疗神经退行性疾病的另一化合物进行鉴定的方法。在一些实施方式中，方法包括使细胞与结合σ-2受体的化合物接触。在一些实施方式中，方法包括确定化合物是否抑制β淀粉样蛋白病理学，其中抑制β淀粉样蛋白病理学的化合物被鉴定为结合σ-2受体且抑制认知衰退或治疗神经退行性疾病的化合物。在一些实施方式中，方法还包括鉴定结合σ-2受体的其它化合物。在一些实施方式中，鉴定与σ-2受体结合的化合物的方法包括竞争性结合检定，其中使测试化合物在已知σ-2配体例如本发明化合物的存在下与σ-2受体接触，其中竞争性地抑制已知配体的结合的测试化合物被识别为σ-2受体配体。
确定化合物是否可与σ-2受体结合的方法是已知的，且可以使用任何方法。例如，通过合同研究组织进行的测试可以用于确定化合物是否与σ-2结合。可以进行各种检定以确定化合物是否与σ-2受体结合。在一些实施方式中，使用稳定地表达人受体包括但不限于σ-2受体的均质群体的细胞，例如但不限于人胚肾(HEK293)、Jurkat细胞、或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在其它情况下，使用σ-2受体的组织来源，例如啮齿动物新皮质膜。其实例描述于本文的实施例部分。
在一些实施方式中，使测试化合物与细胞或细胞膜接触以确定测试化合物是否可与σ-2受体结合。在一些实施方式中，将测试化合物溶解于载体或媒介物，例如但不限于二甲亚砜。在一些实施方式中，培养细胞直到汇合(confluent)。在一些实施方式中，在汇合时，可以通过柔和的刮擦使细胞脱离。在一些实施方式中，通过胰蛋白酶化或任何其它合适的脱附方式使细胞脱离。
在一些实施方式中，可以通过例如竞争性放射性配体结合检定来确定测试化合物与σ-2受体的结合。放射性配体结合检定可以在稳定表达人受体的完整细胞或组织来源上进行。例如，可以在缓冲剂中洗 涤、离心和/或重悬脱离的细胞或组织。可以根据任何方法包括但不限于本文所述的那些对测试化合物进行放射性标记。可以在不存在和存在各种浓度(范围可以是例如1010-103M或1011-104M)的竞争药物的情况下以0.1μCi的固定浓度使用放射性配体。可以将药物添加到缓冲液中的组织或细胞(～例如50,000细胞)并使其孵育。可以在存在各种受体亚型的广谱活化剂或抑制剂或功能性激动剂或拮抗剂的情况下确定非特异结合(例如，针对σ受体，对各受体存在例如10μΜ合适配体)。可以通过快速过滤(其后可以用冰冷的缓冲液洗涤两次)来终止反应。可以使用任何方法包括但不限于液体闪烁分析仪来测量干燥滤片上的放射性。可以绘制取代曲线，并且可以使用例如GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA)来确定测试配体对于受体亚型的Ki值。可以通过将总结合(每分钟衰变数)与非特异结合(每分钟衰变数)之间的差异除以总结合(每分钟衰变数)来确定特异结合百分比。
在一些实施方式中，对于细胞系或组织来源中的结合研究，在各个实验内添加变化浓度的各个药物，一式两份，并且使用例如GraphPad Prism软件确定各自的IC50值。可以根据Cheng and Prusoff(1973)描述的等式确定各个配体的Ki值，且最终数据可以呈现为pKi±S.E.M.，其中在一些实施方式中，测试次数为约1～6。
在一些实施方式中，方法还包括确定与σ-2受体结合的化合物是否在σ-2受体处通过抑制可溶Αβ寡聚体诱导的神经毒性(关于抑制可溶Αβ寡聚体诱导的突触丧失和抑制可溶Αβ寡聚体诱导的膜运输检定不足)起到拮抗剂作用。在一些实施方式中，方法还包括确定σ-2受体拮抗剂在不存在Abeta寡聚体的情况下不影响运输或突触数目；不诱导神经元细胞中的caspase-3活性；抑制经σ-2受体激动剂对caspase-3活性的诱导；且/或降低或免受由σ-2受体激动剂引起的神经元细胞中的神经元毒性。
测试还可包括确定测试化合物对结合配偶体(其可以是但不限于σ-2受体)功能的作用的功能性检定。可以使用多种标准检定技术。例如，可以使用方法来测量化合物在活细胞或组织中的功能性的类激动剂或类拮抗剂的活性。方法包括但不限于，确定cAMP浓度和IP1水 平的TR-FRET，监测钙流量的实时荧光，测量阻抗调制、回肠收缩、肿瘤细胞凋亡的细胞介电谱。还可以通过例如确定化合物是否与σ-1受体、σ-2受体、两者均不或两者均结合来确定测试化合物的特异性。用于确定测试化合物是否与σ-1受体结合的方法描述于Ganapathy,M.E等人(1999)J.Pharmacol.Exp.Ther.,289:251-260，其全部引入本文以供参考。用于确定测试化合物是否与σ-1受体结合的方法描述于Bowen,W.D等人(1993)Mol.Neuropharmacol.,3:117-126，其全部引入本文以供参考，以及Xu,J.等人,Nature Communications,2011,2:380DOI:10.1038/ncomms1386，其也全部引入本文以供参考。
在各个实施方式中，本公开内容提供用于鉴定选择性、高亲和性σ-2受体配体的检定方案，该σ-2受体配体在抑制可溶Αβ寡聚体诱导的突触丧失方面通过抑制可溶Αβ寡聚体诱导的神经毒性在σ-2受体处用作功能性拮抗剂，抑制膜运输检定中可溶Αβ寡聚体诱导的不足，在不存在Abeta寡聚体的情况下不影响运输或突触数目，并且显示出本文所述的较好的药物样特性，使得由此鉴定的选择性、高亲和性σ-2受体拮抗剂化合物可以用于在体内治疗可溶Αβ寡聚体诱导的突触功能障碍。
在一些实施方式中，提供用于鉴定对减轻或使免受非致死Abeta寡聚体毒性具有活性的化合物的筛选方法，其基本上受益于将测试化合物与σ-2受体结合的能力引入为筛选标准，该能力通过例如其取代已知配体的能力或通过任何其它方法来评估。此外，测试化合物应进行体外测试或体内检定中的至少一种，其中体外测试可以评估化合物阻断或减轻Abeta寡聚体对神经元的非致死有害作用的能力(例如本文所述的膜运输检定或突触数目或寡聚体结合检定)，体内检定评估对认知衰退的治疗(例如本文所述的那些)。
在一些实施方式中，本发明提供确定受试者是否应受σ-2拮抗剂治疗的方法，其中受试者疑似具有认知衰退或神经退行性疾病或本文所述的其它病症、疾病或障碍。在一些实施方式中，方法包括使源自患者的样品与σ-2拮抗剂接触，以及确定σ-2调节化合物是否抑制或改善样品中存在的β淀粉样蛋白病理学，其中显示样品中存在的β淀粉样蛋白病理学被抑制或改善的样品指示受试者应受σ-2拮抗剂治疗。
另外，本发明包括鉴定抑制Αβ寡聚体诱导的突触数目减少等的σ-2拮抗剂的方法。在一些实施方式中，可以使用方法来鉴定用于治疗β淀粉样蛋白病理的σ-2拮抗剂。在一些实施方式中，使用方法来确定治疗β淀粉样蛋白病理的疗法功效。在一些实施方式中，β淀粉样蛋白病理是膜运输缺陷、突触功能障碍、动物内的记忆和学习缺陷、突触数目减少、树突棘长度或棘形态的改变、LTP缺陷、或Tau蛋白磷酸化的增加。
用于本公开内容的淀粉样的β淀粉样蛋白
人β淀粉样蛋白是发现集中于神经元突触中的整合膜蛋白淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的切割产物。β淀粉样蛋白自缔合形成亚稳的寡聚组装体(assembly)。在较高浓度下，Abeta会聚合并组装成线形原纤维，这通过较低pH得到促进。目前不清楚的是原纤维是否由寡聚体形成。β淀粉样蛋白寡聚体已证实为在动物模型中通过诱导阻断学习和记忆的神经元突触的改变而引起阿尔茨海默病，且β淀粉样蛋白原纤维早已与动物和人中的晚期阿尔茨海默病相关联。事实上，现代一种广受支持的阿尔茨海默病作用假说是，Abeta组装体尤其是Abeta寡聚体处于与阿尔茨海默病相关的早期病理学以及与较不严重的痴呆(例如MCT和轻度AD)相关的病理学的中心。明显地，James P.等人,"Natural oligomers of the amyloid-βprotein specifically disrupt cognitive function."Nature Neuroscience Vol.8(2005):79-84；Klyubin,I.等人,"Amyloid beta protein dimer-containing human CSF disrupts synaptic plasticity:prevention by systemic passive immunization."J Neurosci.Vol.28(2008):4231-4237。然而，对于寡聚体如何形成以及寡聚体的结构状态知之甚少。例如，缔合形成寡聚体的β淀粉样蛋白亚单位的数目目前是未知的，寡聚体的结构形式或暴露哪些残基也如此。有证据表明多于一种结构状态的寡聚体具有神经活性。Reed,Jess D.等人,"MALDI-TOF mass spectrometry of oligomeric food polyphenols."Phytochemistry66:18(September2005):2248-2263；Cleary,James P.等人,"Natural oligomers of the amyloid-βprotein specifically disrupt cognitive function."Nature Neuroscience Vol.8(2005):79-84。
β淀粉样蛋白对大脑内发现的许多蛋白包括ApoE和ApoJ具有亲 和性。然而，不清楚分子伴侣或其它蛋白是否与可影响其最终结构状态和/或其神经活性的蛋白缔合。
可溶Abeta肽很可能通过扰乱突触功能障碍和认知过程而在AD的早期起关键作用。例如，Origlia等人显示，可溶Abeta(Abeta42)在内嗅皮质中通过晚期糖基化终产物(RAGE)所介导的p38MAPK活化的神经元受体而损害长时程增强效应(LTP)。Origlia等人,2008,Receptor for advanced glycation end product-dependent activation of p38mitogen-activated protein kinase contributes to amyloid-beta-mediated cortical synaptic dysfunction.J.Neuroscience28(13):3521-3530，其引入本文以供参考。
在阿尔茨海默病的早期涉及突触功能障碍。已显示β淀粉样蛋白肽改变突触功能。Puzzo等人报道，Abeta的合成纤维状形式损害LTP的晚期蛋白合成依赖阶段，而不影响早期蛋白合成阶段。该报道与Abeta寡聚体对细胞具有高度毒性且涉及到突触功能障碍中的先前报道一致。Puzzo等人,2006,Curr Alzheimer's Res3(3):179-183，其引入本文以供参考。已发现Abeta通过多种第二信使级联包括一氧化氮级联而显著损害海马长时程增强效应(LTP)。NO/cGMP/cGK/CREB.Puzzo等人,J Neurosci.2005。在一些实施方式中，本公开内容提供包含σ-2受体拮抗剂的用于抑制β淀粉样蛋白寡聚体诱导的神经元细胞突触功能障碍；和抑制由神经元暴露于Abeta寡聚体而引起的海马长时程增强效应压抑的组合物以及方法。
可以将任何形式的β淀粉样蛋白用于实施本发明的筛选方法和检定，包括β淀粉样蛋白单体、寡聚体、原纤维、以及与蛋白缔合的β淀粉样蛋白(“蛋白复合物”)且更通常为β淀粉样蛋白组装体。例如，筛选方法可以采用各种形式的可溶β淀粉样蛋白寡聚体，例如公开于U.S.专利申请序列号第13/021,872号；U.S.专利公开2010/0240868；国际专利申请WO/2004/067561；国际专利申请WO/2010/011947；U.S.专利公开20070098721；U.S.专利公开20100209346；国际专利申请WO/2007/005359；U.S.专利公开20080044356；U.S.专利公开20070218491；WO/2007/126473；U.S.专利公开20050074763；国际专利申请WO/2007/126473、国际专利申请WO/2009/048631和U.S.专利 公开20080044406、U.S.专利第7,902,328号以及U.S.专利第6,218,506号，其各自引入本文以供参考。
β淀粉样蛋白形式，包括β淀粉样蛋白的单体或寡聚体可以得自任何来源。例如，在一些实施方式中，市售的β淀粉样蛋白单体和/或β淀粉样蛋白寡聚体可以以水溶液使用，且在其它实施方式中，以蛋白水溶液使用的β淀粉样蛋白单体和/或β淀粉样蛋白寡聚体可以由技术人员使用任何数量的已知技术进行分离和纯化。通常，各个实施方式的以蛋白和β淀粉样蛋白的水溶液制剂使用的β淀粉样蛋白单体和/或β淀粉样蛋白寡聚体可溶于水溶液中。因此，水溶液的蛋白和β淀粉样蛋白均可以是可溶的。
添加的β淀粉样蛋白可以是任何亚型。例如，在一些实施方式中，β淀粉样蛋白单体可以是β淀粉样蛋白1-42，且在其它实施方式中，β淀粉样蛋白单体可以是β淀粉样蛋白1-40。在其它实施方式中，β淀粉样蛋白可以是β淀粉样蛋白1-39或β淀粉样蛋白1-41。因此，各个实施方式的β淀粉样蛋白可以包括β淀粉样蛋白的任何C端亚型。其它实施方式包括N端已缺损的β淀粉样蛋白，且在一些实施方式中，任何上述β淀粉样蛋白C端异构体的N端可以是氨基酸2、3、4、5、或6。例如，β淀粉样蛋白1-42可以包括β淀粉样蛋白2-42、β淀粉样蛋白3-42、β淀粉样蛋白4-42或β淀粉样蛋白5-42及其混合物，且类似地，β淀粉样蛋白1-40可包括β淀粉样蛋白2-40、β淀粉样蛋白3-40、β淀粉样蛋白4-40或β淀粉样蛋白5-40。
各个实施方式中使用的β淀粉样蛋白形式可以是野生型，即具有与大多数种群体内合成的β淀粉样蛋白的氨基酸序列等同的氨基酸序列，或者在一些实施方式中，β淀粉样蛋白可以是突变β淀粉样蛋白。实施方式不限于任何特定种类的突变β淀粉样蛋白。例如，在一些实施方式中，引入水溶液中的β淀粉样蛋白可以包括已知的突变，例如具有“Dutch”(E22Q)突变或“Arctic”(E22G)突变的β淀粉样蛋白。这样的突变单体可以包括天然出现的突变，例如从易患例如阿尔茨海默病的个体的群体分离的β淀粉样蛋白形式，β淀粉样蛋白的家族形式。在其它实施方式中，可以通过使用分子技术合成制备突变β淀粉样蛋白单体，以制备具有特定突变的β淀粉样蛋白突变体。在其它实 施方式中，突变β淀粉样蛋白单体可以包括之前未识别的突变，例如，在随机产生的β淀粉样蛋白突变体中发现的那些突变体。本文使用的术语“β淀粉样蛋白”意在包括β淀粉样蛋白的野生型形式以及β淀粉样蛋白的任何突变形式。
在一些实施方式中，蛋白水溶液中的β淀粉样蛋白可以是单一亚型。在其它实施方式中，β淀粉样蛋白的各种C端亚型和/或β淀粉样蛋白的各种N端亚型可以组合形成β淀粉样蛋白混合物，其可以以蛋白水溶液提供。在其它实施方式中，β淀粉样蛋白可以源自被添加到含蛋白的水溶液中且原位切割的淀粉样蛋白前体蛋白(APP)，以及这样的实施方式，β淀粉样蛋白的各种亚型可以包含在该溶液中。在添加β淀粉样蛋白之后，在水溶液内可出现N端氨基酸缺损(fraying)和/或C端氨基酸移除。因此，即使在初始向溶液中添加单一亚型的情况下，如本文所述制备的水溶液也可以包括多种β淀粉样蛋白亚型。
添加到水溶液中的β淀粉样蛋白单体可以从自然来源例如活组织中分离，且在其它实施方式中，β淀粉样蛋白可以源自合成来源例如转基因小鼠或经培养的细胞。在一些实施方式中，β淀粉样蛋白形式包括单体、寡聚体或其组合从正常受试者和/或被诊断为具有认知衰退或与其相关的疾病(例如但不限于阿尔茨海默病)的患者中分离。在一些实施方式中，β淀粉样蛋白单体、寡聚体、或其组合是已从正常受试者或疾病患者中分离的Abeta组装体。在一些实施方式中，Abeta组装体具有高分子量，例如大于100KDa。在一些实施方式中，Abeta组装体具有中等分子量，例如10～100KDa。在一些实施方式中，Abeta组装体小于10kDa。
一些实施方式的β淀粉样蛋白寡聚体可以由与“寡聚体”的常用定义一致的任何数目的β淀粉样蛋白单体组成。例如，在一些实施方式中，β淀粉样蛋白寡聚体可以包括约2至约300、约2至约250、约2至约200个β淀粉样蛋白单体，且在在其它实施方式中，β淀粉样蛋白寡聚体可以由约2至约150、约2至约100、约2至约50、或约2至约25个β淀粉样蛋白单体组成。在一些实施方式中，β淀粉样蛋白寡聚体可以包括2个或更多个单体。各个实施方式的β淀粉样蛋白寡聚体可以基于单体的确认而与β淀粉样蛋白原纤维和β淀粉样蛋白初 原纤维区别开。具体地，β淀粉样蛋白寡聚体的β淀粉样蛋白单体通常是由β-折叠片组成的球状，而原纤维和初原纤维的β淀粉样蛋白单体的二级结构是平行β-片。
患有阿尔茨海默病或存在患病风险的受试者的识别
通过大脑皮质中细胞外β淀粉样蛋白(Aβ)斑块和神经元内神经原纤维缠结的存在来从组织学上定义阿尔茨海默病(AD)。各种诊断和预后用生物标记物在本领域内已知，例如磁共振成像、单光子发射断层摄像术、FDG PET、PiB PET、CSF tau，且Abeta分析以及关于其诊断准确性的可得数据讨论于Alves等人,2012,Alzheimer's disease:a clinical practice-oriented review,Frontiers in Neurology,April,2012,vol3,Article63,1-20，其引入本文以供参考。
痴呆诊断以及对将患痴呆个体的预测借助于磁共振成像和通过使用[(18)F]氟脱氧葡萄糖(FDG)的正电子发射断层摄像术(PET)。这些技术不特定用于AD。参见，例如Vallabhajosula S.Positron emission tomography radiopharmaceuticals for imaging brain Beta-amyloid.Semin Nucl Med.2011Jul；41(4):283-99。最近FDA批准用于对认知障碍患者中的中度至重度淀粉样蛋白神经斑成像的另一PET配体是Florbetapir F18注射剂，(4-((1E)-2-(6-{2-(2-(2-(18F)氟乙氧基)乙氧基)乙氧基}吡啶-3-基)乙烯基)-N-甲基苯胺，![]()
Lilly)。Florbetapir与纤维状Abeta特异结合，但不与神经原纤维缠结特异结合。参见例如，Choi SR等人,Correlation of amyloid PET ligand florbetapir F18binding with Αβ aggregation and neuritic plaque deposition in postmortem brain tissue.Alzheimer Dis Assoc Disord.2012Jan；26(1):8-16。PET配体Florbetapir的问题是在PET扫描的定性视觉评估上具有较低特异性。Camus等人,2012,Eur J Nucl Med Mol Imaging39:621-631。然而，许多具有神经斑的人看似认知正常。
阿尔茨海默病的CSF标记物包括总tau、磷-tau和Abeta42。参见例如，Andreasen,Sjogren and Blennow,World J Biol Psyciatry,2003,4(4):147-155，其引入本文以供参考。已经在许多研究中发现，在AD中，Abeta的42氨基酸形式(Abeta42)的CSF水平降低且总tau的CSF水平增高。此外，对于APP基因中的可用于鉴定具有AD患病风险的 受试者的突变，存在已知的遗传标记物。参见例如，Goate等人,Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease,Nature,349,704-706,1991，其引入本文以供参考。在实施方式中，可以采用任何已知的诊断或预后方法来鉴定患有阿尔茨海默病或存在阿尔茨海默病患病风险的受试者。
包括σ-2受体拮抗剂的药物组合物
通过本发明识别的σ-2受体拮抗剂化合物、抗体或片段可以以药物组合物的形式施用。这些组合物可以以制药领域公知的方式制备，且可以通过多种途径施用，取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。
因此，本发明的另一实施方式包括药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的赋形剂或稀释剂以及治疗有效量的本发明的σ-2受体拮抗剂化合物(包括其对映异构体、非对映体、N-氧化物或药学上可接受的盐)。
尽管化合物可以作为散装物质(bulk substance)施用，但优选以药物制剂提供活性成分，例如，其中活性剂与药学上可接受的载体混合，该药学上可接受的载体关于既定的给药途径和标准的制药实践进行选择。
