针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体.pdf

本发明提供了一种针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体，属于生物技术领域。利用2010年分离的H3N2犬流感病毒江苏分离株JS/10，接种10日龄SPF鸡胚，收集血凝效价大于等于6的尿囊液，纯化病毒接种MDCK细胞，皮内多点注射接种小鼠，细胞融合后，经三次ELISA检测已生成细胞集落的细胞上清，筛选出抗H3亚型杂交瘤细胞株mAbD7，中和抗体效价达1:12800，识别抗原鉴定证实其针对保守的HA2蛋白，抗体亚类为IgG2b。本发明制备针对H3N2犬流感病毒株JS/10的保守的HA2蛋白单克隆抗体，为H3N2犬流感病毒感染的治疗提供了重要的免疫制剂，具有潜在的应用前景。

1.  一种分泌针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株mAb D7 于2014年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC No：C2014176，分类命名：杂交瘤细胞株mAb D7。

2.  用权利要求1所述杂交瘤细胞株mAb D7制备的单克隆抗体。

3.  权利要求2所述单克隆抗体的应用。

4.  权利要求2所述单克隆抗体在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂中的应用。

5.  权利要求2所述单克隆抗体在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂组合物中的应用。

针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体
技术领域
本发明涉及针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体，属于生物技术领域。标准的杂交瘤技术，以一株H3N2犬流感病毒株JS/10为试验毒株，最终通过血凝抑制、中和试验以及Westernblotting筛选得到针对保守蛋白HA2的单克隆抗体D7，为H3N2犬流感病毒感染的治疗提供重要的免疫制剂。
背景技术
杂交瘤技术的原理是利用聚乙二醇(PEG)为细胞融合剂，使免疫小鼠的脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测、筛选和单个细胞培养(克隆化)，最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。而具有中和活性的单克隆抗体，可通过阻止病毒吸附或病毒与宿主细胞间的融合，发挥抗病毒感染作用。有研究表明，具有中和活性的单克隆抗体能有效预防流感病毒感染[SkehelJJ,Wiley DC.Receptor binding and membrane fusion in virus entry:the influenza hemagglutinin.Annu Rev Biochem2000,69:531-569.]。
流感病毒属于正黏病毒科的一种单链负股RNA病毒，分为A、B、C三个型，其中A型流感病毒是一种具有高度传染性的病原体，可感染禽类和多种哺乳动物宿主。犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)是一种新发现的能在犬中引起流行的高度接触性呼吸道传染病。犬流感病毒不仅对犬类的生存和健康带来严重的危害，同时也给人类健康带来巨大的风险。一方面，流感病毒通过在犬等哺乳动物体内的适应，可能会更容易获得感染人的能力，犬是人类最亲密的伴侣动物，与人密切接触机会较多，犬有可能会作为中间宿主将流感病毒传播给人类；另一方面，研究表明多种亚型的流感病毒能够感染犬类，当犬类感染两种以上的流感病毒时，流感病毒可能会在犬体内经过基因重配形成能够感染人的重组流感病毒。有学者推测，犬可能成为下一个引起大流行的新型流感病毒“混合器”。因此控制犬流感病毒的传播和流行非常必要，在公共卫生上具有重要意义。
自从2004年马源H3N8亚型犬流感在美国爆发，引起人们极大的关注，改变了此前人们认为犬对流感病毒具有抵抗力的观点。2007年，H3N2亚型犬流感病毒在韩国首次报道，随后，在中国陆续分离到此亚型的犬流感病毒。目前H3N2亚型犬流感病毒已经成为中国犬群中流行的主要亚型[Zeng XJ,Lin Y,Zhao YB et al,Experimental infection of dogs with H3N2canine influenza virus from China.Epidemiol Infect2013,141:2595-2603.]。
