通过发酵生产非蛋白原L-氨基酸的方法 本发明涉及通过微生物直接发酵生产非蛋白原(non-proteinogenic)L-氨基酸的方法，并涉及由该方法得到的L-氨基酸。
非蛋白原氨基酸是在自然界不用作蛋白质生物合成构件的氨基酸，因此可清楚地与20种蛋白原氨基酸区分。它们优选是β-取代的L-丙氨酸衍生物。
非蛋白原氨基酸是令人感兴趣的用以制备药物和农业活性化合物的化合物。作为活性化合物或作为活性化合物的一部分，它们可以以一种分子拟态模仿天然氨基酸的结构而因此例如在受体相互作用中导致天然反应的调变。此外，在“手性库”情况中，它们通常作为手性化合物的构件。
以往光学纯形式的非蛋白原氨基酸的生产方法通常是基于复杂的合成，其通常仅可制得限定的化合物。仅有少数方法可通过替换起始原料而制得不同的化合物。
绝大多数情况涉及化学合成，化学合成自身大多数从手性构件起始，或继之以消旋体分离。
或者，描述了一些酶方法。因此，利用转氨酶，使用L-谷氨酸作为氨基给体，由α-酮酸可制得各种非蛋白原氨基酸。另一不同的方法是利用乙内酰脲与氨甲酰酶组合。但酶方法也是高成本的，因为必须提供相应地酶，而且它们作为催化剂仅具有有限的寿命(Rehm等，Biotechnology 1996；第6卷，第505至560页)。
相反地，通过微生物直接发酵以生产非蛋白原氨基酸的方法则特别简单而有利。但这种方法的风险是所生产的非蛋白原氨基酸干扰天然氨基酸的代谢，这样发生生长抑制。在此技术领域内，先前曾公开了D-氨基酸直接发酵的方法(WO98/14602)。该申请描述了通过重组微生物生产D-氨基酸，该重组微生物内已引入D-氨基转移酶基因和L-氨基脱氨酶基因。再者，Saito等(Biol.Pharm.Bull.1997，20：47-53)描述了通过在大肠杆菌中表达植物基因以生产植物非蛋白原氨基酸L-吡唑基丙氨酸。但以商业生产而言，收率太低，其小于1克/升，而且以所述L-丝氨酸作为起始原料，成本极高。
本发明的目的是提供通过直接发酵生产一系列非蛋白原L-氨基酸的有效方法。
该目的通过本领域已知的微生物菌株实现，该微生物菌株具有去调节(deregulated)半胱氨酸代谢，其被以本领域已知的方式发酵，所述方式包括在发酵期间，向发酵混合物中添加亲核化合物，添加的量使该微生物菌株生产非蛋白原L-氨基酸。
优选地，在发酵终止时，通过本领域已知的方法，将非蛋白原L-氨基酸自相应的发酵混合物中分离出来。
令人惊奇的是，发现在具有去调节半胱氨酸代谢的微生物菌株的发酵中，代替硫化物，一系列其它亲核化合物极为有效地进入氨基酸代谢中，而且相应的反应产物被分泌至培养基内。有利地，在此葡萄糖可用作廉价的碳源。
在发酵期间，通过本发明所添加的亲核化合物，相应地形成非蛋白原L-氨基酸。所以，优选地，在发酵期间添加进入氨基酸代谢的亲核化合物。
优选地，添加包括选自下列的基团的亲核化合物H-S-、
特别优选地，将选自以下组的亲核化合物加入发酵混合物：- 具有通式(1)的硫醇