因此，一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括任何上式的至少一种化合物、抗体或片段，以及以上描述为σ-2受体拮抗剂的其它化合物，或其药学上可接受的衍生物(例如盐或溶剂化物)，以及任选地，药学上可接受的载体。具体地，本发明提供一种药物组全物，其包括治疗有效量的任何上式的至少一种化合物或其药学上可接受的衍生物，以及任选地，药学上可接受的载体。
包括本发明化合物的药物组合物
本发明的化合物或组合物(例如σ-2拮抗剂)可以以药物组合物的形式施用。这些组合物可以以制药领域公知的方式制备，且可以通过多种途径施用，取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。
因此，本发明的另一实施方式包括一种药物组合物，其包括药学上可接受的赋形剂或稀释剂以及治疗有效量的本发明化合物或其对映异构体、非对映体、N-氧化物或药学上可接受的盐。
尽管化合物可以作为散装物质(bulk substance)施用，但优选以药物制剂提供活性成分，例如，其中活性剂与药学上可接受的载体混合，该药学上可接受的载体关于既定的给药途径和标准的制药实践进行选择。
因此，一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括式I或II的至少一种化合物或其药学上可接受的衍生物(例如盐或溶剂化物)，以及任选地，药学上可接受的载体。具体地，本发明提供一种药物组全物，其包括治疗有效量的式I的至少一种化合物或其药学上可接受的衍生物，以及任选地，药学上可接受的载体。
当组合到同一制剂中时，应理解，两种化合物须稳定且互相相容以及与制剂的其它组分相容。当单独配制时，它们可以以任何便利的制剂提供，便利的是以本领域中对于这样的化合物为已知的方式。
本发明的化合物可以配制成以用于人或兽药的任何便利方式施用，因此本发明的范围内包括含有适用于人或兽药的本发明化合物的药物组合物。这样的组合物可以借助一种或多种合适载体以常规方式进行使用。用于治疗用途的可接受的载体在制药领域内公知，且描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)。选择药物载体可以关于既定的给药途径和标准的制药实践进行选择。除载体之外，药物组合物还可以包括任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、涂覆剂和/或增溶剂。
可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料以及甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、抗坏血酸和对羟基苯甲酸酯。还可使用抗氧化剂和助悬剂。
本发明的化合物可以使用已知的研磨步骤例如湿磨进行研磨，以得到适合于片剂形成和其他制剂类型的粒径。本发明化合物的细分(纳米颗粒)制剂可以通过本领域中已知的方法来制备，例如参见WO02/00196(SmithKline Beecham)。
组合
对于本发明的组合物和方法，任何上式的化合物和以上描述为σ-2受体拮抗剂的其它化合物可以与其它治疗剂和/或活性剂组合使用。
在一些实施方式中，σ-2拮抗剂化合物可以与胆碱酯酶抑制剂、N- 甲基-D-天冬氨酸(NMDA)谷氨酸受体拮抗剂、β淀粉样蛋白特异抗体、β分泌酶1(BACE1，β位淀粉样蛋白前体蛋白切割酶1)抑制剂、肿瘤坏死因子α(TNFα)调节剂、静脉注射免疫球蛋白(IVIG)、或朊蛋白拮抗剂中的一种或多种结合。在一些实施方式中，σ-2受体拮抗剂与选自他克林(![]()
Sciel)，多奈哌齐(![]()
Pfizer)，利斯的明(![]()
Novartis)，或加兰他敏(![]()
Ortho-McNeil-Janssen)的胆碱酯酶抑制剂结合。在一些实施方式中，σ-2受体拮抗剂与作为髓周依那西普(![]()
Amgen/Pfizer)的TNFα调节剂组合。在一些实施方式中，σ-2受体拮抗剂与选自巴匹珠单克隆抗体(Pfizer)、茄尼醇单克隆抗体(Lilly)、PF-04360365(Pfizer)、GSK933776(GlaxoSmithKline)、Gammagard(Baxter)或Octagam(Octapharma)的β淀粉样蛋白特异性抗体组合。在一些实施方式中，σ-2受体拮抗剂与作为美金刚(![]()
Forest)的NMDA受体拮抗剂组合。在一些实施方式中，BACE1抑制剂是MK-8931(Merck)。在一些实施方式中，σ-2受体拮抗剂与IVIG结合，如描述于Magga等人,J Neuroinflam2010,7:90,Human intravenous immunoglobulin provides protection against Ab toxicity by multiple mechanisms in a mouse model of Alzheimer's disease，以及Whaley等人,2011,Human Vaccines7:3,349-356,Emerging antibody products and Nicotiana manufacturing；其各自引入本文以供参考。在一些实施方式中，σ-2受体拮抗剂与朊蛋白拮抗剂结合，如公开于Strittmatter等人，US2010/0291090，其引入本文以供参考。
因此，另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括任何上式的至少一种化合物或其药学上可接受的衍生物、第二活性剂、以及任选地，药学上可接受的载体。
当组合到同一制剂中时，应理解，两种化合物、抗体或片段须稳定且互相相容以及与制剂的其它组分相容。当单独配制时，它们可以以任何便利的制剂提供，便利的是以本领域中对于这样的化合物为已知的方式。
给药途径和单位剂型
给药(输送)途径包括但不限于以下一种或多种：口服(例如作 为片剂、胶囊或作为可摄入的溶液)、局部、粘膜(例如作为吸入用鼻喷剂或气雾剂)、肠胃外(例如通过可注射形式)、胃肠、脊柱内、腹膜内、肌内、静脉内、脑室内、或其它储库(depot)施用等。
因此，本发明的组合物包括特别是配制用于给药模式的形式的组合物。在某些实施方式中，本发明的药物组合物配制成适用于口服输送的形式。例如，化合物CB和化合物CF是在动物模型中口服可生物利用且已在条件性恐惧模型中每天口服一次并显示功效的σ-2受体拮抗剂化合物，参见例如图9B。本文所述的口服可生物利用的化合物可以以口服制剂制备。在一些实施方式中，σ-2拮抗剂化合物是口服可生物利用的化合物，适于口服递送。在其它实施方式中，本发明的药物组合物配制成适用于肠胃外输送的形式。在一些实施方式中，σ-2受体拮抗剂化合物是其抗体或片段，其中抗体或片段配制成肠胃外组合物。
本发明的化合物可以配制成以用于人或兽药的任何便利方式施用，因此本发明的范围内包括含有适用于人或兽药的本发明化合物的药物组合物。这样的组合物可以借助一种或多种合适载体以常规方式进行使用。用于治疗用途的可接受的载体在制药领域内公知，且描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)。选择药物载体可以关于既定的给药途径和标准的制药实践进行选择。除载体之外，药物组合物还可以包括任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、涂覆剂和/或增溶剂。
根据不同的输送体系可以有不同的组成/配方要求。应理解，并不是所有的化合物都需要通过相同的途径施用。同样地，如果组合物包括多于一种活性组分，则这些组分可以通过不同途径施用。通过实例的方式，本发明的药物组合物可以配制成使用微型泵，或通过粘膜途径(例如作为吸入用鼻喷剂或气雾剂或者可摄入溶液)，或肠胃外(其中组合物配制成通过可注射形式例如通过静脉内、肌内或皮下途径进行输送)进行输送。或者，制剂可以设计成通过多个途径进行输送。
因为本发明的化合物穿过血脑屏障，因此它们可以以多种方法进行施用，包括，例如全身(例如通过iv、SC、口服、粘膜、经皮途径)或局部方法(例如颅内)。在本发明的化合物经由胃肠粘膜进行粘膜输送时，其应能够在经由胃肠道的运输过程中保持稳定；例如，其应耐 受蛋白降解，在酸pH下稳定，且耐受胆汁的净化(detergent)作用。例如，式I或II的化合物可以由肠溶包衣层包衣。肠溶包衣层材料可以分散或溶解于水或合适有机溶剂中。作为肠溶包衣层聚合物，可以单独或组合使用以下的一种或多种：例如甲基丙烯酸共聚物、邻苯二甲酸乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、乙酸纤维素偏苯三酸酯、羧甲基乙基纤维素、虫胶或其它合适的肠溶包衣层聚合物的溶液或分散体。由于环境原因，优选水性包衣工艺。在这样的水性工艺中，最优选甲基丙烯酸共聚物。
合适时，药物组合物可通过吸入，通过使用皮肤贴剂，以含有赋形剂如淀粉或乳糖的片剂形式或者单独或与赋形剂混合的胶囊或胚珠(ovule)形式或者含有调味剂或着色剂的酏剂、溶液或混悬液形式口服施用，或者它们可以经肠胃外注射，例如静脉内、肌内或皮下。对于颊(buccal)或舌下给药，组合物可以以片剂或锭剂的形式施用，其可以以常规方式进行配制。
在本发明的组合物经胃肠外施用时，这样的施用包括但不限于：静脉内、动脉内、鞘内、心室内、颅内、肌内或皮下施用本发明的化合物；和/或通过使用输注技术。
适用于注射或输注的药物组合物可以是无菌水溶液、分散液或无菌粉末形式，其含有(若需要则进行调整)用于这样的适用于输注或注射的无菌溶液或分散液制剂的活性成分。该制剂可任选地包入脂质体中。在所有情况下，最终制剂在制备和储存条件下须无菌、液态且稳定。为提高储存稳定性，这样的制剂还可含有防腐剂以防止微生物生长。对微生物作用的防止可通过添加各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类(paraben)、氯丁醇、或抗坏血酸。在很多情况下，推荐等渗物质例如糖、缓冲液和氯化钠，以保证与体液特别是血液相似的渗透压。对这样的可注射混合物的延长吸收可通过引入吸收延迟剂例如单硬脂酸铝或明胶来实现。
分散体可以在液体载体或中间体(例如甘油、液体聚乙二醇、三醋酸甘油及其混合物)中制备。液体载体或中间体可以是溶剂或液体分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇等)、 植物油、无毒性甘油酯及其合适混合物。合适的流动性可以通过生成脂质体、在分散液的情况下施用合适的粒径或通过添加表面活性剂来得到保持。
对于肠胃外施用，最好以无菌水溶液的形式使用化合物，该无菌水溶液可含有其它物质，例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。若需要，水溶液应被适当缓冲(优选到3～9的pH)。在无菌条件下制备合适的肠胃外制剂可通过本领域技术人员熟知的标准制药技术来容易地完成。
无菌注射液可以通过使式I的化合物与合适的溶剂以及一种或多种前述载体混合，随后无菌过滤来制备。在适用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，制备方法优选包括在真空下干燥以及冻干，这提供醛固酮受体拮抗剂和所需赋形剂的粉状混合物以便随后制备无菌溶液。
根据本发明的化合物可以配制成通过注射(例如通过静脉内推注或输注或经肌内、皮下或鞘内途径)用于人或兽药且可以以单位剂型提供于安剖瓶中或其他单位剂量的容器或多剂量容器中，若需要添加防腐剂。注射用组合物可以是混悬液、溶液或乳液的形式，处于油性或水性媒介物中，且可以含有配制剂例如助悬剂、稳定剂、增溶剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是用于在使用前与合适的媒介物例如无菌无热原的水重构的无菌粉末形式。
本发明的化合物可以以片剂、胶囊、胚珠(ovules)、酏剂、溶液或混悬液的形式施用，用于速释、延释、调释、缓释、脉冲释放或控释应用。
本发明的化合物还可以以适用于口服或颊服的形式提供供人或兽医使用，例如以溶液、凝胶、糖浆或混悬液形式，或在使用前与水或其它合适的媒介物重构的干燥粉末形式。还可以使用固体组合物例如片剂、胶囊、锭剂、软锭剂、丸剂、大丸剂、粉末、糊剂、颗粒、药筒(bullet)或预混制剂。用于口服用途的固体和液体组合物可以根据领域内熟知的方法制备。这样的组合物还可以含有固体或液体形式的一种或多种药学上可接受的载体和赋形剂。
片剂可含有赋形剂例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、 二碱式磷酸钙和甘氨酸，崩解剂例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐，以及制粒粘合剂例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。
另外，可以包括润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
组合物可以口服施用，以速释或控释的片剂、微粒、微型片剂、胶囊、袋(sachet)、以及口服溶液或混悬液、用于其制备的粉末的形式。口服制剂可以任选地包括各种标准的制药载体和赋形剂，例如粘合剂、填充剂、缓冲剂、润滑剂、助流剂、染料、崩解剂、增味剂(odorant)、甜味剂、表面活性剂、脱模剂、防附着剂和包衣。
一些赋形剂在组合物中可以具有多种作用，例如同时起粘合剂和崩解剂的作用。
可用于本发明的口服组合物的药学上可接受的崩解剂的实例包括但不限于淀粉、预糊化淀粉、羟基乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、藻酸盐、树脂、表面活性剂、泡腾组合物、水性硅酸铝和交联聚乙烯吡咯烷酮。
本文可用的口服组合物的药学上可接受的粘合剂的实例包括但不限于，阿拉伯胶；纤维素衍生物，例如甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟丙基纤维素、或羟乙基纤维素；明胶、葡萄糖、右旋糖、木糖醇、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、淀粉、预糊化淀粉、黄蓍胶、黄嘌呤树脂、藻酸盐、镁铝硅酸盐、聚乙二醇或膨润土。
口服组合物的药学上可接受的填充剂的实例包括但不限于，乳糖、脱水乳糖(anhydrolactose)、乳糖单水合物、蔗糖、右旋糖、甘露糖醇、山梨醇、淀粉、纤维素(特别是微晶纤维素)、磷酸二氢钙或脱水磷酸钙、碳酸钙和硫酸钙。
可用于本发明的组合物的药学上可接受的润滑剂的实例包括但不限于，硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、环氧乙烷的聚合物、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁、油酸钠、硬脂酰富马酸钠、和胶体二氧化硅。
口服组合物的药学上可接受的合适增味剂的实例包括但不限于， 合成香料和天然芳香油例如油、花、果(例如香蕉、苹果、酸樱桃、桃)以及其组合的提取物，以及类似的香料。它们的使用取决于很多因素，最重要的是将要服用该药物组合物的群体的感官可接受性。
口服组合物的药学上可接受的合适染料的实例包括但不限于合成和天然染料，例如二氧化钛、β-胡萝卜素和葡萄柚皮提取物。
通常用于促进吞咽、改变释放性质、改善外观和/或掩盖组合物的味道的用于口服组合物的药学上可接受的有用包衣的实例包括但不限于羟丙甲基纤维素、羟丙基纤维素和丙烯酸酯-甲基丙烯酸酯共聚物。
口服组合物的药学上可接受的甜味剂的合适实例包括但不限于阿斯巴甜、糖精、糖精钠、环己基氨基磺酸钠、木糖醇、甘露糖醇、山梨醇、乳糖和蔗糖。
药学上可接受的缓冲剂的合适实例包括但不限于，柠檬酸、柠檬酸钠、碳酸氢钠、二碱式磷酸钠、氧化镁、碳酸钙和氢氧化镁。
药学上可接受的表面活性剂的合适实例包括但不限于月桂基硫酸钠和聚山梨醇酯。
相似类型的固体组合物也可用作明胶胶囊中的填充剂。鉴于此，优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、奶糖或高分子量聚乙二醇。对于水性混悬液和/或酏剂，试剂可以与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料，与乳化剂和/或助悬剂，且与稀释剂例如水、乙醇、聚乙二醇和甘油，及其组合进行组合。
如所示，本发明的化合物可以经鼻内或通过吸入进行施用，且以干粉吸入剂或气雾喷雾剂形式从加压容器、泵、喷雾器或雾化器使用合适的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃例如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA134AT)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA227EA)、二氧化碳或其它合适的气体进行便利的输送。在加压气雾剂的情况下，可以通过设置输送计量的量的阀来确定剂量单位。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以含有活性化合物的溶液或混悬液，例如使用乙醇和抛射剂的混合物作为溶剂，其可额外含有润滑剂例如山梨醇三油酸酯。
用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如，由明胶制成)可以配制为含有化合物和合适粉末基底例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
对于通过吸入进行的局部施用，可以经雾化器输送用于人或兽药的本发明化合物。
本发明的药物组合物可以含有0.01～99wt％/v活性材料。对于局部施用，例如，组合物通常含有0.01-10％、更优选0.01-1％的活性材料。
化合物还可以以脂质体输送体系的形式进行施用，例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由多种磷脂例如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱形成。
本发明的药物组合物或单位剂型可以根据通过鉴于以上指导而进行的常规测试所限定的剂量和施用方案来进行施用，以便获得最佳活性，同时使对于特定患者的毒性或副作用最小化。然而，治疗方案的这样的微调鉴于本文所给出的指导是常规的。
本发明化合物的剂量可以根据多种因素变化，例如潜在的疾病状态，个体的状态、体重、性别和年龄，以及给药模式。用于治疗病症的有效量可以通过本领域普通技术人员已知的经验方法来容易地确定，例如通过建立剂量和施用频率的矩阵并比较矩阵中各点处的一组实验单元或受试者。施用于患者的精确量会根据病症的状态和严重程度以及患者的身体状态而变化。任何症状或参数的可测量的改善可以通过本领域技术人员确定或通过患者向医师报告。应理解，尿道病症的任何症状或参数的任何临床或统计学显著的减轻或改善都在本发明的范围内。临床显著的减轻或改善是指对于患者和/或医师可感知。
待施用的化合物的量的范围可以为约0.01至约25mg/kg/天，通常约0.1～约10mg/kg/天，且最通常约0.2～约5mg/kg/天。应理解，本发明的药物制剂并不必然需要含有可有效治疗病症的全部量的化合物，因为这样的有效量可以通过施用多个分开剂量的这样的药物制剂来达到。
在本发明的优选实施方式中，化合物I配制成胶囊或片剂，通常含有10～200mg本发明的化合物，且优选以10～300mg、优选20～150mg且更优选约50mg的每日总剂量施用给患者。
用于肠胃外给药的药物组合物基于100wt％的总药物组合物含有约0.01wt％至约100wt％的本发明的活性化合物。
通常，经皮剂型相对于100wt％的总剂型含有约0.01wt％至约100 wt％的活性化合物。
药物组合物或单位剂型可以以单个日剂量施用，或者总的日剂量可以以分开剂量施用。另外，共同施用或相继施用用于治疗病症的另一化合物可以是理想的。为此目的，组合的活性成分配制到简单的剂量单位中。
本发明化合物的合成
式I、II和VIII的化合物及其对映异构体、非对映体、N-氧化物和药学上可接受的盐可以通过下文概述的一般方法来制备，该方法构成本发明的又一方面。在以下描述中，R基团具有针对上述各式的化合物所限定的含义，除非另外说明。