疫苗接种是预防和控制流感病毒感染的主要措施，目前对CIV疫苗研究已取得一些进展。2009年，美国农业部门(USDA)批准的H3N8亚型CIV疫苗上市，有效减少了病毒的传播[Deshpande MS,Jirjis FF,Tubbs AL,et al.Evaluation of the efficacy of a canine influenza virus(H3N8)vaccine in dogs following experimental challenge.Vet Ther2009,10:103-112.]。2012年，韩国针对H3N2CIV的疫苗也已授权[Cho YS,Ha GW,Oh JS,et al.Canine influenza virus and vaccine therefore.United States Patent2012,Patent No:US8,246,962B2.]。尽管如此，疫苗接种仍有一定的局限性，在幼年、老年及免疫力低下的犬群中疫苗接种有相当大的风险。而有中和活性的单克隆抗体，通过抑制病毒对宿主细胞的吸附或复制过程而中和病毒；还可能参与体内其他的抗病毒保护机制如免疫调理作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)作用等，从而激活患犬体内的细胞免疫，达到清除病毒的作用。目前为止，还没有针对犬流感病毒制备单克隆抗体进行治疗的报道。
血凝素(HA)是流感病毒的主要抗原蛋白，参与病毒受体结合以及病毒入侵靶细胞。HA分为两个亚单位HA1和HA2，流感病毒只有当HA裂解为HA1和HA2时才能发挥病毒感染作用，因此制备针对HA抗原位点的具有中和活性的单克隆抗体一直被作为评价流感病毒保护性的标准。然而，由于HA1氨基酸序列的高度变异性，针对HA1的单抗中和活性有限[de Jong JC,Palache AM,Beyer W,et al.Haemagglutination-inhibiting antibody to influenza virus.Dev Biol(Basel)2003,115:63-73.]；而HA2位于HA的茎部，是所有亚型流感病毒HA的保守区域，对病毒的黏附以及病毒入侵宿主细胞膜起到关键作用。本发明制备针对H3N2犬流感病毒株JS/10的保守的HA2蛋白单克隆抗体，为H3N2犬流感病毒感染的治疗提供了重要的免疫制剂，具有潜在的应用前景。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于制备针对H3N2犬流感病毒JS/10株的HA2蛋白单克隆抗体，为H3N2犬流感病毒感染的治疗提供重要的免疫制剂。
技术方案
本发明将H3N2犬流感病毒江苏分离株JS/10扩增纯化后，用标准的杂交瘤技术获得针对该毒株的mAbs，通过血凝抑制试验、细胞中和试验以及分段表达HA蛋白后Western blotting分析，最终鉴定获得针对HA2保守蛋白的mAb。步骤包括：
1.通过鸡胚接种扩增H3N2犬流感病毒JS/10株，并采用差速离心和蔗糖密度梯度超速离心纯化病毒；
2.纯化病毒接种犬肾细胞(MDCK)，培养后测定半数组织细胞感染量(TCID₅₀)；
3.采用杂交瘤技术制备H3N2犬流感病毒单克隆抗体以及制备腹水；
4.单克隆抗体特性分析，包括血凝抑制抗体效价、中和抗体效价测定，以及抗原特性鉴定等；
5.单抗对3株流感病毒株的动物交叉保护试验。
本发明提供了一种分泌针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株mAb D7于2014年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No：C2014176，分类命名：杂交瘤细胞株mAb D7。
用所述杂交瘤细胞株mAb D7制备的单克隆抗体，可以在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂中应用，或者在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂组合物中得到应用。
有益效果
本发明针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体制备方法，为防控该病毒引起的犬群感染，以及应对其对人类健康和公共卫生构成的潜在威胁奠定基础。在本发明中，术语“半数组织细胞感染量(TCID₅₀)”是指能够引起半数组织细胞感染的病毒量，用来判定病毒的毒力。