H-S-R1 (1)其中R1是单价的取代或未取代的、最多具有15个碳原子的烷基、烷氧基、芳基或杂芳基- 具有通式(2)或(3)的唑和它们的酯、醚或盐，其中X和Y相同或不同，且代表CR4或N，而且R4是-H、-COOH、-OH、-NH2、-NO2-、-SH、-SO3-、-F、-Cl、-Br、-I、C1-C5烷基羰基或R1，且R1具有在通式(1)中指明的含义，且其中R2和R3相同或不同，且是R4或其中通式(3)中的C1和C2，而不是取代基R2和R3，通过[-CR5R6-]。桥连接，其中a是1、2、3、或4，而形成环，其中R5和R6相同或不同且是R4，并且一个或多个非相邻[-CR5R6-]基团可以被氧、硫、或亚氨基代替，该亚氨基可以是未取代的或被C1-C5烷基取代的，而且两个相邻[-CR5R6-]基团可以被[-CR5＝CR6-]基团或[-CR5＝N-]基团代替。- 具有通式(4)或(5)的异噁唑啉酮和它们的酯、醚或盐，其中X、R1、R2、R3具有以上所指明的含义且通式(5)中的C1和C2，而不是取代基R2和R3，可通过通式(3)中定义的桥连接而形成环。
硫醇类的实例是选自以下的化合物：2-巯基乙醇、3-巯基丙醇、3-巯基丙酸、3-巯基-1-丙磺酸、巯基乙磺酸、2-巯基乙胺、硫代羟基乙酸、硫代乳酸、硫代乙酸、巯基琥珀酸、巯基丙酮酸、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、1-硫代甘油、苯硫酚、4-氟苯硫酚、4-巯基苯酚、对-硫甲苯酚、5-硫-2-硝基苯甲酸、2-巯基噻唑、2-巯基噻唑啉、2-巯基咪唑、3-巯基-1，2，4-三唑、2-噻吩硫醇、2-巯基吡啶、2-巯基嘧啶、2-硫胞嘧啶、2-巯基烟酸、2-巯基-1-甲基咪唑、2-巯基苯并噻唑、2-巯基苯并噁唑、6-巯基嘌呤。
唑类的实例是选自以下的化合物：1，2-吡唑、3-甲基吡唑、4-甲基中吡唑、3，5-二甲基吡唑、3-氨基吡唑、4-氨基吡唑、吡唑-4-羧酸、吡唑-3，5-二羧酸、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、3-氨基-1，2，4-三唑、1，2，3，4-四唑、吲唑、吲唑-3-羧酸、吲唑-5-羧酸、5-氨基-吲唑、苯并三唑、苯并三唑-5-羧酸、5-氨基苯并三唑、氨基-吡唑-嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤。
异噁唑啉酮类的实例是选自以下的化合物：异噁唑啉-2-酮、4-甲基-异噁唑啉-2-酮、5-甲基-异噁唑啉-2-酮、4，5-二甲基-异噁唑啉-2-酮、1，2，4-噁二唑烷-3，5-二酮(1，2，4-oxadiazolidin-3，5-dione)。
具有去调节半胱氨酸代谢，可用于本发明方法的微生物菌株是已有技术中已知的。它们的特点是O-乙酰基-L-丝氨酸，即L-半胱氨酸的直接生物合成前体的内源生成与野生型菌株相比有所增加。如已知的，微生物中，在半胱氨酸生物合成的最后步骤中，由于O-乙酰基-丝氨酸-硫化氢解酶的活性，O-乙酰基-L-丝氨酸的乙酰基官能团被硫醇官能团取代，这样形成L-半胱氨酸。该反应类型被称为β-取代，因为氨基酸的β-碳原子上官能团被取代。
优选地，本发明方法使用下列微生物菌株之一：- 具有修饰cysE等位基因的菌株，例如，如WO97/15673(该文
献引入本文作参考)或Nakamori S.等1998，Appl.Env.