本领域技术人员应理解，理想的是使用化合物I的制备中所使用的中间体的受保护衍生物。官能团的保护和去保护可以通过领域内已知的方法进行(参见例如，Green and Wuts Protective Groups in Organic Synthesis.John Wiley and Sons,New York,1999)。羟基或氨基可以用任何羟基或氨基保护基团进行保护。氨基保护基团可以通过常规技术移除。例如，酰基，例如烷酰基、烷氧基羰基和芳酰基，可以通过溶剂分解作用例如通过酸性或碱性条件下的水解来移除。芳基甲氧羰基(例如苄氧羰基)可以在催化剂例如钯炭催化剂(palladium-on-charcoal)的存在下通过氢解作用来切割。
目标化合物的合成通过使用本领域技术人员熟知的标准技术移除任何可存在于倒数第二个中间体的保护基来完成。然后使用标准技术例如硅胶层析、硅胶上的HPLC等，或通过重结晶来按需纯化去保护的终产物。上述化合物可以经任何合成路线来合成。例如，可以通过以下方案(方案1)来制备化合物。
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该方案可以产生本文描述的类似物的外消旋混合物。
另外的R1基团还可以用于产生其它类似物。
在一些实施方式中，不对称地进行合成，以便产生一个类似物的基本上纯或纯的对映异构体。在一些实施方式中，本文所述化合物的不对称合成根据方案2(*表示手性中心)制备：
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在一些实施方式中，本文所述化合物的不对称合成根据方案3(*表示手性中心)制备：
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合成方案可以根据所需的终产物而改变。“R”基团是例示性的且可以被本文所述的任何取代基取代。
在一些实施方式中，式I和II的某些化合物例如通过方案4所示的对映选择性路线制备。
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在一些实施方式中，σ-2拮抗剂是式VIII的化合物。式VIII的某些化合物可以通过相应酮中间体的还原氨化来制备，例如通过方案5所示的代表性路线。
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工作例和合成例
实施例1和2描述了可用于例如本文所述的实验的Abeta寡聚体制剂。用于膜运输和寡聚体结合/突触减少检定的具体制剂以及用于下面所述的体内检定的具体制剂各自在其所属的实施例中进行描述。
实施例1：β淀粉样蛋白寡聚体的制备
β淀粉样蛋白在神经组织中可以寡聚的条件，一种水性可溶蛋白经其可缔合的环境被再创造以识别β淀粉样蛋白寡聚体和原纤维的更多疾病相关的结构状态。水性可溶蛋白从大鼠大脑通过超速离心制备。具体地，将5体积TBS缓冲液(20mM Tris-HCL，pH7.5，34mM NaCl)和完整的蛋白酶抑制剂混合物(Santa Cruz)(/每克大脑组织)添加到冰上的大鼠大脑组织。然后使用紧定杵(tight-fitting pestle)进行Dounce 均化。然后以150,000x g在4℃对均化的大脑组织离心1小时(40,000rpm Ty65)。次层清液(infranatant，在漂浮的髓磷脂之间，在球粒之上半厘米)然后被移除，并在-75℃冷冻等分试样。然后将球粒于TBS中重悬至原始体积，然后在-75℃等份冷冻。将合成的单体的人β淀粉样蛋白1-42添加到该混合物以提供终浓度1.5uM的β淀粉样蛋白，并且将溶液在4℃孵育24小时。以5,800g对混合物进行10分钟离心，以移除纤维状组装体，然后在4℃使用6E10结合的琼脂糖离心柱(Pierce Chemical Company)进行免疫沉淀24小时。然后将洗脱的β淀粉样蛋白寡聚体进行MALDI-Tof质谱分析，以识别样品的含量，图1。
β淀粉样蛋白在含蛋白溶液中自缔合以形成22,599Da的5亚单位五聚体和31,950Da的7亚单位7聚体的亚单位组装体。49,291Da处的另一峰可表示12亚单位12聚体，尽管这不会显示为β淀粉样蛋白12聚物的精确分子量。明显地，在代表β淀粉样蛋白单体和二聚体的 4518Da或9036Da处未观察到峰。然而，9,882Da和14,731Da处的峰可分别表示与786Da(或2x393Da)脂质或蛋白缔合的β淀粉样蛋白二聚体以及与3x393Da脂质或蛋白缔合的β淀粉样蛋白三聚体。此外，19,686Da处的峰的存在指示出可能涉及到三聚体复合物和4954Da的大鼠β淀粉样蛋白片段的组装状态。因此，这些数据可以反映小脂质或蛋白与β淀粉样蛋白的二聚体和三聚体的缔合，这可能指导生理学体系独特的构象状态的组装。
实施例2：β淀粉样蛋白寡聚体的制备
如实施例1中所述将1.5uM单体人β淀粉样蛋白1-42于大鼠大脑可溶蛋白的混合物中的溶液在4℃孵育24小时。然后在进行光谱之前用三氟乙醇(TFE)处理该溶液。在TFE中，组装的蛋白结构和非共价结合的蛋白复合物解离为变性蛋白，且预期与组装的寡聚体相关的峰消失。大多数在实施例1中观察到的蛋白峰消失，包括如上识别的9822Da、14,731Da、31,950Da和49,291Da峰。然而，在4518Da观察到高丰度峰，其表示β淀粉样蛋白单体峰。4954.7处的峰很明显，其可表示与β淀粉样蛋白1-46相似的较长的Abeta片段。在7086Da观察到额外的峰，其在实施例1描述的制备中不存在，可能代表与2550Da共价结合的蛋白相缔合的β淀粉样蛋白单体。
实施例3：本发明的检定中采用的方法
TBS可溶提取物：经组织病理学分析特征为Braak Stage V/VI阿尔茨海默病(AD)的人患者的死后脑组织的样品得自Rhode Island Hospital脑组织库。年龄和性别匹配的AD和正常组织样本稀释到含有1mM EDTA和1mg/ml完整蛋白酶抑制剂混合物(Sigma P8340)的20mM Tris-HCL，137mM NaCl，pH7.6中0.15gm组织/ml，且均化。在Beckman Optima XL-80K超速离心器中以105,000g对组织匀浆进行超速离心1小时。将所得的TBS可溶部分使用蛋白-A和蛋白-G琼脂糖柱(Pierce Chemical)免疫耗竭，然后用Amicon Ultra3，10&100kDa NMWCO过滤器(Millipore Corporation)进行大小分级。
免疫沉淀：将大小分级且免疫耗竭的TBS可溶提取物在合适的NMWCO Amicon Ultra过滤器中浓缩到约200ul。将浓缩的TBS可溶提取物用TBS样品缓冲液(Pierce Chemical)稀释到400ul，并以5,800 g离心10分钟以移除原纤维。然后将所得的上清液用6E10-结合的琼脂糖珠在4℃免疫沉淀过夜，随后使用高渗强度Gentle洗脱缓冲液(Pierce Chemical)进行抗原洗脱以分离含有Abeta的蛋白种类。
MALDI-质谱：使用Applied Biosystems(ABI)Voyager DE-Pro MALDI-Tof仪器对免疫分离的β淀粉样蛋白进行质谱分析。基于分析的目标分子量范围，使用多种基质类型例如α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、芥子酸(SA)或6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)来分析样本。仪器以线性正离子模式以及可变提取延迟来运行。非累积谱表示每次获取的100次“热点”击中(shot)而累积谱表示每次获取的200激光击中中各次击中的12个分离区域。
数据分析：使用Voyager数据探测软件包来进行数据获取和分析。质谱的标准操作包括光谱的平滑和扣减基线功能以及信号噪音比的变化。
对Ab定量的ELISA：使用改进的夹心ELISA技术对免疫沉淀的TBS可溶部分分析“总”Abeta和Abeta寡聚体浓度。简单来说，将6E10和4G8涂覆的Nunc MaxiSorp96孔板用含有Abeta的样品进行孵育，然后用生物素化的4G8检测抗体进行探测。用链霉亲和素-HRP(Rockland)孵育，然后形成四甲基联苯胺(TMB)基质，允许在BioTEk Synergy HT读板仪上对Abeta进行比色检测(OD450)。使用单体Abeta1-42来产生标准曲线，并且连同GEN5软件一起实现对免疫沉淀的样品中的Abeta水平进行定量。[什么被认为是可接受的？]
实施例4：受体结合检定
化合物II与数种受体通过阻断其激动剂或拮抗剂的结合或作用而相互作用。测试化合物II以观察其是否与已知的细胞受体或细胞信号蛋白直接相互作用。测试化合物II(10μΜ)对给定人受体的已知激动剂或拮抗剂的结合的取代能力，该人受体在细胞系中过表达或从组织中分离。还测试其阻断由给定人受体的激动剂或拮抗剂所诱导的下游细胞信号传导的能力。测试化合物II在100个已知受体处的作用，并且化合物II仅在这些受体中的5个处显示出活性>50％(检定窗)(表A)。这表明化合物II仅在小子集的CNS相关受体处具有高度特异性和活性。其以最高亲和性结合σ-2受体，因此是σ-2配体。
表A.化合物II(10uM)对已知受体结合的抑制％对照抑制SEM％对照
σ-2(激动剂放射性配体)890.6
mu(MOP)(h)(激动剂放射性配体)601.4
Na+通道(位点2)(拮抗剂放射性配体)544.7
D3(h)(激动剂作用)664.0
α1A(h)(拮抗剂作用)561.1
使用相同的方案，测试表2(以下)的化合物对σ-2受体的识别。结果证实与化合物II结构相似的这些化合物的确是σ-2配体，即优先与σ-2受体结合。
竞争性放射性配体结合检定
通过商业合同研究组织进行σ-1受体和σ-2受体的放射性配体结合检定。对于σ-1结合，使用测试化合物从100uM至1nM的各个浓度，来取代来自Jurkat细胞膜上的内源性受体的8nM[3H](+)喷他佐辛(Ganapathy ME等人，1991,J Pharmacol.Exp.Ther.289:251-260)。使用10uM氟哌啶醇来确定非特异结合。对于σ-2受体，在存在300nM(+)喷他佐辛掩盖σ-1受体的情况下，使用测试化合物从100uM至1nM的各个浓度，来取代来自大鼠大脑皮质的膜上的内源性受体的5nM[3H]1,3-二-(2-甲苯基)胍(Bowen WD等人，1993,Mol.Neuropharmcol3:117-126)。使用10uM氟哌啶醇来确定非特异结合。使用Brandel12R细胞收集器，通过经Whatman GF/C过滤器的快滤来终止反应，随后用冰冷的缓冲液洗涤两次。使用液体闪烁分析仪(Tri-Carb2900TR；PerkinElmer Life and Analytical Sciences)来测量干燥滤片上的放射性。绘制取代曲线，并且使用GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA)来确定测试配体对受体亚型的Ki值。通过将总结合(每分钟衰变数)与非特异结合(每分钟衰变数)之间的差除以总结合(每分钟衰变数)来确定特异结合百分比。
对于参考化合物，对σ-1和σ-2受体的亲和性从使用脑组织匀浆的公开研究中得到，其中用[3H](+)喷他佐辛测量σ-1受体处的取代，且用[3H]1,3-二-(2-甲苯基)胍在300nM(+)喷他佐辛的存在下测量σ-2受体处的取代。
结果显示于表2中。
表2σ-2和σ-1受体亲和性
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竞争性放射性配体结合检定2
候选σ-2配体化合物在σ-1和σ-2受体处的亲和性还通过对不同的已知的标记σ-2或σ-1配体的取代来确定。过滤检定根据之前公开的步骤(Xu等人，2005)进行。将测试化合物溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)或乙醇中，然后在含有150mM NaCl和100mM EDTA的50mM Tris-HCl pH7.4缓冲液中稀释。由豚鼠大脑制备用于σ-1结合检定的膜匀浆且由大鼠肝脏制备用于σ-2结合检定的膜匀浆。用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释膜匀浆，并在25℃在96孔板中在150uL的总体积中与浓度范围为0.1nM至10uM的放射性配体和测试化合物进行孵育。在孵育完成之后，使用96通道移液管(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)通过添加150uL冰冷的洗涤缓冲液(10mM Tris HCI，150mM NaCl，pH7.4)来终止反应，收集样品并通过已用100uL的50mM Tris-HCl缓冲液预浸的96孔纤维玻璃滤板(Millipore,Billerica,MA)迅速过滤。将各个过滤器用200uL的冰冷洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)洗涤四次。使用Wallac1450MicroBeta液体闪烁计数仪(Perkin Elmer,Boston,MA)来对结合放射性进行定量。
使用豚鼠大脑膜匀浆(～300ug蛋白)和～5nM[3H](+)-喷他佐辛(34.9Ci/mmol，Perkin Elmer,Boston,MA)进行σ-1受体结合检定，孵育时间在室温为90min。非特异结合根据含有10μΜ的冷氟哌啶醇的样品确定。
使用大鼠肝脏膜匀浆(～300ug蛋白)和仅～2nMσ-2高度选择性的放射性配体[3H]RHM-1(无其它阻断剂)(America Radiolabeled Chemicals Inc.St.Louis,MO)、～10nM[3H]DTG(58.1Ci/mmol,Perkin Elmer,Boston,MA)或～10nM[3H]氟哌啶醇(America Radiolabeled Chemicals Inc.,St.Louis,MO)在阻断σ-1位点的1uM(+)-喷他佐辛的存在下进行σ-2受体结合检定，孵育时间在室温对于[3H]RHM-1为6分钟，对于[3H]DTG和[3H]氟哌啶醇为120min。非特异结合根据含有10μΜ的冷氟哌啶醇的样品确定。
使用非线性回归分析对来自竞争性抑制实验的数据建模，以确定抑制放射性配体的特异结合的50％的抑制剂浓度(IC50值)。结合亲和性Ki值使用Cheng和Prusoff的方法进行计算。豚鼠大脑中用于[3H](+)-喷他佐辛的Kd值为7.89nM，大鼠肝脏中用于[3H]RHM-1和[3H]DTG的Kd值分别为0.66nM和30.73nM。使用标准化合物氟哌啶醇以保证质量。化合物IXa、IXb和化合物II在σ-1和σ-2受体处的亲和性数据显示于表3中。因此，可以采用本领域已知的任何σ-2受体结合检定来确定候选化合物的Ki或IC50。
表3.竞争性放射性配体结合检定2中候选σ-2配体的σ-2和σ-1受体亲和性
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实施例5：转基因小鼠中的记忆丧失：Morris游泳测试
测试化合物II以确定其是否可逆转阿尔茨海默病的较老转基因小鼠模型(其中寡聚体随着年龄堆积)中所见的记忆丧失。对于该研究，选择在鼠Thy-1启动子的控制下表达人APP751Swedish(670/671)和London(717)突变的hAPP小鼠。这些小鼠的Abeta量表现出年龄依赖的增加，且在3-6个月开始形成斑，且在8个月年龄时表现出确立的认知障碍。在该研究中，不是防止出现障碍，而是治疗已确立的障碍。这些研究按照不知道实验条件的科学家的服务合同而进行。在8个月大的雌性小鼠中经皮下微型泵将化合物以0.5和0.1mg/kg/天输注一个 月，并且在Morris水迷宫(一种海马类空间学习和记忆的测试)中测试认知表现。该小鼠模型不表现神经元丧失，因此记忆的恢复不能归因于凋亡的避免。
将游泳速度作为Morris测量的一部分进行分析，以确定是否存在任何的运动或动机缺陷。媒介物是5％DMSO/5％Solutol、90％盐水混合物。经低剂量(0.1mg/kg/天)和高剂量(0.5mg/kg/天)的化合物处理转基因动物。确定连续四天中的每天所进行的三个每日试验的平均值。可检测到没有显著的运动缺陷或任何种类的异常行为，且在研究的过程中仅损失了转基因媒介物组的一只动物，低于在该年龄预期的死亡水平。另外，我们维持有定期抽血以监测化合物的血浆水平的哨兵(sentinel)动物组，且这些显示在初步PK研究中所见的血浆水平几乎没有改变。
进行Morris水迷宫测试的逃避潜伏期测量。在测试的第二天，观察到野生型与转基因动物之间的显著差异，野生型学得比转基因型更快。这天，还观察到较高化合物剂量vs媒介物在转基因表现上有显著改善。因此，得到结论以0.5mg/kg/天施用的化合物II能够改善AD转基因模型中的认知表现。
Abeta42寡聚体引起突触数目降低18％；该丧失的100％被化合物II及其对映体消除。与化合物II相似，数个其它σ-2受体拮抗剂也阻抑突触丧失。已知的现有技术σ-2受体配体NE-100和氟哌啶醇完全消除突触丧失，而作为选择性σ-1配体的SM-21在消除突触丧失中仅具有较弱活性(20％恢复)。
也使用类似检定对化合物IXa和IXb的混合物进行测试。化合物IXa和IXb的混合物(1mg/kg/天，N＝8或10mg/kg/天，N＝8)或媒介物(5％DMSO/5％Solutol/90％盐水，N＝15)经皮下给药(Alzet微型泵)全身性施用至9月龄雄性hAPPSL转基因小鼠(N＝8)或非转基因同窝仔(N＝6)，持续20天，并且在Morris水迷宫中评价这些小鼠的空间学习和记忆。在治疗的最后四天，以3次试验/天测试小鼠寻找隐蔽平台。计算机化的跟踪系统自动对逃避潜伏期或游泳长度进行定量。
在测试的任一天，转基因动物vs.非转基因动物的表现中均没有显著差异(分析限于这2组；重复测量的双因素(基因型和时间)ANOVA， 随后进行Bonferroni事后检验)。限于转基因组(处理和时间)的相似分析显示，经10mg/kg/天的化合物IXa和IXb的混合物处理的转基因动物比经媒介物处理的转基因动物在测试的第二和第四天表现得显著更好(p<0.05，经student t检验分析)。非转基因的媒介物处理的动物比转基因的媒介物处理的动物在测试的第一和第二天表现得显著更好。用化合物IXa和IXb的混合物进行处理与媒介物处理相比在测试的第一天(两种剂量)、第二天(10mg/kg/天剂量)和第四天(10mg/kg/天剂量)显著改善转基因动物表现(p<0.05；游泳长度)。
这表明，化合物IXa和IXb的混合物能够以剂量依赖的方式在老龄转基因动物中逆转学习记忆中的已建立的行为缺陷。
基于化合物II的结果、化合物间的结构相似性和本文公开的本发明化合物是σ-2配体且在膜运输检定中具有或预期具有活性且在寡聚体结合和突触减少检定中具有或预期具有活性的事实，预期式I和II内的化合物在该记忆丧失测试中相似地起作用。类似地，预期式VIII的化合物会与化合物IXa和IXb相似地起作用。
实施例6：在膜运输检定中抑制Abeta寡聚体对神经元细胞的作用
测试以上表2的σ-2配体抑制β淀粉样蛋白对细胞的效应的能力。如通过膜运输检定所测量，σ-2配体能够抑制β淀粉样蛋白效应。结果显示于下表5。该检定的原理如下：
由于突触和记忆缺陷而非广泛的细胞死亡在阿尔茨海默病的最早阶段占主导地位，测量这些变化的检定尤其适合发现寡聚体活性的小分子抑制剂。MTT检定多被用作培养物中毒性的测量方式。黄色四唑盐被细胞内吞，且在内体通路中被还原为不溶紫色甲臜。紫色甲臜的水平反映出培养物中的活性代谢细胞的数量，并且甲臜量的减少被视为对培养物中细胞死亡或代谢毒性的衡量。当通过显微镜观察时，首先在填充细胞的胞内囊泡中可见紫色甲臜。随着时间的推移，囊泡被胞吐，并且当不可溶甲臜暴露于水性介质环境时，甲臜在质膜外表面上沉淀为针状结晶。Liu和Schubert('97)发现，细胞通过选择性加速还原甲臜的胞吐速率来应答亚致死水平的Abeta寡聚体，而不影响内吞速率。发明人已在培养的成熟初级神经元中重复了这些观察，并通过自动显微镜术和成像处理对这些形态变化进行了定量。在这些情况 下，还原甲臜的总量没有总体改变，仅仅是反映其形成和/或从细胞中排出的速率变化的形态学具有变化。发明人已证实先前的发现，即该检定对不引起细胞死亡的低水平寡聚体敏感(Liu和Schubert’04,Hong等人,’07)。确实，引起LTP抑制的低量寡聚体不导致细胞死亡(Tong等人,’04)，且预期不改变培养物中(或脑片中)的甲臜的总量。