在本发明中，术语“杂交瘤技术”是指骨髓瘤细胞与免疫动物脾细胞融合，形成能分泌针对免疫抗原的特异性抗体即单克隆抗体的技术。该技术生产的单克隆抗体具有高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、生产成本低等优点。
本发明有以下创新点：
1.采用注射单克隆抗体的方法预防和控制流感病毒的感染，具有特异性强、效价高等优点。与传统的疫苗接种手段相比，取代了后者的不易大范围推广以及对犬群接种对象的局限性的缺点，降低了风险性，提高了安全性；
2.所获单抗具有中和活性，中和效价高达1：12800，可阻止病毒吸附或病毒与宿主细胞间的融合，从而有效预防流感病毒的感染；
3.本发明所获单抗针对HA2蛋白，而针对HA抗原位点的具有中和活性的单克隆抗体一直被作为评价流感病毒保护性的标准。
由于HA1氨基酸序列的高度变异性，针对HA1的单抗中和活性有限，而HA2位于HA的茎部，是所有亚型流感病毒HA的保守区域，并且对病毒的吸附以及病毒入侵宿主细胞膜起到关键作用，因此本发明制备的针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体可对H3N2亚型不同犬流感病毒株，甚至其他流感病毒株均具有良好的保护效果，具有潜在的应用前景。
附图说明
图1：利用差速离心及蔗糖密度梯度离心法纯化的病毒电镜学观察，图片放大倍数为130000。
图2：H3N2犬流感病毒株感染MDCK后的细胞病变情况
A图为病毒感染组，可见细胞出现明显的空泡、拉丝结网现象；B图为对照组，即未接毒的MDCK细胞，细胞菱形且排列较整齐。
图3：mAbD7的抗原鉴定，即D7对重组蛋白HA、HA1和HA2的Western Blotting结果，1-4泳道分别为蛋白Marker、D7针对HA蛋白、D7针对HA1蛋白和D7针对HA2蛋白。
图4：mAb D7预处理小鼠感染H3N2犬流感病毒株JS/10(A)和GD/12(B)以及猪流感病毒株SD/05(C)后的体重变化。结果用体重百分比表示，*,P<0.05和**,P<0.01,分别指mAbD7处理组的小鼠体重相比病毒感染组差异显著和极显著；#,P<0.05,指mAb D7处理组的小鼠体重相比PBS对照组差异显著。
图5：mAb D7预处理小鼠感染H3N2犬流感病毒株JS/10(A)和GD/12(B)以及猪流感病毒株SD/05(C)后的肺脏病毒载量检测。结果以log10为底数的每克肺脏组织中RNA病毒拷贝数表示。*,P<0.05和**,P<0.01,分别指单抗D7组相比于其他两组差异显著和极显著。
图6：mAb D7预处理小鼠感染H3N2犬流感病毒株JS/10和GD/12以及猪流感病毒株SD/05后的肺脏病变计分。基于肺脏病理组织学变化给予0-3分的计分。*,P<0.05和**,P<0.01,分别指mAb D7处理组的小鼠肺脏病变计分相比病毒感染组差异显著和极显著。
生物保藏
杂交瘤细胞株mAb D7于2014年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No:C2014176，分类命名：杂交瘤细胞株mAb D7。
具体实施方式
下面结合具体实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件，例如《分子克隆实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)(Sambrook等人)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。而标准的杂交瘤技术，则参照[Vareckova E,Betakova T,Mucha V,et al.Preparation of monoclonal antibodies for the diagnosis of influenza A infection using different immunization protocols.J Immunol Methods1995,180:107-116]。
(一)H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体的制备
1.标准毒株的选择
本发明中所使用的标准毒株为犬流感病毒病毒株A/Canine/Jiangsu/06/2010(H3N2)(简称JS/10)，其GenBank序列号从JN247615到JN247623。毒株及其序列参照网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore。
2.H3N2犬流感病毒JS/10株的扩增与纯化