Microbiol.，64：1607至1611页(该文献引入本文作参考)或
Takagi H.等1999，FEBS Lett.，452：323至327页所述，或- 含有外流基因(efflux gene)的菌株，例如，如EP0885962 A1
(相当于系列号为SN09/097759的美国专利申请(该文献引入
本文作参考))所述，或- 具有修饰CysB活性的菌株，如德国专利申请DE19949579所
述，或- 利用非特异性突变发生方法结合半胱氨酸超量生产或降低的半
胱氨酸降解的筛选方法生产的菌株，例如，如WO97/15673或
Nakamori S.等1998，Appl.Env.Microbiol.，64：1607至1611
页所述。
这些菌株的特点是，在无机硫源，例如，硫酸盐或硫代硫酸盐的适当供应下，它们分泌大量L-半胱氨酸或其衍生物至培养基内。作为发酵期间本发明添加亲核化合物的结果，该化合物进入β-取代，结果生成非蛋白原L-氨基酸。
用没有去调节半胱氨酸代谢的微生物菌株(例如普通野生型微生物)，这种程序导致半胱氨酸生物合成的减慢，从而导致生长抑制作用。所以，没有大量非蛋白原氨基酸形成。
但本发明所用的菌株具有去调节半胱氨酸代谢，因而具有O-乙酰基-L-丝氨酸的高内源水平，所以可能生产大量非蛋白原L-氨基酸。同时，为保证微生物的细胞生长，仍保证有足量L-半胱氨酸形成。
所用的微生物菌株优选为具有去调节半胱氨酸代谢的大肠杆菌种。
优选地，这些大肠杆菌菌株是如WO97/15673或EP0885962 A1(相当于系列号为SN09/097759的美国专利申请)或DE19949579所述的大肠杆菌菌株。根据这些专利申请所述的方法，通过用带有例如抗反馈cysE等位基因和/或外流基因的质粒转化，半胱氨酸代谢可在任何菌株内被去调节。
本发明使用微生物菌株生产非蛋白原L-氨基酸的方法是以本领域已知的的方式在发酵罐内进行，但另外添加亲核化合物。
微生物菌株在发酵罐内呈连续培养物、分批培养物，或优选地呈补料分批培养物生长。特别优选地，在发酵期间连续添加碳源和亲核化合物。
在接种后开始添加亲核化合物，或者优选地，在初始生长期之后开始添加。特别优选地，在发酵开始后6至8小时开始添加且持续至发酵终止。
亲核化合物的添加量取决于其对微生物的毒性且在每升发酵培养基初始体积10至1000毫摩尔的范围内，特别优选为每升发酵培养基初始体积添加50至500毫摩尔。
发酵的碳源优选为糖类、糖醇类或有机酸类。在本发明的方法中，所用碳源特别优选为葡萄糖、乳糖或甘油。
优选地，葡萄糖以确保发酵期间发酵罐内的葡萄糖含量保持在0.1至50克/升的范围内，特别优选为0.5至10克/升的方式添加。
本发明方法中所用的氮源优选为氨、铵盐，或蛋白质水解产物。
其它可添加的培养基添加剂是磷、硫、氯、钠、镁、氮、钾、钙、铁等元素的盐，以及痕量(即微摩尔/升)钼、硼、钴、锰、锌和镍等元素的盐。
此外，培养基内可添加有机酸(例如乙酸、柠檬酸)、氨基酸(例如异亮氨酸)，以及维生素(例如B1、B6)。
可用的复合营养源是，例如酵母提取物、玉米浆、大豆粉或麦芽汁。
发酵培养基的pH为4至10，优选为6至8，特别优选为6.5至7.5。
培养温度为15至45℃，优选为30至37℃。
发酵优选在有氧生长条件下进行。用压缩空气或纯氧将氧引入发酵罐中。
在1至4天的发酵时间内，根据所述方法发酵的微生物高效地将相应的非蛋白原L-氨基酸分泌至培养基内。