其他研究者举出的证据表明，经膜运输介导的神经元表面受体表达中由Abeta寡聚体介导的减少是突触可塑性(LTP)以及因此的学习和记忆的电生理学测量的寡聚体抑制的基础(Kamenetz等人，’03，Hseih等人，’06)。经甲臜形态学变化测量由寡聚体诱导的膜运输速率变化已被用于细胞系中，以发现阻抑Abeta寡聚体的药物(Maezawa et al.,'06,Liu and Schubert'97,'04,'06,Rana等人,'09,Hong等人,’08)，其在体内降低啮齿动物的Abeta脑水平(Hong等人,'09)。用于胞吐检定/MTT检定的相似步骤可以在文献中找到。参见例如Liu Y等人,Detecting bioactive amyloid beta peptide species in Alzheimer's disease.J Neurochem.2004Nov；91(3):648-56；Liu Y和Schubert D."Cytotoxic amyloid peptides inhibit cellular3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)reduction by enhancing MTT formazan exocytosis."J Neurochem.1997Dec；69(6):2285-93；以及Liu Y和Schubert D."Treating Alzheimer's disease by inactivating bioactive amyloid beta peptide"Curr.Alzheimer Res.2006Apr；3(2):129-35。因此，该方法是有效的。
本发明的胞吐检定适用于在体外生长3周的成熟初级神经元培养物。参见WO/2011/106785，以其全部引入本文以供参考。如经使用Cellomics VTI自动化显微镜系统通过图像处理所测量，Abeta寡聚体导致填充有还原紫色甲臜的胞内囊泡(点(puncta))量呈剂量依赖性的减少。将例如图1A(暴露于单独的媒介物的培养神经元细胞的显微照片，显示填充有甲臜的囊泡)与图1B(暴露于媒介物+Abeta寡聚体的神经元细胞的显微照片，显示显著较少的填充有甲臜的囊泡，反而具有在遇到胞内环境时析出为晶体的胞吐甲臜)进行比较。增加Abeta寡聚体的量最终导致明显的毒性。因此，用于检定中的神经活性Abeta寡聚体的浓度比导致细胞死亡的浓度低得多。发明人通过示出Abeta 寡聚体的效应在添加抗Abeta抗体时被阻断但仅抗体自身无效应(数据未示出)，证实该检定是有效的。当以这种方式配置时，检定能够检测阻抑Abeta寡聚体的非致死效应的化合物是否通过破坏寡聚体、抑制寡聚体结合神经元、或对抗由寡聚体结合引发的作用的信号传导机制来起作用。
用于产生结果的方法如下示于膜运输/胞吐(MTT)检定。
对来自E18Sprague-Dawley大鼠胚胎的初级海马神经元以优化浓度在384孔板中在NB介质(Invitrogen)中进行铺板。将神经元保持在培养物中3周，每周供应两次具有N2补充物(Invitrogen)的NB介质。这些神经元在成熟脑中表达神经元特有的突触蛋白的全补体，并表现出活性依赖的电信号传导的复杂网络。这样的培养物中的神经元和神经胶质具有表现出与完整脑回路优异配准的分子信号网络，为此已被用作学习和记忆的模型体系多于20年(参见例如Kaech S,Banker G.Culturing hippocampal neurons.Nat Protoc.2006；1(5):2406-15.Epub2007Jan11；还参见Craig AM,Graf ER,Linhoff MW.How to build a central synapse:clues from cell culture.Trends Neurosci.2006Jan；29(l):8-20.Epub2005Dec7.Review)。
以范围为100uM至0.001nM的浓度向细胞添加测试化合物，随后添加媒介物或Abeta寡聚体制剂(3μΜ总Abeta蛋白浓度)，并将其在37℃在5％CO2中孵育1～24hr。将MTT试剂(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5二苯基溴化四唑)(Roche Molecular Biochemicals)在磷酸盐缓冲盐水中重构为5mg/mL。将10μL MTT标记试剂添加到各孔中并在37℃孵育1h，然后成像。通过自动显微术和图像处理评价胞吐，以对胞吞和胞吐的甲臜的量进行定量。
将各个检定板板式设置为在各个板上在具有和不具有Abeta寡聚体的情况下测试化合物。该设计消除筛选级联早期的毒性或代谢活性的化合物(在初步筛选的水平)。首先在胞内囊泡中可见还原的甲臜。最终的甲臜胞吐经Abeta寡聚体加速。图1A和1B是神经元的显微照片的实例，第一个是先看见甲臜的胞内囊泡，且第二个是覆盖有经胞吐挤出的不溶紫色染料的神经元。染料在培养物的水性环境中沉淀且在神经元的表面上形成针状结晶。
在15微摩尔化合物II的存在下，图1B中拍摄的膜运输变化被阻抑(参见图1C)且图1C中的细胞与经媒介物处理的神经元不可区分。而且，化合物II的该作用看似与化合物II是在细胞暴露于Abeta寡聚体之前或之后添加无关，这表明治疗以及预防效果。参见图1D，膜运输变化的图(剂量应答曲线)表示为，在添加多种含量的化合物II或IXa与IXb的混合物之前(图1D)或之后(图1E)添加的多种含量的Abeta寡聚体的存在下，在图像处理中见到的囊泡百分比vs.log(化合物II浓度)。单独的Abeta寡聚体由图1D和1E的左下角的圆圈表示。单独的媒介物由填充的正方形表示。当在寡聚体之前添加时(预防模式)，化合物II以EC50＝2.2uM阻抑寡聚体效应，且化合物IXa、IXb以EC50＝4.9uM阻抑寡聚体效应。当在寡聚体之后添加时(治疗模式)，化合物II以EC50＝4.1uM阻抑寡聚体效应，且化合物IXa、IXb以EC50＝2.0uM阻抑寡聚体效应。在任一种情况中，化合物II或IXa与IXb的混合物各自阻抑该检定中所见的Abeta寡聚体的膜运输效应。上升剂量的来自两个结构不同的系列(II和IXa、IXb)的选择性、高亲和性σ-2受体拮抗剂化合物阻止寡聚体效应，且使培养物看起来更像经媒介物处理的培养物。
图1E是在不同量的化合物II(0由菱形表示，1.1uM由下三角表示，3.2uM由上三角表示且9.7uM由填充的正方形表示)的存在下，填充有甲臜的囊泡百分比相对于Abeta浓度的相似剂量响应曲线。所得曲线针对增加量的化合物II向右移动，表明Abeta寡聚体和化合物II对相同目标存在竞争，该目标介导由Abeta寡聚体在该检定中引起的膜运输变化。增加量的化合物II降低Abeta寡聚体的明显效力(因此降低其毒性)，本发明的发明人相信该结果在本发明之前未被显示过。确实，基于这些结果，对抗Abeta寡聚体毒性的化合物例如本发明的化合物有希望作为淀粉样蛋白毒性相关的认知衰退(例如阿尔茨海默病中所见)的治疗和(在非常早的阶段)预防方式。
如图1F和1G中所见，在膜运输检定中用合成Abeta寡聚体进行给药，其显示出820nM的EC50。各个浓度的Abeta针对各个选择性高亲和性σ-2受体拮抗剂化合物药物候选物II和IXa、IXb的数种浓度(其各自引起EC50向右移动几乎两个数量级)进行测试。当将数据拟合到 经典的线性和非线性模型时，数据经Schild分析(斜率nH为1)成线性，这表明σ-2受体化合物表现出寡聚体与化合物之间针对介导膜运输的靶标的真实药理学竞争。对抗这些化合物给药源自阿尔茨海默病患者大脑的Abeta寡聚体，如图1J和1K中所示，也通过化合物暴露而显示出右移。具体地，在有效剂量下，化合物II和IXa、IXb表现出与合成寡聚体(图1F、G，Schild斜率＝-0.75，-0.51)和源自人阿尔茨海默病患者(图1J、1K)的寡聚体两者的药理学竞争。其净效应是这两种选择性高亲和性σ-2受体拮抗剂化合物候选药物有效地使Abeta寡聚体的突触毒性更小，且这些是目前为止我们所知的已证实该特征的仅有的疗法。不拘泥于理论，最简单可能的作用机制是σ-2受体化合物起到竞争性受体拮抗剂的作用。
在相关的实验中，基于0或20μΜ化合物II对映异构体的效应，观察到剂量响应曲线(％囊泡vs Abeta寡聚体浓度)向右移动：参见下表4。显示(+)对映异构体在更高浓度的Abeta寡聚体下更有效。
表4
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如以上表4所示，在较高浓度的Abeta寡聚体下，示为％囊泡针对Abeta寡聚体浓度的剂量应答曲线对于20uM对映异构体vs.0uM对映异构体(即，仅Abeta寡聚体)的右移在(+)对映异构体的情况下显著地更明显(也参见图1F和图1G)。
实验对照：
根据公开方法制备的Abeta1-42寡聚体被用作阳性对照。[参见例如Dahlgren等人,"Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability"J Biol Chem.2002Aug30；277(35):32046-53.Epub2002Jun10.；LeVine H3rd."Alzheimer's beta-peptide oligomer formation at physiologic concentrations"Anal Biochem.2004Dec l；335(l):81-90；Shrestha等人,"Amyloid beta peptide adversely affects spine number and motility in hippocampal neurons"Mol Cell Neurosci.2006Nov；33(3):274-82.Epub2006Sep8；Puzzo等人,"Amyloid-beta peptide inhibits activation of the nitric oxide/cGMP/cAMP-responsive element-binding protein pathway during hippocampal synaptic plasticity"J Neurosci.2005Jul20；25(29):6887-97；Barghorn等人,"Globular amyloid beta-peptide oligomer-a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease"J Neurochem.2005Nov；95(3):834-47.Epub2005Aug31；Johansson等人,Physiochemical characterization of the Alzheimer's disease-related peptides A beta1-42Arctic and A beta l-42wt.FEBS J.2006Jun；273(12):2618-30]以及源自大脑的Abeta寡聚体(参见例如Walsh等人,Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo.Nature(2002).416,535-539；Lesne等人,A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory.Nature.2006Mar16；440(7082):352-7；Shankar等人,Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory.Nat Med.2008Aug；14(8):837-42.Epub2008Jun22)。应注意，任何Abeta寡聚体制剂可以用于该检定或作为对照，包括以上引用的专利文献中描述的制剂，这些专利文献全部引入本文以供参考。
这在使用不同Abeta寡聚体制剂(特别包括从阿尔茨海默病患者的大脑中分离的寡聚体制剂)的膜运输检定中显示。尽管各种Abeta寡聚体制剂的效力不同(例如，天然阿尔茨海默病的分离物比任何所测试的合成制剂更有效力－数据未显示)，但结果在性质上相同：由寡聚体介导的病理学受化合物II以及因此本发明的其它化合物对抗。寡聚体在不使用洗涤剂的情况下从死后人海马或前额皮质分离，且以剂量依赖的方式以6pM的Kd抑制膜运输。源自人阿尔茨海默病患者的Abeta寡聚体(137pM，第二条，图1H)相比于媒介物(第一条，图1H)对膜运输产生统计学显著的抑制。化合物II(第三条)消除了由源自AD脑的Abeta寡聚体所诱导的膜运输缺陷，但在不存在Abeta的情况下给药时不影响运输(第四阴影条)。对3次实验(n＝3)的数 据取平均值。
在黑条所示的过量化合物II的存在下(15uM，第三条，图1J)，寡聚体诱导的膜运输缺陷被完全消除。CT0109当以其自身给药时对膜运输没有显著作用(黑色斜条，图1J)。
相比之下，从相同死后大脑区域(取自认知正常的年龄匹配的个体)分离的寡聚体通常相对于每克组织重量以较低浓度存在，为90pMvs.137pM(图1F，第二条)，且相比于媒介物(图1F，第一条)不产生显著的膜运输缺陷。在这些条件下，化合物II在与寡聚体一起给药或单独给药时没有作用(图1F，分别是第三和第四条)。对数据也取平均值(n＝3，除了其中n＝5的第二条)。
阴性对照包括经媒介物处理的神经元以及经超生理浓度28μΜ的美金刚处理的神经元。美金刚以该剂量对寡聚体效应产生50％抑制。这些对照在各个板上起到标准化工具的作用，以基于逐个板校准检定性能。
初级神经元培养物
使用胞吐检定作为读出，基于对Abeta寡聚体的细胞应答、以及培养物中胶质细胞与神经元的相对比例的免疫组织化学分析来确定最佳细胞密度。每周用免疫组化和基于图像处理的定量法对培养物进行监测，以监测培养物的神经元vs.神经胶质(神经胶质细胞)的百分比。不接受在体外21天筛选年龄(21DIV)时含有的神经胶质(GFAP阳性)相比于神经元(用针对MAP2的(鸡多克隆)抗体(Millipore)以1:5000(浓度可变)染色为阳性)高于20％的培养物。
Abeta寡聚体制剂
从若干商业供应商例如California Pepride获得人淀粉样蛋白肽1～42，在质量控制分析中具有批次选择偶然事件。寡聚体制剂的质量控制由确定寡聚体的尺寸范围和相对浓度的Western以及确认胞吐加速且无毒性的MTT检定组成。通过经DNA结合蓝色染料DAPI(Invitrogen)可视的核形态的定量在各个基于图像的检定中监控毒性。片段化的细胞核被认为处于凋亡晚期(Majno和Joris'95)且不接受测试。产生不寻常的肽尺寸范围或在1.5uM的标准浓度对神经元显著毒性的肽批次也不被接受。
基于板的控制－当重新排布的板在常规基础上在经媒介物与经Abeta寡聚体处理的神经元之间达到最小统计学显著的两倍分离(p<0.01，Student检验，不等方差)，且各板间不多于10％CV时，检定优化被视为完成。
统计学软件和分析：
通过Cellomics VTI图像分析软件和STORE自动化数据库软件完成数据处理和分析。因为在培养三周后较低的动态范围和神经元孔间的可变性，通过成对Tukey-Kramer分析进行统计学比较，以确定化合物+Abeta寡聚体与单独的Abeta以及单独的化合物与媒介物的分离显著性。成熟初级神经元更密切地接近成人大脑的电生理介导的信号传导网络的能力证实该筛选策略合理。对大量重复筛选孔设置检定力(power)分析，其使假阴性最小化(例如N＝4)。本发明的测试化合物显著逆转Abeta寡聚体对膜运输的作用且不影响神经元代谢自身。
将下表所示的式I、II和VIII内的化合物在本文所述的MTT检定中在添加Abeta寡聚体之前进行给药，并且显示为以所示的EC50阻断Abeta寡聚体诱导的膜运输缺陷。具体地，这些结果表明化合物以微摩尔浓度阻抑/减轻Abeta寡聚体对神经元细胞的膜运输的活性/效应。
表5：σ-2受体配体和抑制淀粉样蛋白寡聚体对膜运输的效应的能力：
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表5中的化合物显示为以所示EC50阻抑Abeta寡聚体诱导的胞吐加速。因此，表5中的化合物显著阻抑Abeta寡聚体介导的膜运输变化。这些结果表明化合物阻抑/减轻Abeta寡聚体对神经元细胞的活性/效应，以及σ-2配体可以用于阻抑Abeta寡聚体诱导的膜运输异常。
实施例7：药代动力学研究和代谢稳定性研究
第一药代动力学研究由商业合同研究组织在小鼠的微粒体中进行。研究根据Obach,R.S等人(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.,283:46-58 进行，其引入本文以供参考。所测试的表2中化合物的半衰期的范围为2～72分钟且剩余化合物的半衰期预期为处于大约相同的范围。
微粒体中半衰期的结果显示于表6中：
表6：化合物的小鼠微粒体稳定性
化合物小鼠微粒体中t1/2
II16
A33
B55
C10
D2
E46
F72
G42
H24
I33
J47
结果表明，所测试的数个化合物相比化合物II在小鼠肝脏微粒体中具有实质更长的半衰期。该结果预示这些化合物在口服后有更大的生物利用度。相同的化合物已通过上述的膜运输检定进行测试且报告其活性。
化合物II的内在清除速率较快，表明基本上首过代谢。为改善药代动力学性质，设计其它化合物以提高代谢稳定性并改善药物样特性。进行微粒体稳定性实验和血浆稳定性实验以确定候选化合物的代谢和肝稳定性。
第二PK研究在体内进行，且涉及测量通过各种途径以急性或慢性方式施用的测试化合物的血浆水平和大脑水平，如下：
HPLC-MS优化
制备各个测试化合物的溶液且经注射泵以恒定速度输入到TSQ Quantum分光仪(Fisher Thermo Scientific)源中。进行全扫描MS(质谱)分析，并对于各个测试化合物以正电离化和负电离化模式产生总离子流色谱和对应的质谱。从正或负质谱中选择用于MS/MS的前体离子，作为各离子丰度的函数。另外，进行产物离子MS/MS分析，以确定用于定量分析的合适的选定的碎裂反应。选择终反应监测参数，使 得对存在于组分的复杂混合物中的测试化合物进行定量的能力最大化。在识别待用于各个测试化合物的具体SRM转化之后，使用自动化方案在TSQ Quantum Compound Optimization工作区中优化检测参数。最后，待用于LC-MS分析的色谱条件通过在合适的LC柱上注射和分离分析物且按需调节梯度条件而确定。
用于IV给药的制剂：
测试化合物在磷酸盐缓冲盐水pH7.4(PBS)中的溶解性首先通过视觉检查评价。如果化合物在目标浓度下可溶，则将PBS用作媒介物。(如果化合物在PBS中不完全溶解，则可以评价与IV给药相容的其它媒介物。这样的媒介物除其它之外包括DMSO、聚乙二醇(PEG400)、Solutol HS15和Cremophor EL)。在本文报道的实验中，IV施用单次推注的10mg/kg化合物II。
用于PO给药的制剂：首先评价测试化合物在PBS中的溶解性。如果化合物在目标浓度下可溶，则将PBS用作媒介物。(如果测试化合物在各浓度下不能完全溶解于PBS，则可以使用DMSO/Solutol HS15/PBS(5/5/90，v/v/v)或DMSO/1％甲基纤维素(5/95，v/v))。
血浆中的线性
在等份的血浆中掺入指定浓度的测试化合物。使用乙腈沉淀处理所掺的样品，并通过HPLC-MS或HPLC-MS/MS分析。构建峰面积对于浓度的校准曲线。确定该检定的可报道的线性范围，以及定量下限(LLQ)。
血浆样品的定量生物分析
使用乙腈沉淀处理血浆样品，并通过HPLC-MS或HPLC-MS/MS分析。生成血浆校准曲线。在等份的无药血浆中掺入指定浓度水平的测试化合物。将所掺的血浆样品与未知的血浆样品一起使用相同的步骤进行处理。处理的血浆样品(干燥提取物)通常被冷冻储存(-20℃)直至进行HPLC-MS或HPLC-MS/MS分析。将干燥提取物重构到合适的溶剂中且在离心后通过HPLC-MS或HPLC-MS/MS分析。记录峰面积，且使用各校准曲线确定未知血浆样品中的测试化合物的浓度。确定该检定的可报道的线性范围，以及定量下限(LLQ)。
用于研究的动物是各自称量为20-30g的雄性C57BL/6小鼠或称量 为180-250g的雄性Sprague-Dawley大鼠。以各个施用条件和各个时间点处理三只动物，使得各只动物进行仅一种血液抽取。通过腹腔内注射完成皮下化合物施用。通过灌胃完成每次口腔施用。经颈静脉导管完成静脉内施用。