当添加亲核物质时，在发酵期间，具有去调节半胱氨酸代谢的微生物分泌具有通式(6)、呈L-构型的非蛋白原氨基酸：其中Z是选自通式(7)至(13)的单价基团和它们的酯、醚或盐-S-R1(7)，且R1、R2、R3、R4、X和Y具有在通式(1)至(5)中指明的含义。
本发明的方法首次使生产1，2，3，4-四唑基-L-丙氨酸和其衍生物，以及1，2，3-三唑基-L-丙氨酸酸和其衍生物族的化合物成为可能。优选地，这些化合物分别为异构体形式的1，2，3，4-四唑-1-基-L-丙氨酸(14)和1，2，3，4-四唑-2-基-L-丙氨酸(15)和它们的衍生物，包含它们的酯、醚或盐，以及1，2，3-三唑-1-基-L-丙氨酸(16)和1，2，3-三唑-2-基-L-丙氨酸(17)和它们的衍生物，包括它们的酯、醚和盐。其中R1、R2、R3和R4具有在通式(1)至(5)中指明的含义。
本发明的方法还首次使生产S-杂芳基-L-半胱氨酸族化合物成为可能。这些化合物在所有情况下是具有游离氨基和/或羧酸官能团的氨基酸化合物。S-杂芳基-L-半胱氨酸意为半胱氨酸衍生物，其特征是，S原子被R7基取代。此处R7是具有芳香性的杂芳基，是单环或双环，而且除碳原子之外，环内有至少一个杂原子。杂原子的实例是氮、氧或硫。杂芳基本身可被R4基取代，其中R4具有在通式(2)中指明的含义。
杂芳基的实例是吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、苯并咪唑基、苯并三唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基或嘌呤基。
所以本发明涉及所述化合物。
特别优选的化合物是：- 1，2，3，4-四唑-1-基-L-丙氨酸(R4＝H)，- 1，2，3，4-四唑-2-基-L-丙氨酸(R4＝H)，- 1，2，3-苯并三唑-1-基-L-丙氨酸(R2和R3相同且是[-CR5＝CR6-]，
其中R5和R6是H且R2和R3相连接而形成芳环)，- 1，2，3-苯并三唑-2-基-L-丙氨酸(R2和R3相同且是[-CR5＝CR6-]，
其中R5和R6是H且R2和R3相连接而形成芳环)，- 5-羧基-1，2，3-苯并三唑-1-基-L-丙氨酸(R2和R3不同且是[-CR5＝CR6-]
，其中对于R3，R5和R6是H，对于R2，R5是H且R6
是-COOH，而且R2和R3相连接而形成芳环)，- 5-羧基-1，2，3-苯并三唑-2-基-L-丙氨酸(R2和R3不同且是[-CR5＝CR6-]
，其中对于R3，R5和R6是H，对于R2，R5是H且R6
是-COOH，而且R2和R3相连接而形成芳环)，- 1，2，4-三唑-3-基-L-半胱氨酸，- 噻唑-2-基-L-半胱氨酸，- 咪唑-2-基-L-半胱氨酸，- 噻吩-2-基-L-半胱氨酸，- 吡啶-2-基-L-半胱氨酸，- 嘧啶-2-基-L-半胱氨酸，- 苯并噻唑-2-基-L-半胱氨酸，- 苯并噁唑-2-基-L-半胱氨酸。
优选地，经与生物质分离后，通过已知方法(例如过滤、离心)将产物自培养基上清液中分离出来。这些分离氨基酸的方法对本领域人员而言也是已知的。它们包括，例如萃取、吸附、离子交换色谱、沉淀、结晶。
通过以下实施例对本发明做进一步的说明。进行这些实施例所用的细菌菌株大肠杆菌(E.coli)W3110/pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306依照布达佩斯条约，保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心，D-38124，不伦瑞克)，保藏号为DSM13495，保藏日期为2000年5月19日。实施例1：生产菌株的预培养物