在以各种浓度施用化合物之后，在10、30、60、120、240、360、480和1440min收集血浆样品。
从小鼠和大鼠收集血浆样品
在一般吸入麻醉(3％异氟烷)下使动物镇静，以通过心脏穿刺(小鼠)或颈静脉导管(大鼠)收集血液。在收集的1小时内，在涂覆有肝素锂的管中收集等份血液(300-400μL)，轻轻地混合，然后保持于冰上且以2,500xg在4℃离心15分钟。然后将血浆收集并冷冻保持于-20℃直到进一步处理。
动物给药设计-体内PK-非插管、非禁食的动物
组1：SC，每个时间点n＝3动物(总计24只动物)或
IV，每个时间点n＝3动物(总计24只动物)
组2：PO，每个时间点n＝3动物(总计24只动物)
组3：对照动物(对于无药血液)，n＝5小鼠
各个动物进行一次抽血和一次脑收集。
从动物中收集大脑样品
紧接血液取样后，将动物断颈，并快速取出整个脑，用冷盐水(0.9％NaCl，g/mL)清洗，使表面脉管系统断裂，用纱布吸干，称重，保持在冰上直至在收集一个小时内的进一步处理。使用Power Gen125，将各个脑在1.5mL冷的磷酸缓冲盐水pH7.4(小鼠＝1.5mL，大鼠＝)中于冰上匀浆10秒钟。之后将来自各个脑的脑匀浆物储存在-20℃直至进一步处理。
大脑样品中的线性
在等份的大脑匀浆中掺入指定浓度的测试化合物。向各个大脑等份物中，添加等体积的冷26％(g/mL)中性右旋糖酐(来自Sigma，平均分子量65,000-85,000，目录号D-1390)溶液以得到13％的最终右旋糖酐浓度。将匀浆在4℃以54000x g离心15分钟。上清液随后使用乙腈沉淀处理并通过HPLC-MS/MS分析。构建峰面积对于浓度的校 准曲线。确定该检定的可报道的线性范围，以及定量下限(LLQ)。
大脑样品的定量分析
向各个大脑匀浆等份物中，添加等体积的冷26％(g/mL)中性右旋糖酐(来自Sigma，平均分子量65,000-85,000，目录号D-1390)溶液以得到13％的最终右旋糖酐浓度。将匀浆在4℃以54000x g离心15分钟。上清液随后使用乙腈沉淀处理并通过HPLC-MS/MS分析。生成脑校准曲线。在无药大脑匀浆等份物中掺入指定浓度水平的测试化合物。将所掺的大脑匀浆样品与未知的脑匀浆样品一起使用相同的步骤进行处理。将处理的大脑样品在-20℃储存直到LC-MS/MS分析，分析时记录峰面积，并使用各校准曲线确定未知大脑样品中的测试化合物的浓度。确定该检定的可报道的线性范围，以及定量下限(LLQ)。
大脑渗透
通过LC-MS/MS确定各时间大脑中(ng/g组织)和血浆中(ng/mL)测试化合物的浓度以及大脑浓度与血浆浓度的比率，并如上所述进行报告。
药代动力学
构建化合物的血浆浓度相对于时间的图。口服和SC给药后化合物的基本药代动力学参数(AUClast、AUCINF、T1/2、Tmax和Cmax)得自使用WinNonlin(Pharsight)的血浆数据的非房室分析(NCA)。非房室分析不需要假定用于药物或代谢物的特定的房室模型。NCA使得可以应用梯形法则来测量血浆浓度-时间曲线下的面积(Gabrielsson,J.和Weiner,D.Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Data Analysis:Concepts and Applications.Swedish Pharmaceutical Press.1997)。
所报道的术语的定义
曲线下面积(AUC)-达到全身循环的未变化药物的总量的量度。曲线下面积是几何测量，其通过通过用浓度vs.时间作图并对各个梯形的增量面积求和来计算。
WinNonlin具有两种用于计算面积的计算方法：线性梯形法和线性对数梯形法。因为线性梯形法对浓度-时间曲线的下降部分可能提供有偏结果并高估AUC，因此WinNonlin对AUC的计算提供线性对数选项。默认使用对数线性梯形法来对血浆浓度-时间曲线的剩余部分测量 Tmax后面积。
AUClast：高于定量限制的从给药时间到最后观察时间的曲线下面积。
AUCINF：从给药时间外推到无限的曲线下面积。
Cmax-在给药时间与最后观察时间点之间得到的经口或非IV药物施用的最大血浆药物浓度。
Tmax-在药物施用之后以分钟计的在最大观察血浆浓度(Cmax)时的时间。
T1/2-IV和非IV给药的末端消除半衰期。
其中λZ(z)是与血浆浓度-时间曲线的末端(对数线性)部分相关的一级速率常数。Z通过时间相对于对数浓度的线性回归而估计。
结果显示，当以范围为0.1～0.5mg/kg的剂量急性或慢性(在5天内每天)施用时，化合物生物利用度高且大脑渗透性高。急性施用化合物II的结果显示于图2A中。图2A是其中化合物的血浆水平以ng/mL为单位显示于左边y轴的图。大脑水平以绿色以ng/g为单位显示于右边y轴。X轴显示在零时推注IV或SC施用之后的时间。在以10mg/kgi.v.急性IV施用之后，化合物II达到脑中高浓度且在给药后180分钟仍具有171ng/g的浓度(体内有效脑剂量的57x，通过空心菱形表示)。在急性SC给药后为相似的模式。化合物B在肠胃外施用时显示相同水平的生物利用度，但通过口腔途径生物利用度基本上更大。两种所测试的化合物均发现为具有明显较高的BBB渗透性，且化合物II在3小时的大脑/血浆比率为8。
化合物B的结果和化合物II急性给药的结果显示于表7中。
表7.化合物B和II在小鼠中的药物代谢动力学
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如该表中所示，化合物B的口服生物利用度及它的其它PK参数相对于化合物II有改善。
在5天的时程内以慢性施用，0.1、0.35和0.5mg/kg范围内的给药提供化合物II相对稳定的血浆水平，脑暴露较好且具有与急性设定相似的脑/血浆比。结果显示于图2B中。图2B是在每天一次皮下施用不同量的化合物II(0.5mg/kg/天：填充的下三角；0.35mg/kg/天：填充的上三角；以及0.1mg/天填充的正方形)时在血浆(左纵坐标)中得到的以及在SC施用相同量(分别是空心下三角、空心上三角和空心正方形)的化合物II时在大脑(右纵坐标)中得到的药代动力学数据的图。
化合物B的脑水平测量显示出比化合物II更低的峰浓度，但更高的持续水平。在三小时点处，大脑中化合物II的量相比于针对化合物II确定的50ng/mL有效剂量，对PO几乎高40x且对SC高60x。然而，化合物II的三小时时间点相比该化合物的有效剂量仍高>3x(对于SC)(数据未显示)。
当以1mg/kg在小鼠中静脉给药时，化合物IXa和IXb的混合物显示出2.7小时的半衰期。然而，当化合物以5mg/kg口服给药时，其在血浆中显示出可忽略的药物量。对化合物IXa和IXb的混合物+药物标准品在小鼠肝微粒体中随后的研究(表6)测量出混合物的半衰期为8.7分钟且内在清除率为267微升/min/mg，表明混合物易受首过代谢影响。通常，CNS活性化合物倾向于具有低至中度的内在清除率(CLint≤100微升/min/mg)(Wager等人，'10)。13种CNS活性药物的人肝微粒体稳定性数据给出51±29分钟的平均半衰期(Orbach'99)。因此，对于化合物II首过代谢的改善的合理目标将是T1/2>30分钟且CLint≤100微升/min/mg。化合物IXa、IXb相比于某些已知药物表现出可比较的肝稳定性，如图8中所示。
表8.化合物IXa和IXb以及选择CNS药物标准物的小鼠肝微粒体数据。CL'int＝内在清除率。通过合同研究组织进行实验，并以化合物II为标准物进行。
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实施例8：Abeta1-42寡聚体结合和突触丧失检定
在该检定中，使Abeta寡聚体与培养中的成熟初级神经元接触，且通过免疫组化(抗Abeta抗体)确定其结合并通过图像处理进行定量。神经元树突中的Abeta的量通过对神经炎上标记点的数目进行计数来评价。已知Abeta寡聚体与原代培养中占显著百分数(30～50％)的海马神经元上所存在的突触后神经元的子集饱和地(Kd约400nM；Laurén2009)且高亲和性地结合(Lacor等人,2004；Lambert等人,2007)，且这与阿尔茨海默病患者大脑中的Abeta结合的观察结果很好地相关(Lambert等人,2007)。该标记与突触相关联，与突触后支架蛋白PSD-95共定位(Lacor等人,'04)。还已知Abeta寡聚体介导突触丧失(报道在脑片的人海马神经元中为18％(Schef等人,2007))且抑制长时程增强效应(LTP)。突触数目也可以在该检定中通过免疫荧光化学(immunofluorochemistry)进行定量。用于结合检定的相似步骤可在文献中找到。参见例如，Look GC等人.Discovery of ADDL-targeting small molecule drugs for Alzheimer's disease.Curr Alzheimer Res.2007Dec；4(5):562-7.Review.
对结合于神经元表面的Abeta的量的测量可以用作对识别经一种或多种以下机制起作用的化合物的第二筛选：通过干扰Abeta寡聚体与神经元表面的结合或通过影响寡聚体自身的变化(反向激动或寡聚体解离)或寡聚体结合的表面受体的变化(变构调节或经典受体拮抗)来阻断Abeta效应。其还可以将这些化合物与在下游信号传导事件中起作用的化合物区分开。因此，该检定与以Abeta寡聚体对神经元的非致死作用为特征的疾病状态相关，且形成本发明的发明人所采用的筛选级联的一部分，从而识别临床相关的化合物。重要地，此处公开 的化合物之一即化合物II在膜运输检定且在该结合/突触丧失检定中具有活性，且已证明还在两种不同的阿尔茨海默病转基因模型中且在诱导的模型中也具有活性。因此，这以及膜运输检定可用于识别临床相关的化合物且似乎对于体内结果具有预测价值。该检定的预测有效性通过使用本发明范围外的化合物证实其预测化合物性质的能力来确认。
初级海马神经元培养物在以上膜运输检定中确立。向板添加化合物II(以10-8～30微摩尔的浓度)，并添加任何其它未来将检测的化合物(以10-8～30微摩尔的浓度)，随后以达到饱和结合的浓度添加含有Abeta1-42寡聚体的制剂。用待测试的化合物进行的预处理持续1小时并以70uL的终浓度添加Abeta寡聚体或不添加寡聚体(仅媒介物)，之后再孵育23小时。
用3.7％多聚甲醛于磷酸盐缓冲盐水中的溶液将板固定15min。然后用PBS洗涤板3x，每次5min。在室温下于PBS的5％山羊血清和0.5％Triton X-100中封闭板1小时。用PBS中的5％山羊血清将一抗(MAP2多克隆抗体，Millopore#AB5622和β淀粉样蛋白6E10单克隆抗体，Covance#SIG-39300，1微克/ml，以及突触素兔多克隆抗体，Anaspe，0.2微克/ml)稀释1:1000。将一抗在4℃孵育过夜。然后用PBS洗涤板3x，每次5min。用PBS中的5％山羊血清将二抗(Alex Flor488多克隆抗体，Invitrogen#A11008和Alexa Flor647单克隆抗体，Invitrogen#A21235)稀释1:1000。将二抗在室温孵育1小时。用PBS将板洗涤一次。然后以0.03ug/ul施用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，Invitrogen)且将其在室温孵育5min，然后用PBS洗涤。结果显示，如预期，如下详述制备且根据所使用的制剂以3或1μΜ给药的Abeta寡聚体与突触处的神经元结合，如由红色染料所显示。在具有早期阿尔茨海默病的人中，与年龄匹配的认知正常的个体相比，海马中的突触数量显示为减少18％(Scheff等人,'07)，且该结果也可以在该检定中可视为荧光点进而突触数量的20％衰退。然而，在化合物II(15uM)的共存下，Abeta结合基本上减少到对照水平，且绿色荧光未受影响，表明突触数量未减少。参见图3A～3F。在图3A-板块A中，Abeta42寡聚体与突触后棘结合，图3A-板块B显示，突触前棘经初级神经元 中的突触素标记(21DIV)。图3A-板块C和D分别示出当将IXa、IXb加入培养物中时处于基本上对照水平的突触后棘和突触。如在图3C的条形图中所定量显示，相比于单独的媒介物(第一条)，单独添加的Abeta42寡聚体在24小时后(第四条)引起突触素点密度降低20％(如计算)。该丧失被化合物II或IXa、IXb(第五或第六条)逆转，且该结果统计学显著。在不存在Abeta寡聚体的情况下，化合物IXa、IXb或化合物II均不影响突触数目(阴影条)且其保持在与对照(单独的媒介物)可比较的水平。比例尺＝20urn。p<0.001ANOVA。图3D(p<0.001ANOVA)也是条形图且显示通过Abeta点计算的Abeta结合强度在化合物II或IXa、IXb的存在下减少18％，而该降低足以允许突触计数在该化合物的存在下达到对照水平。
此外，在化合物IXa和IXb的混合物的存在下，点状突触Abeta寡聚体结合以浓度依赖方式减少38％，IC50为1.2μM(数据未示出)。点密度的柱状图显示，正常双峰结合群(具有亮点的神经元和具有不太亮的点的群)在药物存在下左移(数据未示出)。已经报道对Abeta寡聚体结合的部分抑制重获100％的LTP功能(Strittmatter SM等人,Cellular Prion Protein Mediates Impairment of Synaptic Plasticity by Amyloid-Beta Oligomers Nature(2009)457(7233:1128-32))。此外，如图3C所示，Abeta寡聚体(第四条)在24小时后与媒介物处理(第一条)相比引起突触素点密度的20％降低，其被5μM的化合物IXa和IXb的混合物逆转(第五条)。不存在Abeta时(第二条)，化合物IXa和IXb的混合物不影响突触数量。Abeta寡聚体造成突触数量的18.2％降低；100％的该丧失被5μM的化合物IXa、IXb或II消除(图3C)。化合物IXa和IXb的混合物以1.21uM的IC50引起Abeta标记点密度的17.7％降低(图3D)。
用DAPI可视化的细胞核表现出正常的形态，表明不存在神经退行。该过程将使用选自被式I～IX包括的那些、以及其他描述为以上σ-2配体的化合物的其他测试化合物进行重复。
Abeta寡聚体制剂：
人淀粉样蛋白肽1～42得自California Peptide，在质量控制分析中存在批次选择偶然事件。根据上述的公开方法来制备Abeta1～42寡聚 体。[参见，例如Dahlgren等人,"Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability"J Biol Chem.2002Aug30；277(35):32046-53.Epub2002Jun10.；LeVine H3rd."Alzheimer's beta-peptide oligomer formation at physiologic concentrations"Anal Biochem.2004Dec1；335(1):81-90；Shrestha等人,"Amyloid beta peptide adversely affects spine number and motility in hippocampal neurons"Mol Cell Neurosci.2006Nov；33(3):274-82.Epub2006Sep8；Puzzo等人,"Amyloid-beta peptide inhibits activation of the nitric oxide/cGMP/cAMP-responsive element-binding protein pathway during hippocampal synaptic plasticity"J Neurosci.2005Jul20；25(29):6887-97；Barghorn等人,"Globular amyloid beta-peptide oligomer-a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease"J Neurochem.2005Nov；95(3):834-47.Epub2005Aug31；Johansson等人,Physiochemical characterization of the Alzheimer's disease-related peptides A beta1-42Arctic and A beta l-42wt.FEBS J.2006Jun；273(12):2618-30]以及得自脑的Abeta寡聚体(参见，例如Walsh等人,Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo.Nature(2002).416,535-539；Lesne等人,A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory.Nature.2006Mar16；440(7082):352-7；Shankar等人,Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory.Nat Med.2008Aug；14(8):837-42.Epub2008Jun22)。寡聚体制剂的质量控制由确定寡聚体尺寸范围和相对浓度的蛋白印迹以及证实胞吐加速而没有毒性的MTT检定构成。毒性在各个基于图像的检定中经由对用DNA结合染料DAPI(Invitrogen)可视化的细胞核形态进行定量而进行监控。片段化的细胞核被认为处于晚期细胞凋亡，因此去掉检测(Majno and Joris Apoptosis,oncosis,and necrosis.An overview of cell death.Am J Pathol1995；146:3-16)。产生不正常肽尺寸范围或在标准浓度下对神经元产生显著毒性的肽批次将被拒绝。
对照
用寡聚体制剂对Abeta抗体6E10预吸收以剂量依赖的方式(7.84x10-6)抑制突触结合，并用作阳性对照。抗体以1:1000(1微克/ml)使 用。对于突触丧失检定，NMDA拮抗剂地佐环平(MK-801)以80uM用作阳性对照。
图像处理
拍摄图像并用Cellomics VTI自动显微镜平台运用神经元图谱化算法进行分析。对于统计分析，使用不等方差的Tukey-Kramer成对比较。
蛋白免疫印迹
将含有Abeta1～42的样本在非还原性泳道标记物上样缓冲液(Pierce#1859594)中稀释(1:5)。将30微升(μL)样本装载到十八个孔的预制4～15％Tris-HCl凝胶(BIORAD#345-0028)中。在BIO-RAD Criterian预制凝胶系统中使用Tris-甘氨酸缓冲液在125伏特(V)进行90分钟的电泳。在Tris-甘氨酸/10％甲醇缓冲液中，在30V下，经120分钟将凝胶转印到0.2μM硝酸纤维素膜上。膜在PBS溶液中煮5分钟并用TBS/5％牛奶溶液在4℃封闭过夜。在TBS/1％牛奶溶液中用稀释至10μg/mL的6E10-HRP(Covance#SIG-39345)于室温对膜探测1小时。膜用TBS/0.05％吐温-20的溶液洗涤三次，每次40分钟，并用ECL试剂(BIO-RAD#162-0112)显影5分钟。在Alpha Innotech FluorChem Q定量成像系统中进行图像获取，并用AlphaView Q软件进行分析。
活性
示出化合物II，根据结合检定(使用成像处理算法)，预计选自本文具体公开的那些的化合物显示为部分地阻断Abeta寡聚体配体对神经元的结合(约25％)。
实施例9：条件性恐惧检定
在已知为条件性恐惧的记忆依赖行为任务的动物模型中测试化合物II。基于所公开的操作指南来设计研究操作指南(参见，例如Puzzo D,Privitera L,Leznik E,FàM,Staniszewski A,Palmeri A,Arancio O.Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus.J Neurosci.2008Dec31；28(53):14537-45.)。情境记忆的形成依赖于颞叶内侧结构例如海马的完整性。在该检定中，将小鼠训练成记住特定的主要情境(条件性刺激；CS)与厌恶事件(在该情况下为温和足部电击)(非条件性刺激，US)相关。示出良好学习 的动物在放回相同情境时将表现出僵立行为增加。该僵立不存在于新的情境中。在情境中僵立的增加表明动物中强烈的海马依赖的记忆形成。在条件性恐惧中测试的记忆对可溶Aβ的升高较为敏感。化合物II可有效停止Abeta寡聚体介导的对膜运输的作用。当在Abeta寡聚体施用前对动物给药时，化合物II以剂量依赖的方式阻断寡聚体对记忆的作用。化合物在2pmol的剂量完全阻断寡聚体介导的记忆缺陷。
确实，如图4所示，化合物II完全消除Abeta寡聚体引发的记忆缺陷(黑条)而当单独给药时不影响记忆(阴影条)。单独Abeta寡聚体的作用通过红条示出。此外，如图5所示，化合物IXa和IXb的混合物提供相似的结果。该行为效力表明，膜运输检定能够预测哪些化合物将有效治疗由寡聚体引起的行为记忆丧失。如本文所述的那样进行对于记忆的恐惧条件模型。在任何剂量均没有观察到不利的行为变化。因此，在该化合物在膜运输检定中的性能与其在条件性恐惧检定中的性能之间具有相关性，后者是记忆丧失的指示。预测表2中所列的化合物将在条件性恐惧检定中有活性，因此将示出对治疗记忆丧失有效。化合物在恐惧条件模型中的性能与其在治疗记忆丧失中的有用性之间的相关性已经在文献中确定。(Delgado MR,Olsson A,Phelps EA."Extending animal models of fear conditioning to humans"Biol.Psychol.2006Jul；73(l):39-48)。
实施例10.对大鼠、猕猴和人死后脑组织的放射自显影研究
对于σ-2和σ-1受体配体的神经学和药理学图谱的放射自显影成像研究通过修改先前由Xu等人(2010)报道的操作指南来进行，Xu,J.,Hassanzadeh B,Chu W,Tu Z,Vangveravong S,.Tones LA,Leudtke RR,Perlmutter JS,Mintun MA,Mach RH.[3H]4-(Dimethylamino)-N-[4-(4-(2-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)butyl]benzamide,a selective radioligand for dopamine D(3)receptors.II.Quantitative analysis of dopamine D3and D2receptor density ratio in the caudate-putamen.Synapse64:449-459(2010)，其并入本文以作参考。标记的RHM-1通过Xu J,Tu Z,Jones LA,Wheeler KT,Mach RH.[3H]N-[4-(3,4-dihydro-6,7-dimethoxyisoquinolin-2(1H)-yl)butyl]-2-methoxy-5-methylbenzamide:a Novel Sigma-2Receptor Probe.Eur.J.Pharmacol.525:8-17(2005)的方法得到，其并入本文以作参考。
来自大鼠、猕猴和死后人脑的20μM厚的脑切片使用Microm冷冻切片机进行切片，并装载至superfrost plus载玻片(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)上，并在该研究中使用经过大脑皮层和海马的脑区的系列切片。将脑切片与5nM[3H](+)-喷他佐辛(对于σ-1受体图谱化)、仅4nM[3H]RHM-1(对于σ-2受体特征化)、在σ-1受体阻断剂(+)-喷他佐辛的存在下与10nM[3H]DTG和[3H]氟哌啶醇(对σ-2受体分布进行成像)一起孵育；在与放射性配体孵育30分钟后，含有脑切片的载玻片用冰冷缓冲液冲洗5次，每次一分钟。
将玻片干燥，并通过在自由侧覆盖铜箔带而使其导电，然后将其放置在气体检测器Beta Imager2000Z Digital Beta成像系统(Biospace，France)的气体箱[氩气和三乙胺的混合物(Sigma-Aldrich,USA)]中。在气体良好混合并达到均质状态时，再暴露24小时至48小时直至观察到高质量图像。在相同时间对[3H]微尺度(American Radiolabeled Chemicals,Inc.,St.Louis,MO)计数，作为对总放射性定量分析的参考，即，将cpm/mm2转化为nCi/mg组织。对感兴趣的解剖区(ROI)用Beta-Image Plus程序(BioSpace,France)进行定量分析，即，在皮层和海马区获得定量放射性摄取(cpm/nlln2)。基于相应放射性配体的特定活性以及标准[3H]微尺度的校准曲线，将结合密度标准化为fmol/mg组织。使用定量放射自显影，对于四种放射性配体[3H](+)-喷他佐辛、[3H]RHM-1、[3H]DTG和[3H]氟哌啶醇，对一系列候选化合物的稀释物(10nM、100nM、1,000nM和10,000nM)测试其对结合位点的竞争，之后分析特异性结合(％对照)来得到在皮层和海马区(齿状回、海马CA I和CA3)的结合亲和性。
在σ-1和σ-2受体处的放射自显影分别示于图8A和8B中。图6C示出(A)在正常患者、路易体痴呆症(DLB)患者或阿尔茨海默病(AD)患者的人额叶皮层切片中的[3H]-(+)-喷他佐辛(σ-1受体配体)放射自显影，以及(B)与对照相比的特异性结合的图。如图6A所示，与正常对照相比，σ-1受体在阿尔茨海默病和可能的DLB中统计学地下调。该发现证实了Mishina等人的发现，Mishina等人报道在早期阿尔茨海默病中的低密度σ-1受体。Mishina等人,2008,Low density of sigmal receptors in early Alzheimer's disease.Ann.Nucl Med22:151-156。图6B 示出(A)在正常患者、路易体痴呆症(DLB)患者或阿尔茨海默病(AD)患者的人额叶皮层切片中的[125I]-RHM-4(σ-2受体配体)放射自显影，以及(B)与对照相比的特异性结合的图。σ-2受体在AD中没有统计学下调。图6C示出(A)在猴的额叶皮层、猴的海马或人颞叶皮层中σ-2配体对18.4nM[3H]-RHM-1的替代，以及(B)具有以及不具有1μM西拉美新和化合物IXA、IXB以及J中每一组情况下的[3H]-RHM-1结合密度图。西拉美新以及化合物IXA、IXB和II部分替代靶标组织中的[3H]-RHM-1。
实施例11.MTS检定：确定多种σ-2配体的激动剂或拮抗剂活性
以下示出的化合物的细胞毒性使用CellTiter96Aqueous One Solution检定(Promega,Madison,WI)来确定。简单而言，将MDA-MB-435或MDA-MB231或SKOV-3细胞以2000细胞/孔的密度在用σ-2受体选择性配体处理前的一天接种在96孔板中。在24小时处理后，向各个孔加入CellTiter96Aqueous One Solution试剂，且板在37℃孵育2小时。在Victor3酶标仪(PerkinElmer Life and Analytical Sciences,Shelton,CT)中于490nm对板读数。定义为相对于未处理细胞抑制50％细胞成活所需的σ配体浓度的EC50值，从对于各个细胞系的剂量应答曲线中确定。西拉美新被接收作为激动剂。σ-2配体的激动剂和拮抗剂被定义如下：如果σ-2配体的EC50小于西拉美新的EC50的2倍，则该σ-2配体被认为是激动剂。如果σ-2配体的EC50为西拉美新的EC50的2～10倍，则该σ-2配体被认为是部分激动剂。如果σ-2配体的EC50大于西拉美新EC50的10倍，则该σ-2配体被认为是拮抗剂。用于研究的σ-2配体是：激动剂(西拉美新和SV119)、部分激动剂(WC26)、拮抗剂(RHM-1)和候选化合物(II和IXa、IXb)。结果显示在图9A中。图7A的数据显示在表9中。
表10.肿瘤细胞成活检定的IC50值
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神经元培养物用多种浓度的σ化合物处理24小时，并测量相对于媒介物的细胞核密度。与在测试浓度不引起细胞核密度降低的σ-2拮抗剂(RHM-1、IXa及IXb和II)相反，σ-2激动剂(西拉美新、SV-119、WC-26)造成神经元中显著异常的细胞核形态。因此，σ-2受体激动剂对神经元和癌细胞有细胞毒性；然而，σ-2受体拮抗剂无毒性且还阻断由σ-2受体激动剂引起的细胞毒性。
实施例12.半胱氨酸天冬氨酸酶-3检定.确定σ-2配体的激动剂或拮抗剂活性。
如本文所述，Xu等人识别出PGRMC1蛋白复合物为假定的σ-2受体结合位点。Xu等人，2011.Nature Commun.2,article number380，并入本文以作参考。σ-2受体激动剂可以引发半胱氨酸天冬氨酸酶-3依赖的细胞死亡。Xu等人(2011)公开了检测PGRMC1通过σ-2受体激动剂WC-26来调节半胱氨酸天冬氨酸酶-3活化的能力的功能性检定。
Abeta寡聚体引起低水平的半胱氨酸天冬氨酸酶-3活化，并引起LTD。高水平的Abeta寡聚体和半胱氨酸天冬氨酸酶活化造成细胞死亡。Li等人，2010；Olsen and Sheng2012。本文已表明，σ-2受体激动剂(SV-119、西拉美新)激活肿瘤细胞和神经元中的半胱氨酸天冬氨酸酶-3；参见，例如图8A和8B。σ-2受体拮抗剂RHM-1抑制肿瘤细胞中的激活(图8A)，但是在该实验中无法在神经元中阻断激动剂SV-119引起的激活(图8B)。测试化合物II和IXa、IXb(所有这些为如下所示的σ-2受体拮抗剂)能够抑制肿瘤细胞中的半胱氨酸天冬氨酸酶-3激活，并阻断神经元中半胱氨酸天冬氨酸酶-3的σ-2受体激动剂SV-119激活。因此，如在此实施例中证实的，测试化合物II和IXa、IXb作为肿瘤细胞和神经元的半胱氨酸天冬氨酸酶-3检定中的σ-2受体拮抗剂。
根据制造商的操作指南，使用半胱氨酸天冬氨酸酶-3比色活性检定试剂盒(Milipore,Billerica,MA)来测量内源半胱氨酸天冬氨酸酶-3经由σ-2受体配体的激活。简单而言，将MDA-MB435或MDA-MB23I 细胞以0.5x106细胞/100mm皿进行铺板。在铺板后24小时，将σ-2配体加到培养皿中，以引发半胱氨酸天冬氨酸酶3的激活。σ-2配体的最终浓度为其EC50。在处理24小时后，收获细胞，在300uL的细胞裂解缓冲液中裂解，并在10,000x g离心5分钟。收集上清液，并与半胱氨酸天冬氨酸酶-3底物DEVD-pNA在37℃孵育2小时。使用Dc蛋白检定试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA1)确定蛋白浓度。使用Victor3酶标仪(PerkinEliner Life and Analytical Sciences,Shelton,CT)在405nm 测量所得的游离pNA。检测的配体包括：σ-2激动剂(西拉美新、SV119、WC26)和σ-2拮抗剂RHMWU-I-102(RHM-1)以及候选化合物(II和IXa、IXb)。激活半胱氨酸天冬氨酸酶3的配体被认为是激动剂，而不激活半胱氨酸天冬氨酸酶3的配体被认为是拮抗剂。如图8A所示，σ-2激动剂西拉美新引发半胱氨酸天冬氨酸酶-3活性，而σ-2拮抗剂RHM-1和候选化合物II和IXa、IXb不引发半胱氨酸天冬氨酸酶-3活性。图8B示出经由σ-2激动剂SV-119的半胱氨酸天冬氨酸酶-3激活被化合物IXa、IXb和II阻断。化合物IXa、IXb和II在癌细胞和神经元中表现类似于σ-2拮抗剂。
实施例13.治疗表型
在一些实施方式中，本公开内容提供可预测行为效力的体外检定平台。对于(1)选择性地以高亲和性与σ-2受体结合；且(2)在神经元中作为功能性拮抗剂的化合物，如果其阻抑Aβ引发的膜运输缺陷、阻抑Aβ-引发的突触丧失且在不存在Abeta寡聚体时不影响运输或突触数量，则被预测为具有行为效力。在体外检定中的这种活性形式被称为“治疗表型”。σ-2受体拮抗剂阻断成熟神经元中Abeta寡聚体效应而在不存在Abeta寡聚体时不影响正常功能的能力是治疗表型的一个标准。当不存在寡聚体时影响运输或突触数量的化合物不是行为上有效的。仅有选择性地阻断寡聚体且不影响正常运输或改变突触数量的那些化合物，在预防和治疗Abeta寡聚体引起的记忆丧失中是行为上有效的。在一个实施方式中，体外检定平台可以预测行为效力。由此，在该平台检定中的活性形式是治疗表型。
例如，参见表10A。
表10A.治疗表型
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总之，在σ-2受体处具有高亲和性(优选Ki小于约600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、150nM、100nM或70nM)，且相比于其他非σCNS或靶标受体对σ受体具有高于约20倍、30倍、50倍、70倍或优选高于100倍选择性，具有良好的药物样特性(包括脑穿透性和良好的代谢和/或血浆稳定性)并具有治疗表型的σ-2拮抗剂，被预测为具有行为效力且可以用于在有需求的患者中治疗Abeta寡聚体引发的突触功能障碍。
通过体外检定表征预测为具有经口生物可得性的一些化合物II类似物的功能性神经元表型示于表10B中。
表10B.功能性神经元表型
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实施例14：体外毒性
代表性σ-2拮抗剂II和IXa、IXb在急性或慢性体外给药时不引起神经元或胶质细胞毒性。σ-2受体拮抗剂消除或降低膜运输中Abeta寡聚体引发的变化。当不存在寡聚体而给药时，化合物对膜运输没出现显著作用。当以EC50浓度(高达50μM II或IXa、IXb)在三天测试至10次时，相对于神经元数量、胶质细胞数量、细胞核尺寸、细胞核形态、神经突长度、细胞骨架形态没有毒性。参见表11。
表11
化合物IXa、IXbII
EC50(uM)4.92.2
Abeta的最大抑制(浓度)100％(14)85％(10)
计算的Ki*0.580.26
Ki时的单独Cpd+9％+1％
*Abeta的Km＝0.4uM；检定浓度3μM总Abeta。
在大量标准检定中测试化合物II的体外毒性。体外毒性研究中的测试表明，在10μM没有基因毒性(AMES，微核，细菌细胞毒性)。在10μM的66％的HepG2毒性(在受体x处100倍以上的亲和性)可能由HepG2肿瘤细胞系中的化合物亲油性或受体过表达引起。CYP450酶2D6、3A4和2C19的部分抑制(46～73％)发生在10uM。在100nM下观察到中度hERG抑制(24％)。化合物II在PGP表现出非常弱(IC50>30uM)的活性。
实施例15：化合物II对映异构体在膜运输检定中的分离和活性
将化合物II分离成其(+)和(-)对映异构体。将外消旋混合物施用至手性柱CHIRALPAK AD-H(直链淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂覆在硅胶上；4.6X250mm)。将15微升体积的样本注射到柱中。洗提液为己烷/EtOH/TEA(95/5/0.1)，25摄氏度，流速为1ml/min。 两种对映异构体在不同的峰分离。(+)对映异构体在约16分钟的第一个峰洗提出，且(-)对映异构体在约20分钟的第二个峰洗提出。对映异构体为至少98％纯。(+)对映异构体具有+10.1的比旋度(c1.80于MeOH中)，且(-)对映异构体具有-7.2的比旋度(c1.80于MeOH中)。在实施例6所述的膜运输检定中，(+)对映异构体比(-)对映异构体更有效力。在一个样本中，在抑制膜运输检定中的β淀粉样蛋白引发的缺陷中，(+)对映异构体的EC50为5.6，且(-)对映异构体的EC50为10.9μM。
实施例16.经口可得化合物的行为效力-改善转基因阿尔茨海默病小鼠模型中的记忆缺陷。
将雄性hAPP Swe/Ldn转基因(Tg)小鼠用作AD的TG模型。用媒介物、10或30mg/kg/天的CB或CF经p.o.处理5.5个月的转基因小鼠，以及媒介物处理的非转基因同窝幼崽进行标准条件性恐惧范例。在情境条件性恐惧中，用媒介物p.o.处理5.5个月的媒介物处理的9月龄雄性hAPP Swe/Ldn转基因(Tg)小鼠表现出显著的记忆缺陷vs.媒介物处理的非转基因同窝幼崽。
当在训练24小时后对动物测试其关联记忆时，使用反复测量的双因素(基因型和时间)ANOVA并没有检测出转基因和非转基因媒介物处理小鼠之间的总僵立时间的显著差异。然而，在各个定时的时间间隔中对僵立行为的更加敏感的分析表明，相比于媒介物处理的非转基因动物，转基因小鼠在1～3分钟时间间隔中表现得更差(Mann-Whitney U测试，p<0.05)。在该时间间隔中，与媒介物相比，用10和30mg/kg/天的CB(p<0.05)和30mg/kg/天的CF(p<0.005)处理的转基因动物显著改善表现(Mann-Whitney U测试)。结果显示在图9中，两种剂量的CB显著地逆转AD小鼠中的记忆缺陷；且更高剂量的CF逆转AD小鼠中的记忆缺陷。用10和30mg/kg/天的CB或30mg/kg/天的CF处理Tg动物，分别在394±287、793±325或331±373nM(AVG±S.D.)的测试脑浓度下改善缺陷。对于经口可得化合物的脑/谷血浆和脑/峰血浆的比例，结果示于表12中。
表12.对于经口可得化合物的脑/谷血浆和脑/峰血浆比例
CF30mg/kg130.5
CF10mg/kg110.2
CB30mg/kg140.4
CB10mg/kg170.7
因此，化合物CB和CF均为经口生物可得，能够实现显著的脑穿透并在按照慢性长时程给药的老年转基因阿尔茨海默病小鼠模型动物中逆转建立的记忆缺陷。没有观察到不利的行为效应。
CB和CF均为选择性的高亲和性σ-2受体拮抗剂化合物。CB和CF均以高亲和性与σ-2以及σ-1受体结合，如表14所示。进行针对一组40种脑受体的反筛选，且结果表明CB和CF对于σ受体为高度选择性，如表13中所示。
表13.对于经口生物可得化合物的受体亲和性
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10mg/kg/天剂量的CB对σ和多巴胺转运体引起处在或高于Ki的脑部化合物水平，30mg/kg/天剂量则击中那些加上Ca++ch和5-HT转运体。接下来的研究可用来确定该化合物的最小有效剂量。剂量在30mg/kg/天的CF引起仅对σ受体有选择性的脑部化合物水平，因此其在σ受体处的亲和性解释了其在这些脑浓度下的行为效力。
合成例1：通过还原胺化而合成化合物
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将姜酮(5.00g，25.7mmol)溶于甲苯(250mL)并且添加4-三氟甲基苄基胺(4.73g，27.0mmol)。将混合物保持在氮氛下并在回流下加热16小时，通过Dean-Stark蒸馏去除水。这时，移除Dean-Stark阱并将反应混合物在冰浴上冷却到0℃。在大力搅拌下在30分钟内分批添加硼氢化钠(5g)于甲醇(100mL)中的溶液。当完成添加时，将混合物在回流下加热16小时。这时，将反应混合物冷却到室温并倒入饱和碳酸氢钠水溶液(300mL)。将所得混合物通过旋转蒸发浓缩并且水性残余物在水与氯仿之间分隔开。使氯仿层在无水硫酸钠上干燥，然后过滤和浓缩。然后使用硅胶柱层析采用5％氨-甲醇于氯仿中的溶液的流动相来纯化产物。将含有产物的部分合并和浓缩，然后在高真空下干燥过夜，以提供浅棕色油(6.72g，74％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.57(d,J＝7.8Hz,2H),7.43(d,J＝7.9Hz,2H),6.82(d,J＝7.3Hz,1H),6.65(m,2H),5.16-4.42(br s,2H),3.90(d,J＝13.7Hz,1H),3.84(s,3H),3.80(d,J＝13.7Hz,1H),2.76-2.70(m,1H),2.67-2.55(m,2H),1.84-1.77(m,1H),1.69-1.63(m,1H),1.17(d,J＝6.3Hz,3H).13CNMR(125MHz,CDCl3)δ:146.7,144.6,143.9,134.0,129.1,128.4,127.5,125.4,125.3,123.2,120.8,114.6,111.0,55.7,52.1,50.6,38.8,32.0,20.1.MS(CI)m/z353(M+)。