作为发酵的预培养物，将20毫升LB培养基(10克/升胰蛋白胨，5克升酵母萃取物，10克/升NaCl)，其另外含有15毫克/升四环素，用菌株W3110/pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306(在EP0885962 A1，其相当于系列号为SN09/097759的美国专利申请(该文献引入本文作参考)中有描述)接种并于30℃和每分钟150转下在摇动器内培养。七小时后，整个批次转移至100毫升SM1培养基(12克/升K2HPO4；3克/升KH2HPO4；5克/升(NH4)2SO4；0.3克/升MgSO4·7H2O；0.015克/升CaCl2·2H2O；0.002克/升FeSO4·7H2O；1克/升二水合柠檬酸三钠；0.1克/升NaCl；1毫升/升由0.15克/升Na2MoO4·2H2O、2.5克/升Na3BO3、0.7克/升CoCl2·6H2O、0.25克/升CuSO4·5H2O，1.6克/升MnCl2·4H2O、0.3克/升ZnSO4·7H2O组成的痕量元素溶液)，其中补充了5毫克/升葡萄糖；0.5毫克/升维生素B1和15毫克/升四环素。在30℃和每分钟150转下进一步培养17小时。实施例2：通过发酵生产S-[2，3-二羟基-4-巯基-丁基]-L-半胱氨酸
所用发酵罐是最大培养容积2升、Braun Biotech(Melsungen，德国)出品的BiostatM仪器。使用实施例1所述的预培养物(在600纳米处光密度约为3)，将发酵罐用900毫升发酵培养基(15克/升葡萄糖；10克/升胰蛋白胨；5克/升酵母提取物；5克/升(NH4)2SO4；1.5克/升KH2PO4；0.5克/升NaCl；0.3克/升MgSO4·7H2O；0.015克/升CaCl2·2H2O；0.075克/升FeSO4·7H2O；1克/升二水合柠檬酸三钠和1毫升/升参见以上的微量元素溶液，5毫克/升维生素B1和15毫克/升四环素，用25％氨水浆pH调至7.0)接种。在发酵期间，温度设定在32℃并通过添加25％氨水将pH保持恒定在7.0。用经消毒的压缩空气以1.5体积/体积/分钟处理培养物并以每分钟200转的搅拌速度搅拌。氧饱和度降至50％后，通过控制装置将速度升至每分钟1200转，以保持50％氧饱和度(用氧分压探测器(pO2 probe)测定，并在每分钟900转下校正至100％饱和)。八小时后，以每小时2毫摩尔的速度将1摩尔/升的二硫苏糖醇溶液加入。在发酵罐内的含量由初始的15克/升降至约5至10克/升时，立即自56％储备液施加葡萄糖。添加葡萄糖的流速为8至14毫升/小时，其保持葡萄糖浓度恒定于0.5至10克/升。葡萄糖含量利用YSI(YellowSpring，俄亥俄州，美国)出品的萄糖糖分析器测定。
发酵时间为48小时。于此时间过后，取出样品并通过离心将细胞自培养基中除去。通过在LUNA 5μC18(2)柱(Phenomenex，Aschaffenburg，德国)上的反相高效液相色谱将所得培养物上清液分部分离。所用洗脱液是稀磷酸(0.1毫升浓磷酸/升)，流速为0.5毫升/分钟。S-巯基二羟基丁基-L-半胱氨酸的保留时间为86.7分钟。收率为2.5克/升。实施例3：通过发酵生产S-苯基-L-半胱氨酸
依照实施例1和2所述培养细菌。八小时后，以2毫摩尔/小时的速度添加1摩尔/升的苯硫酚钠悬浮液。