经1H NMR的化学位移测量可能变化例如高至0.2ppm。经13HNMR的化学位移测量可能变化例如高至0.5ppm。分析质谱可能具有+/-0.3的实验误差。
纯度确定
通过HPLC测量产物的纯度。保留时间为2.22分钟的主峰表明纯度大于约80％、85％、90％、或95％。所使用的HPLC条件如下。
HPLC条件：
流动相A：13.3mM甲酸铵/6.7mM甲酸于水中的溶液
流动相B：6mM甲酸铵/3mM甲酸于水中的溶液/CH3CN(1/9，v/v)
柱：Synergi Fusion-RP100A Mercury,2x20mm,2.5微米
(Phenomenex Part No00M-4423-B0_CE)
梯度程序：RT＝2.22分钟
时间，分钟％相B流速，ml/min
01000.5
11000.5
2.5400.5
3.4400.5
3.51000.5
4.51000.5
还通过1H NMR测量产物的纯度，表明其是纯度大于90％或95％的单一化合物。本文所述的合成可以根据待合成的终产物进行修改。
合成例2：通过还原胺化而合成化合物
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将姜酮(5.00g，25.7mmol)溶于甲苯(250mL)并添加4-氯苄胺(4.73g，27.0mmol)。将混合物保持在氮氛下并在回流下加热16小时，通过Dean-Stark蒸馏去除水。这时，移除Dean-Stark阱并将反应混合物在冰浴上冷却到0℃。在大力搅拌下在30分钟内分批添加硼氢化钠(5g)于甲醇(100mL)中的溶液。当完成添加时，将混合物在回流下加热16小时。这时，将反应混合物冷却到室温并倒入饱和碳酸氢钠水溶液(300mL)。将所得混合物通过旋转蒸发浓缩并且水性残余物在水与氯仿之间分隔开。使氯仿层在无水硫酸钠上干燥，然后过滤和浓缩。然后使用硅胶柱层析采用5％氨-甲醇于氯仿中的溶液的流动相来纯化产物。将含有产物的部分合并和浓缩，然后在高真空下干燥过夜，以提供浅棕色油(6.16g,75％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ：7.30-7.24(m,4H),6.81(d,J＝7.8Hz,1H),6.66-6.62(m,2H),4.25(br s,2H),3.82(s,3H),3.82(d,J＝13.2Hz,1H),3.72(d,J＝13.2Hz,1H),2.73 (m,1H),2.66-2.51(m,1H),1.86-1.78(m,1H),1.72-1.63(m,1H),1.62-1.51(m,1H),1.17(d,J＝6.3Hz,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ：146.6,143.8,133.9132.8,129.9,129.7,128.6,120.8,114.5,110.9,55.8,51.9,50.2,38.5,31.9,31.6,29.7,26.9,22.6,19.9。MS(MH+)：m/z320。
经1H NMR的化学位移测量可能变化例如高至0.2ppm。经13HNMR的化学位移测量可能变化例如高至0.5ppm。分析质谱可能具有+/-0.3的实验误差。
纯度确定
通过HPLC测量产物的纯度。保留时间为2.22分钟的主峰表明纯度大于约80％、85％、90％、或95％。所使用的HPLC条件如下。
HPLC条件：
流动相A：13.3mM甲酸铵/6.7mM甲酸于水中的溶液
流动相B：6mM甲酸铵/3mM甲酸于水中的溶液/CH3CN(1/9，v/v)
柱：Synergi Fusion-RP100A Mercury,2x20mm,2.5微米
(Phenomenex Part No00M-4423-B0_CE)
梯度程序：RT＝2.22分钟
时间，分钟％相B流速，ml/min
01000.5
11000.5
2.5400.5
3.4400.5
3.51000.5
4.51000.5
还通过1H NMR测量产物的纯度，表明其是纯度大于90％或95％的单一化合物。本文所述的合成可以根据待合成的终产物进行修改。
合成例3
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步骤1：向4-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丁-2-酮(38.8g，200mmol)于THF(600mL)的溶液中添加Ti(OEt)4(136.9g，600mmol)和(S)-(-)-叔丁基亚磺酰胺(29g，240mmol)。将混合物在70℃搅拌16h，通过冰水猝灭，用EA(3x300mL)萃取，在Na2SO4上干燥，浓缩以得到粗产物，其通过柱层析(PE/EA:3/1)纯化以得到标题化合物2(35g，59％)。
步骤2：在0℃向化合物2(18g，60mmol)于THF(180mL)的溶液中添加三仲丁基硼氢化锂(L-selectride)(180mL，THF中1.0M，180mmol)。使反应在3h时间内温热至室温。经TLC对反应混合物进行分析显示起始亚胺2的完全消耗。然后通过添加水使溶液猝灭，并通过EA(3x200mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，并在真空下浓缩，以得到残余物，其通过柱层析(PE/EA:2/1)纯化以提供产物。继续用PE/EA(1:1)通过重结晶纯化产物以得到产物3(9.9g，55％)。通过HPLC确定ee值。
步骤3：向3(7.0g，23.4mmol)于MeOH(20mL)的溶液中添加HCl(MeOH中2M，20mL)，并将所得溶液在室温下搅拌3h时间。 对反应混合物的TLC分析显示化合物3的完全消耗。然后在真空下去除溶剂，并将所得残余物4直接用于下一步骤。
步骤4：向粗化合物4(5.4g，23.4mmol)于THF(100mL)的溶液中添加DIPEA(4.53g，35.1mmol)和4-三氟甲基苯甲醛5(4.28g，24.6mmol)。将所得溶液在室温搅拌10min。然后，添加NaBH(OAc)3(14.9g，70.2mmol)，并将混合物在40℃搅拌2h。使混合物经0℃水猝灭，过滤并通过EtOAc萃取。将有机层通过盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤，并在减压下浓缩滤液以提供残余物。将残余物通过柱层析(PE/EA＝1:2)纯化以得到产物6(7.0g，87％)。
步骤5：向6(1.0g，2.8mmol)于MeOH(5mL)的溶液中添加HCl(MeOH中2M，20mL)，然后将所得溶液在室温搅拌30min。去除溶剂以得到产物7a(1.1g，99％)，其为白色固体。化合物7b和7c通过用合适的苯甲醛替换化合物5来相似地制备。
m/z(ESI+)(M+H)+：7a[354.2]；7b[422.2]；7c[422.2]。
合成例4
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步骤l：在0℃向甲基溴化镁于THF(5mL)的溶液中添加1(1.0g，3.3mmol)于THF(5mL)的溶液。将混合物在室温搅拌4h，通过添加冰水猝灭，用乙酸乙酯(3x30mL)萃取，通过真空干燥以提供粗产物，其通过柱层析(PE/EA:3/1)纯化以得到化合物2(0.6g，58％)。
步骤2：在0℃向2于EA(10mL)的溶液中添加HCl(EA中2M，3mL)，所得溶液在室温下搅拌1小时。经TLC对反应混合物的分析显示2被完全消耗。真空浓缩，将粗产物直接用于下一步骤。
步骤3：随后向3(0.4g，1.9mmol)于THF(20mL)的溶液添加DIPEA(0.6g，4.6mmol)和三氟甲基苯甲醛(0.4g，2.3mmol)。将所得溶液在室温搅拌10min。添加三乙酰氧基硼氢化钠(1.63g,7.7mmol)，并将混合物在40℃搅拌2h。使混合物经0℃水猝灭，过滤，通过乙酸乙酯(3x40mL)萃取。将有机层用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤，并在减压下浓缩滤液以提供残余物。将残余物通过柱层析(PE/EA＝1:1)纯化以得到4(0.4g,57％)。
步骤4：向4于EA(10mL)的溶液中添加HCl(MeOH中2M，2mL)，并将所得溶液在室温下搅拌1h。在真空浓缩之后，将残余物用乙酸乙酯洗涤以提供5(0.4g，98％)。
m/z(ESI+)(M+H)+：5[368.2]。
合成例5
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步骤l：向化合物1(2g，6mmol)于MeOH(30mL)的溶液添加HCl(MeOH中2M，30mL)，并将所得溶液在室温搅拌3h。对反应混合物的TLC分析显示化合物1被完全消耗。然后在真空下去除溶 剂，将其直接用于下一步骤。
步骤2：向2(0.4g，2mmol)于THF(10mL)的溶液添加化合物3a(0.54g，2mmol)于THF(5mL)的溶液。添加Na2CO3(0.6g，6mmol)，并将所得溶液在60℃搅拌过夜。在浓缩之后，将残余物通过FCC纯化以得到化合物4(0.2g，30％)。
步骤3：向4于EA(5mL)的溶液添加HCl(MeOH中2M，3mL)，并将所得溶液在室温搅拌1h。在真空内浓缩之后，将残余物通过乙酸乙酯洗涤以得到化合物5(0.2g，95％)。化合物5b通过用合适的二苄基溴替换化合物3来相似地制备。
m/z(ESI+)(M+H)+：5a[332.1]；5b[366.1]。
合成例6
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步骤1：向化合物1(0.4g，1.3mmol)于MeOH(10mL)的溶液中添加HCl(MeOH中2M，10mL)，并将所得溶液在室温搅拌3h。对反应混合物的TLC分析显示化合物1被完全消耗。在真空中去除溶剂，并将其直接用于下一步骤。
步骤2：将化合物2(0.2g，1mmol)和3(0.2g，1mmol)溶于乙酸(10mL)，在100℃搅拌2h。将混合物冷却到室温，经水(10mL)猝灭，通过EtOAc(3x20mL)萃取，干燥，浓缩，以得到标题化合 物4(0.3g，76％)。
步骤3：向4(0.3g，0.7mmol)于THF(10mL)的溶液添加LAH(0.1g，3.5mmol)。将混合物在80℃搅拌3h。使混合物经水(0.1mL)、15％NaOH(0.1mL)和水(0.3mL)猝灭，过滤，浓缩。将粗产物通过柱层析(PE/EA＝5:1)纯化以得到化合物5(0.1g，39％)。
步骤4：向5于乙酸乙酯(5mL)的溶液添加HCl(MeOH中2M，3mL)并将所得溶液在室温搅拌1h。将反应通过真空浓缩以提供标题化合物6(0.16g，91％)。
m/z(ESI+)(M+H)+：6[366.2]。
合成例7
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步骤l：向1(0.278g，1.43mmol)于THF(20mL)的溶液添加Ti(OEt)4(2.1g，9.2mmol)和4-苄基哌啶(0.34g，1.3mmol)。将混合物在40℃搅拌一天，经冰水猝灭，用乙酸乙酯(3x20mL)萃取。在真空内浓缩之后，将粗产物通过柱层析(PE/EA:1/1)纯化以得到3(205mg，35％)。
步骤2：向3(0.2g，0.47mmol)于乙酸乙酯(5mL)的溶液添加HCl(MeOH中2M，3mL)并将所得溶液在室温搅拌1h。将反应通过真空浓缩以得到4a(0.2g，95％)。化合物4b-4w通过用合适的胺替换胺化合物2来相似地制备。
m/z(ESI+)(M+H)+：4a[354.3]；4b[409]；4c[368.2]；4d[346.1]；4e[278.50]；4f[264.05]；4g[322.10]；4h[338.05]；4i[316.15]；4j[372.10]；4k[328.25]；41[384.15]；4m[372.10]；4n[314.10]；4o[336.15]；4p[354.10]；4q[382.20]；4r[334.15]；4s[342.15]；4t[326.15]；4u[328.20]；4v[300.10]；4w[347.6]。
合成例8
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步骤1：向1(0.31g，1.43mmol)于THF(20mL)的溶液添加Ti(OEt)4(0.595g，2.58mmol)和N-(4-三氟甲基苯基)-哌嗪2(0.3g，1.3mmol)。将混合物在40℃搅拌24h，通过添加冰水猝灭，用乙酸乙酯(3x20mL)萃取，干燥。通过柱层析(PE/EA:1/1)的纯化得到产物3(0.25g，41％)。
步骤2：向化合物3(0.25g，0.58mmol)于乙酸乙酯(5mL)的溶液添加MeOH-HCl(2N，4mL)。将混合物在室温搅拌l h。真空内的浓缩得到化合物4(0.25g，95％)。化合物4b-4x通过用合适的胺替换胺化合物2来相似地制备。
m/z(ESI+)(M+H)+：4a[431.2]；4b[390.2]；4c[300.05]；4d[286.00]； 4e[344.05]；4f[362.00]；4g[338.05]；4h[394.10]；4i[350.05]；4j[406.05]；4k[394.15]；4l[336.05]；4m[358.05]；4n[378.05]；4o[445.20]；4p[356.10]；4q[364.10]；4r[348.05]；4s[350.10]；4t[322.10]；4u[369.2]；4v[309.00]；4w[308.95]；4x[309.00]。
合成例9
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步骤1：向1(3.5g，20mmol)于丙酮(20mL)和乙醇(2mL)的溶液添加NaOH水溶液(10％，15mL)和水(80mL)。将混合物在室温搅拌2h，用EA(3x50mL)萃取。将有机层干燥并浓缩以得到2(4.3g，100％)。
步骤2：向2(4.3g，20mmol)于MeOH(50mL)的溶液添加二苯硫醚(0.15mL)和Pd/C(10％，0.43g)。将混合物在25℃在1atm氢下大力搅拌24h。将反应混合物经硅藻土(Celite)垫过滤，用甲醇 洗涤，并将滤液浓缩以提供3(4.3g，99％)。
步骤3：向3(10g，46mmol)于THF(100mL)的溶液添加Ti(OEt)4(21g，92mmol)和(S)-(-)-叔丁基亚磺酰胺(6.1g，50mmol)。将混合物在70℃搅拌12h，经冰水猝灭，用乙酸乙酯(3x250mL)萃取。在真空浓缩之后，将粗产物通过柱层析(PE/EA:10/1)纯化以提供化合物4(8.1g，55％)。
步骤4：在0℃向化合物4(3.3g，10mmol)于THF(30mL)的溶液添加三仲丁基硼氢化锂(33mL，THF中1.0M，33mmol)。使反应在3h时间内温热至室温。经TLC对反应混合物的分析显示起始亚胺4被完全消耗。将溶液通过水猝灭，并通过乙酸乙酯(3x30mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，并在真空下浓缩以得到残余物，其通过柱层析(PE/EA:2/1)纯化以提供产物5(0.9g，27％)。
步骤5：向化合物5(5g，15.5mmol)于MeOH(10mL)的溶液添加HCl(MeOH中2M，10mL)并将所得溶液在室温搅拌3h。反应混合物的TLC分析显示化合物5被完全消耗。在真空中去除溶剂，并将粗6(3.95g，100％)直接用于下一步骤而不经进一步纯化。
步骤6：随后向6(0.6g，2.4mmol)于THF(10mL)的溶液添加DIPEA(0.4g，3.1mmol)和3-三氟甲基苯甲醛(0.41g，2.4mmol)。将所得溶液在室温搅拌10min。添加NaBH(OAc)3(1.0g，4.7mmol)并将混合物搅拌12h。将混合物经0℃水猝灭，过滤并通过EtOAc(3x30mL)萃取。将有机层用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤，并在减压下浓缩滤液以提供残余物。将残余物通过柱层析(PE/EA＝1:1)纯化以得到化合物8(0.4g，45％)。
步骤7：向8(0.4g，1.08mmol)于MeOH(5mL)的溶液添加HCl(MeOH中2M，4mL)并将所得溶液在室温搅拌0.5h。将反应浓缩以得到胺9a(0.4g，90％)。化合物9b-9e通过用合适的苯甲醛替换化合物7来相似地制备。
m/z(ESI+)(M+H)+：9a[444.2]；9b[326.25]；9c[376.2]；9d[344.2]；9e[376.1]。
合成例10
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步骤1：在0℃向甲基溴化镁于THF(3M，15mL)的溶液添加1(1.5g，4.6mmol)于THF(20mL)的溶液。将混合物在室温搅拌4h，经冰水猝灭，用乙酸乙酯(3x30mL)萃取。在浓缩之后，将粗产物通过柱层析(PE/EA：3/1)纯化以提供化合物2(0.6g，39％)。
步骤2：向化合物2(0.6g，1.8mmol)于乙酸乙酯(10mL)的溶液添加HCl(MeOH中2M，3mL)并将所得溶液在室温搅拌1h。对反应混合物的TLC分析显示出化合物2被完全消耗。然后在真空中去除溶剂，并将粗化合物3直接用于下一步骤。
步骤3：向3(0.43g，1.8mmol)于THF(20mL)的溶液相继添加DIPEA(0.54g，4.0mmol)和4-三氟甲基苯甲醛(0.36g，2.0mmol)。将所得溶液在室温搅拌10min。添加NaBH(OAc)3(1.57g，7.4mmol)并将混合物在40℃搅拌2h。将混合物经0℃水猝灭，过滤，通过EtOAc(3x30mL)萃取。将有机层通过盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩以提供残余物，其通过柱层析(PE/EA＝3:1)纯化以得到化合物4(0.3g，43％)。
步骤4：向4(0.3g，0.8mmol)于乙酸乙酯(10mL)的溶液添加HCl(MeOH中2M，2mL)并将所得溶液在室温搅拌1h。将析出物过滤，得到化合物5(0.25g，76％)。
m/z(ESI+)(M+H)+：5[390.14]。
合成例11
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步骤1：将化合物1(1.75g，5.43mmol)于MeOH-HCl(2M，10mL)的混合物在室温搅拌3h。将反应混合物在真空内浓缩，得到粗2，其用于下一步骤而不经进一步纯化。
步骤2：将化合物胺2(1.4g，5.43mmol)和酐3(1.18g，5.43mmol)于甲苯(12mL)中的溶液在130℃加热12h。
将混合物冷却到室温并添加水(10mL)，通过EtOAc(3x20mL)萃取，干燥，浓缩。将粗产物通过柱层析(PE/EA＝10:1)纯化得到产物4(0.78g，34％)。
步骤3：向化合物4(0.78g，1.87mmol)于THF(20mL)中的溶液中添加LAH(0.36g，9.1mmol)。将混合物在80℃搅拌3h。将冷却的混合物通过水(3.46mL)、15％NaOH(3.46mL)和水(13.5mL)猝灭。将反应混合物过滤，浓缩。将粗产物通过柱层析(PE/EA＝5:1)纯化得到产物5(0.16g，23％)。
步骤4：将化合物5(0.3g，0.8mmol)溶于乙酸乙酯(5mL)，添加MeOH-HCl(2N，3mL)。将混合物在室温搅拌l h，浓缩以得到化合物6(0.16g，89％)。
m/z(ESI+)(M+H)+：6[390.0]。
合成例12
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步骤1：向化合物1(0.4g，2mmol)于DMF(6mL)中的溶液中添加二溴化物2(0.6g，2mmol)。将所得溶液在80℃搅拌过夜，浓缩，通过制备型HPLC纯化，得到化合物3(0.1g，13％)。
步骤2：将化合物3(0.1g，0.2mmol)溶于乙酸乙酯(5mL)，添加MeOH-HCl(2N，3mL)。将混合物在室温搅拌l h。将混合物过滤以得到化合物4(0.11g，99％)。
m/z(ESI+)(M+H)+：4[388.1]。