使用实施例2所述的高效液相色谱法，S-苯基-L-半胱氨酸的保留时间为88分钟。收率为2.1克/升。实施例4：通过发酵生产1，2-吡唑基-L-丙氨酸
依照实施例1和2所述培养细菌。八小时后，以4毫摩尔/小时的速度添加1摩尔/升的1，2-吡唑溶液。
使用实施例2所述的高效液相色谱法，1，2-S-吡唑基-L-丙氨酸的保留时间为8.4分钟。收率为6.1克/升。实施例5：通过发酵生产1，2，4-三唑基-L-丙氨酸
依照实施例1和2所述培养细菌。八小时后，以4毫摩尔/小时的速度添加1摩尔/升的1，2，4-三唑溶液。
使用实施例2所述的高效液相色谱法，1，2，4-三唑基-1-基-L-丙氨酸的保留时间为5.8分钟。收率为4.6克/升。实施例6：通过发酵生产1，2，3，4-四唑基-L-丙氨酸
依照实施例1和2所述培养细菌。八小时后，以4毫摩尔/小时的速度添加1摩尔/升的1，2，3，4-四唑溶液。
在发酵期间形成1，2，3，4-四唑-1-基-L-丙氨酸和1，2，3，4-四唑-2-基-L-丙氨酸两种异构体。使用实施例2所述的高效液相色谱法，两种异构体的保留时间分别为5.4分钟和5.7分钟。两种异构体的总收率为3.9克/升。实施例7：通过发酵生产5-羧基-1，2，3-苯并三唑基-L-丙氨酸
依照实施例1和2所述培养细菌。八小时后，以4毫摩尔/小时的速度添加1摩尔/升的1，2，3-苯并三唑-5-羧酸在0.5摩尔/升NaOH中的悬浮液。
在发酵期间形成5-羧基-1，2，3-苯并三唑-1-基-L-丙氨酸、5-羧基-1，2，3-苯并三唑-2-基-L-丙氨酸和5-羧基-1，2，3-苯并三唑-3-基-L-丙氨酸所有三种异构体，但5-羧基-1，2，3-苯并三唑-2-基-L-丙氨酸为主要产物。使用实施例2所述的高效液相色谱法，主要产物的保留时间为67.5分钟。收率为5.2克/升。实施例8：通过发酵生产1，2，4-噁二唑烷-2，5-二酮基-L-丙氨酸(＝使君子氨酸)
依照实施例1和2所述培养细菌。八小时后，以2毫摩尔/小时的速度添加2摩尔/升的1，2，4-噁二唑烷-2，5-二酮在二甲亚砜中的溶液。
使用实施例2所述的高效液相色谱法，使君子氨酸的保留时间为5.6分钟。收率为2.2克/升。实施例9：自发酵罐肉汤分离1，2-吡唑基-L-丙氨酸
首先通过以5000g离心将细胞自0.6升发酵罐肉汤中除去。向上清液中添加10克活性碳脱色，在室温下搅拌混合物2小时，随后过滤。用2摩尔/升NaOH将所得溶液的pH调至6.0，施加在阳离子交换柱Amberjet 1200/H+(Rohm and Haas S.A.，Chauny，法国；250毫升凝胶床)上，并用1摩尔/升NaCl洗脱结合物质。合并洗脱组分(500毫升)，用2摩尔/升NaOH将pH调至6.0并浓缩至100毫升。在4℃下将样品储存16小时。通过过滤回收所得的晶体，用50毫升乙醇洗涤并干燥。实施例10：通过发酵生产S-噻唑-2-基-L-半胱氨酸
依照实施例1和2所述培养细菌。八小时后，以2毫摩尔/小时的速度添加1摩尔/升2-巯基噻唑溶液。使用实施例2所述的高效液相色谱法，S-噻唑-2-基-L-半胱氨酸的保留时间为33.7分钟。收率为6.1克/升。实施例11：通过发酵生产S-1，2，4-三唑-3-基-L-半胱氨酸
依照实施例1和2所述培养细菌。八小时后，以2毫摩尔/小时的速度添加1摩尔/升3-巯基三唑溶液。使用实施例2所述的高效液相色谱法，S-噻唑-2-基-L-半胱氨酸的保留时间为8.2分钟。收率为5.5克/升。