合成例13
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步骤1：将姜黄油(100g)通过柱层析(PE:EA/100:1)纯化以提供粗产物1(60g)。
步骤2：将粗产物1(60g)溶于二噁烷(200mL)，添加DDQ(81.7g，360mmol)。将混合物在室温搅拌过夜，然后经水(500mL)猝灭，通过硅藻土垫过滤。将滤液通过乙酸乙酯(3x200mL)萃取。将有机层干燥，浓缩并通过柱层析(PE:EA/30：1)纯化以提供化合物2(15.6g，26％)。
步骤3：向2(7.4g，34.2mmol)于Ti(OEt)4(23.4g，102.6mmol)的溶液中添加(S)-(-)-2-甲基-2-丙亚磺酰胺。将混合物在70℃搅拌12h，经冰水猝灭，用乙酸乙酯(3x100mL)萃取，并干燥以得到残余物，其通过柱层析(PE/EA:5/1)纯化得到产物3(7.1g，64％)。
步骤4：在-78℃向化合物3(7.0g，21.9mmol)于THF(70mL)的溶液中添加DIBAL-H(22mL，THF中1.5M，33mmol)。将所得溶液在-78℃搅拌2h。经TLC对反应混合物的分析显示出起始亚胺的完全消耗，得到亚磺酰胺化合物4。将溶液经水猝灭，并通过乙酸乙酯(3x200mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，并浓缩以提供橙色油。使粗产物进行柱层析(PE:EA/3:1)以提供产物4(3.1g，43％)。
步骤5：向化合物4(1.6g，5.0mmol)于乙酸乙酯(10mL)的溶液中添加HCl-乙酸乙酯(2N，10mL)，并将所得溶液在室温搅拌3h。对反应混合物的TLC分析显示出化合物3被完全消耗。在真空中去除溶剂。将残余物溶于水(10mL)，并将pH通过K2CO3的饱和水溶液调整为9-10，通过乙酸乙酯(3x20mL)萃取，干燥，并浓缩以得到游离胺。将游离胺(1.1g，5.0mmol)溶于甲醇(15mL)。将D-酒石酸(0.75g，5.0mmol)添加到溶液。将混合物在回流下搅拌l h。将溶液缓慢冷却到室温。将所形成的结晶过滤，得到产物5(1.7g，93％)。Mp.172-174℃。通过X-射线结晶学确定化合物5的绝对立体化学。
步骤6：通过1M NaOH将化合物5(1.7g，4.6mmol)于水(20mL)中的溶液调节为pH9-10。将产物用乙酸乙酯(3x20mL)萃取。将有机层干燥，浓缩，以得到游离胺。将游离胺溶于THF(10mL)中，添 加异丁胺(0.40g，5.5mmol)和NaBH(OAc)3(3.90g，18.4mmol)。将混合物在室温搅拌12h，用水猝灭，通过乙酸乙酯(3x30mL)萃取。将有机层干燥，浓缩，并通过柱层析(PE:EA/3:1)纯化以提供产物6(0.9g，72％)。
步骤7：向化合物6(0.9g，3.2mmol)于乙酸乙酯(10mL)的溶液中添加乙酸乙酯-HCl(2N，5mL)。将混合物在室温搅拌lh。在真空中去除乙酸乙酯，得到化合物7(0.95g，96％)。
m/z(ESI+)(M+H)+：7[274.20]。
合成例14
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步骤1：向1(7.4g，34.2mmol)于Ti(OEt)4(23.4g，102.6mmol)的溶液中添加(R)-(+)-2-甲基-2-丙亚磺酰胺。将混合物在70℃搅拌12h，经冰水猝灭，用乙酸乙酯(3x100mL)萃取，干燥。通过柱层析(PE/EA:5/1)纯化，得到产物2(6.9g，63％)。
步骤2：将化合物2(7.0g，21.9mmol)溶于THF(70mL)并冷却到-78℃。然后向容器中添加DIBAL-H(22mL，THF中1.5M，33mmol)，并将所得溶液在-78℃搅拌2h。经TLC对反应混合物的分析显示出起始亚胺的完全消耗，得到亚磺酰胺化合物3。然后将溶液经水猝灭并通过乙酸乙酯(3x200mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，并在真空下浓缩以提供橙色油。使粗产物进行柱层析(PE:EA/3:1)以提供产物3(2.5g，36％)。
步骤3：向3(2.5g，7.8mmol)于乙酸乙酯(10mL)的溶液中添加2M HCl于乙酸乙酯(10mL)中的溶液，并将所得溶液在室温搅拌3h。对反应混合物的TLC分析显示出化合物3被完全消耗。真空去除溶剂。将残余物溶于水(10mL)中，通过添加饱和K2CO3将其pH调节为9-10。将混合物通过乙酸乙酯(3x20mL)萃取，干燥，浓缩，以得到游离胺4。将游离胺4溶于甲醇(15mL)，添加L-酒石酸(1.17g，7.8mmol)。将混合物在回流下搅拌1h，冷却到室温，过滤以得到结晶盐4(2.5g，87％)。
步骤4：将L-酒石酸盐4(2.5g，6.8mmol)溶于水(20mL)，通过添加1M NaOH将其pH调节为9-10。然后将混合物通过乙酸乙酯(3x50mL)萃取，干燥，浓缩以得到游离胺4。将游离胺4再溶解于THF，添加异丁胺(0.60g，8.2mmol)和NaBH(OAc)3(5.85g，27.6mmol)。将混合物在室温搅拌12h，经水猝灭，通过乙酸乙酯(3x30mL)萃取。将有机层干燥，浓缩，并通过柱层析(PE:EA/3:1)纯化以提供产物5(0.83g，45％)。
步骤5：向5(0.83g，3.0mmol)于乙酸乙酯(10mL)的溶液中添加HCl(乙酸乙酯中2M，5mL)，并将所得溶液在室温搅拌1h。去除溶剂以得到产物6(0.88g，94％)。
m/z(ESI+)(M+H)+：6[274.20]
所有在说明书(包括摘要和附图)中公开的特征、以及所有在任意所公开方法或工序中的步骤可以以任意组合进行结合，除其中至少一些特征和/或步骤相互排斥的组合之外。在说明书(包括摘要和附图)中公开的各个特征可以用提供相同、等同或相似目的的可替代特征进行替换，除非明确指出相反情况。因此，除非明确指出相反情况，所公开的各个特征仅是通用系列的等同或相似特征的一个实例。基于上述说明，除本文记载的那些外的本发明的多种修改对于本领域技术人员将是明显的。这些修改也意在落入所附权利要求的范围内。
所有本文提及的公开物全部并入本文以作参考。本文中没有事物构成对本发明由于先前发明而没有早于这些公开的资格的承认。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种式I的化合物及其药学上可接受的盐：
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其中
R1和R2独立选自H、OH、卤素、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、(R16)(R17)N-C1-4亚烷基-O-，或R1和R2连接在一起形成-O-亚乙基-O-基，其中
R16和R17独立地为C1-4烷基或苄基，或R16和R17与氮一起形成选自![]()
和![]()
的环，其中
X是N或O且R18是H或未被取代的苯基；且
其中R1和R2的至少一个不是H；
R3选自
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和![]()
其中
R6、R7、R8、R9和R10独立选自H、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基和S(O)2-C1-6烷基；
R20是H；且
n是1-4
R4是C1-6烷基；
R4’是H或C1-6烷基；且
R5是H、C1-6烷基和C(O)O(C1-4烷基)、C(O)(C1-4烷基)或C(O)(C1-4卤代烷基)；或
R3和R5与氮一起形成选自
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和![]()
的环，其中
R11和R12独立选自H、卤素和C1-6卤代烷基，且
Y是CH或N；
R13是H、C1-6烷基、C3-6环烷基、未被取代的苯基或被C1-6卤代烷基取代的苯基、或未被取代的苄基；
R14和R15独立选自H和卤素；
R19是H，
条件是排除以下化合物的外消旋混合物
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和![]()
2.如权利要求1所述的化合物及其药学上可接受的盐，其中
R1和R2独立选自H、OH、卤素、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、(R16)(R17)N-C1-4亚烷基-O-，或R1和R2连接在一起形成-O-亚乙基-O-基，其中
R16和R17独立地为C1-4烷基或苄基，或R16和R17与氮一起形成选自![]()
和![]()
的环，其中
X是N或O且R18不存在或者是H或未被取代的苯基；且
其中R1和R2的至少一个不是H；
R3选自
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![]()
和![]()
其中
R6、R7、R8、R9和R10独立选自H、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基和S(O)2-C1-6烷基；
R20是H；且
n是1-4
R4是C1-6烷基；
R4’是H或C1-6烷基；且
R5是H、C1-6烷基和C(O)O(C1-4烷基)、C(O)(C1-4烷基)或C(O)(C1-4卤代烷基)；或
R3和R5与氮一起形成选自
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和![]()
的环，其中
R11和R12独立选自H、卤素和C1-6卤代烷基，且
Y是CH或N；
R13是H、C1-6烷基、C3-6环烷基、未被取代的苯基或被C1-6卤代烷基取代的苯基、或未被取代的苄基；
R14和R15独立选自H和卤素；且
R19是H。
3.如权利要求1所述的化合物及其药学上可接受的盐，其中
R1选自OH、OMe、F、Cl、CF3、(R16)(R17)N-亚乙基-O-，其中
R16和R17各自是甲基、异丙基、正丁基或苄基，或R16和R17与氮一起形成选自![]()
或![]()
的环，其中
X是N或O且R18不存在或是未被取代的苯基；且
R2是H、Cl、F、CF3、OMe、OCF3或
R1和R2连接在一起形成-O-亚乙基-O-基
R3选自
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和![]()
其中
R6是H、F、Cl、Me、异丙基、叔丁基、OMe、CF3、或S(O)2Me，
R7和R8独立为H、OMe、F、Cl或CF3；
R9和R10独立选自H、OMe、F和Cl，
R20是H；且
n是1
R4是Me；
R4’是H或Me；且
R5是H；或
R3和R5与氮一起形成选自
![]()
和![]()
的环，其中
R11和R12独立选自H、Cl和CF3，且
Y是CH或N；
R13是H、Me、环己基、未被取代的苯基或被CF3取代的苯基、或未被取代的苄基；
R14和R15独立选自H和Cl；且
R19是H。
4.如权利要求1所述的化合物及其药学上可接受的盐，其中
R1选自OH、OMe、F、Cl、CF3、(R16)(R17)N-亚乙基-O-，其中
R16和R17各自是甲基、异丙基、正丁基或苄基，或R16和R17与氮一起形成选自![]()
或![]()
的环，其中
X是N或O且R18不存在或是未被取代的苯基；且
R2是H、Cl、F、CF3、OMe、OCF3或
R1和R2连接在一起形成-O-亚乙基-O-基
R3选自
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其中
R6是H、F、Cl、Me、异丙基、叔丁基、OMe、CF3、或S(O)2Me,
R7和R8独立地为H、OMe、F、Cl、或CF3；
R9和R10独立选自H、OMe、F、和Cl，且
n是1
R4是Me；
R4’是H；且
R5是H；或
R3和R5与氮一起形成选自
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和![]()
的环，其中
R11和R12独立选自H、Cl、和CF3，且
Y是CH或N；
R13是H、Me、环己基、未被取代的苯基或被CF3取代的苯基、或未被取代的苄基；
R14和R15独立选自H和Cl；且
R19是H。
5.如权利要求1所述的化合物及其药学上可接受的盐，所述化合物为式Ia的化合物
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其中R4’是H且剩余基团如权利要求1中所限定。
6.一种式IIa的化合物或其药学上可接受的盐：
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其中
R1＝卤素、C1-6卤代烷基或OH；
R2＝H、卤素或C1-6卤代烷基，或R1和R2连接在一起形成-O-亚乙基-O-基；
R3＝C1-6卤代烷基；且
R4＝C1-6烷基。
7.如权利要求6所述的化合物及其药学上可接受的盐，其中
R1＝Cl、F、CF3、或OH；
R2＝H、Cl、F、CF3，或R1和R2连接在一起形成-O-亚乙基-O-基；
R3＝CF3；且
R4＝甲基。
8.如权利要求6所述的化合物及其药学上可接受的盐，所述化合物为式IIb的化合物
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其中R1-R4如权利要求6中所限定。
9.一种化合物，选自
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及其药学上可接受的盐。
10.如权利要求9所述的化合物，选自
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11.一种式VIIIa的化合物及其药学上可接受的盐
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其中：
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是单键或双键；
R1是C1-6烷基、C1-6卤代烷基、未被取代的苄基或被卤素、C1-6烷基或C1-6卤代烷基取代的苄基；
R2是H，或
R1和R2与氮一起形成环![]()
其中
X是CH、N或O，且
R4不存在，或是H、C1-6烷基、或未被取代的苯基或被卤素、C1-6烷基、或C1-6卤代烷基取代的苯基；且
R3是C1-4烷基、卤素、或C1-6卤代烷氧基，
条件是排除以下化合物的外消旋混合物：
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12.如权利要求11所述的化合物及其药学上可接受的盐，其中
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是单键或双键；
R1是异丁基、苄基、或被氯、甲基或CF3取代的苄基；
R2是H，或
R1和R2与氮一起形成环![]()
其中
X是CH、N、或O，且
R4不存在，或是H、异丙基、或未被取代的苯基；且
R3是邻-Me、间-Me、对-Me、对-F、对-OCF3。
13.如权利要求11所述的化合物及其药学上可接受的盐，所述化合物具有式VIIIb
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其中R1-R3如权利要求11中所限定。
14.如权利要求11所述的化合物及其药学上可接受的盐，所述化合物具有式VIIIc
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其中R1-R3如权利要求11中所限定。
15.一种化合物，选自
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及其药学上可接受的盐。
16.如权利要求15所述的化合物，选自
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和![]()
17.一种用于抑制神经元细胞上的β淀粉样蛋白效应的方法/用途，包括施用有效量的组合物，所述组合物包括，
如权利要求1-16中任一项所述的化合物，含量为有效抑制β淀粉样蛋白寡聚体在所述细胞中的结合；以及
药学上可接受的载体。
18.如权利要求17所述的方法/用途，其中以在所述细胞中还有效抑制膜运输缺陷的量施用所述化合物，所述膜运输效应与所述细胞暴露于可溶β淀粉样蛋白寡聚体相关联。
19.如权利要求17和18中任一项所述的方法/用途，其中所述化合物的含量为在所述细胞中同时有效抑制与所述细胞暴露于可溶β淀粉样蛋白寡聚体相关联的寡聚体结合和突触丧失。
20.如权利要求17～19中任一项所述的方法/用途，其中以有效抑制可溶β淀粉样蛋白寡聚体所介导的认知效应的量施用所述化合物。
21.如权利要求20所述的方法/用途，其中所述认知效应是在认知衰退的动物模型中所测试的认知衰退。
22.如权利要求21所述的方法/用途，其中所述认知衰退是通过条件性恐惧检定所测试的学习衰退。
23.如权利要求21所述的方法/用途，其中所述认知衰退是通过Morris水迷宫测试所测试的空间学习和记忆的衰退。
24.如权利要求21所述的方法/用途，其中所述认知衰退是在阿尔茨海默病的转基因动物模型中所测试的基于海马的空间学习和记忆的衰退。
25.如权利要求17所述的方法/用途，其用于抑制神经元细胞的β淀粉样蛋白寡聚体所诱导的突触功能障碍，包括使所述细胞与包括含量为在所述细胞中有效抑制β淀粉样蛋白寡聚体结合的σ-2受体拮抗剂化合物的组合物接触，所述功能障碍与所述细胞暴露于可溶β淀粉样蛋白寡聚体相关联。
26.如权利要求17所述的方法/用途，其用于抑制受试者中长时程增强效应的压制，包括对需要的受试者施用治疗有效量的包括σ-2受体拮抗剂化合物的组合物。
27.如权利要求17所述的方法/用途，其用于抑制表现出认知衰退或具有表现出认知衰退的风险的受试者中的认知衰退，包括对所述受试者施用治疗有效量的包括σ-2受体拮抗剂化合物的组合物。
28.如权利要求17所述的方法/用途，其用于抑制受试者中与中枢神经元上的β淀粉样蛋白寡聚体效应相关联的认知衰退，包括对遭受所述认知衰退的受试者施用治疗有效量的包括σ-2受体拮抗剂化合物的组合物。
29.如权利要求17所述的方法/用途，其用于治疗需要的受试者中的阿尔茨海默病中的轻度认知障碍，包括对所述受试者施用治疗有效量的包括σ-2受体拮抗剂化合物的组合物。
30.如权利要求25～27中任一项所述的方法/用途，其中所述σ-2拮抗剂化合物具有一个或多个以下额外特性：
(a)相比于一种或多种非σCNS受体，其以高出至少10倍、20倍、50倍或100倍的亲和性与σ-2受体选择性结合，其中所述化合物以小于200nM、150nM、100nM或60nM的Ki与σ-2受体结合；
(b)其抑制Abeta寡聚体结合至神经元细胞或神经元细胞中的突触丧失，所述丧失与所述细胞暴露于Abeta寡聚体相关联；
(c)其抑制中枢神经元中的膜运输异常，所述异常与所述细胞暴露于一种或多种Abeta寡聚体相关联；
(d)在不存在β淀粉样蛋白寡聚体的情况下，其不能影响中枢神经元中的运输或突触数目。
31.如权利要求11所述的化合物及其药学上可接受的盐，其根据式VIIIa
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其中：
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是单键或双键；
R1是C1-6烷基、C1-6卤代烷基、未被取代的苄基或被卤素、C1-6烷基或C1-6卤代烷基取代的苄基；
R2是H，或
R1和R2与氮一起形成环![]()
其中
X是CH、N、或O，且
R4不存在，或是H、C1-6烷基、或未被取代的苯基或被卤素、C1-6烷基、或C1-6卤代烷基取代的苯基；且
R3是C1-4烷基、卤素、或C1-6卤代烷氧基，条件是排除以下化合物的外消旋混合物及其拆分得到的单一化合物
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32.如权利要求15所述的化合物，选自
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及其药学上可接受的盐。