将病毒株JS/10的悬液接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每个鸡胚接种0.2mL。无菌收取接种病毒后48-96h鸡胚尿囊液，选择血凝效价大于等于2⁶的尿囊液；分别采用3000，5000和8000rpm的转速进行差速离心，使流感病毒充分释放出来，再用20％，40％及60％的蔗糖密度梯度离心，使病毒沉降后，PBS重悬洗涤一次后，沉降的病毒颗粒用PBS重悬。纯化的病毒电镜结果见图1。
3.JS/10细胞毒的获得以及TCID₅₀的测定
JS/10株鸡胚尿囊液接种MDCK细胞，感染48-96h后，当细胞出现明显的空泡、拉丝结网细胞病变现象时，收集细胞毒，细胞病变(CPE)见图2。
TCID₅₀试验：感染前1d，96孔细胞板铺上单层MDCK细胞。第二天，JS/10株尿囊液100μL接种MDCK细胞，横向依次倍比稀释，倒数第二列为阳性对照，最后一列为空白对照，每个稀释度3个重复。每日观察CPE，记录各稀释度出现细胞病变的孔数。病毒 滴度表示为TCID₅₀/mL，测得JS/10毒株毒价为10^7.13TCID₅₀/mL。
4.H3N2犬流感病毒单抗的制备
1)动物免疫
纯化的病毒JS/10用PBS稀释后接种6周龄BALB/c小鼠，一免加弗氏完全佐剂(Sigma)皮内多点注射200μL，其中含有100μg的病毒。二免和三免采用弗氏不完全佐剂(Sigma)皮内多点注射，免疫剂量与一免相同。三免两周后眶下丛毛细管采血。ELISA检测血清抗体效价达到1：25600。血清抗体效价达到峰值后进行最后一次加强免疫，即腹腔注射PBS稀释的100μg纯化病毒200μL，3d取小鼠脾脏，进行细胞融合。
2)饲养细胞的制备与细胞融合
饲养细胞的制备：将1只BALB/c小鼠处死，体表酒精消毒。无菌剪开腹部皮肤，露出腹膜，用无菌注射器吸取8mLHAT完全培养基(Sigma)注入腹腔，用酒精棉球轻轻按压腹腔数次，吸出培养基，置于细胞培养瓶中，计数后补加HAT完全培养基，使细胞密度为2×10⁵个/mL，在融合前12h，每孔100μL加入96孔细胞培养板。
细胞融合：无菌取脾，制备免疫脾细胞，与对数生长期的sp2/0细胞按1:6的比例混合，1000rpm离心10min，弃上清。用手掌轻击离心瓶底，使沉淀的细胞打散。将离心瓶底部放入40℃水浴中，边旋转边加入融合用的PEG50001mL，在1min内加完，继续旋转同时加入无血清1640培养基15mL，在90s内加完，由慢到快，前5s加1mL。室温静置10min后，1000rpm离心5min，弃上清，将HAT选择培养液加入到细胞融合物中，悬浮细胞，分配到已有饲养细胞的96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO₂的温箱中培养。细胞融合后5d，用HAT培养基半换液，10d后用HT培养基(Sigma)全换液，筛选获得生长良好的杂交瘤细胞。
3)亚克隆与腹水的制备
亚克隆：有限稀释法进行。每次亚克隆均通过ELISA方法检测上清效价，三次亚克隆均阳性的单个克隆扩大培养并及时冻存。通过血凝抑制试验筛选得到7株可分泌针对JS/10病毒株的特异性单抗的杂交瘤细胞株。
腹水制备：10周龄的经产母鼠预先腹腔注射液体石蜡，一周后腹腔注射扩大培养的PBS稀释的杂交瘤细胞，一周后观察母鼠腹部及其精神状态，待其腹部隆起明显时，收集腹水，离心后取上清56℃水浴30min灭活，-20℃冷冻保存。
(二)针对H3N2犬流感病毒JS/10株的单克隆抗体的鉴定
1.血凝抑制(HI)效价测定
将腹水用PBS稀释5倍后做血凝抑制试验。
首先进行血凝试验，以确定H3N2犬流感病毒JS/10株尿囊液的血凝效价。首先在一次性血凝板的第一排的1-12孔加入50μL PBS，其次在第一孔加入50μL病毒尿囊液，混匀后吸50μL到第3孔，依次倍比稀释直到第10孔，混匀后弃去50μL。最后两孔(11、12)为红细胞对照。接着每孔加入50μL1％红细胞轻轻摇动混匀。手动震荡，37℃静置30min后观察结果。以50％的红细胞发生凝集的病毒悬液的最高稀释度作为该病毒液的红细胞凝集效价。JS/10株尿囊液的血凝效价为2⁶。
做血凝抑制试验前，首先用PBS稀释病毒尿囊液以获得4个血凝单位的犬流感病毒。血凝抑制试验的步骤如下：
(1)在血凝版的1-12孔加入25μL PBS，最后两孔加入50μL分别作为阳性与阴性对照。
(2)第一孔加入待捡已稀释的腹水25μL，混匀后吸25μL至第2孔，倍比稀释至第10孔，混匀后弃25μL。
(3)在1-10孔，每孔加稀释好的25μL4个血凝单位的病毒悬液，37℃静置20min，让病毒与腹水，即抗原抗体充分反应。
(4)将1％红细胞轻轻摇动混匀，在1-12孔中每孔加入50μL。
(5)手动震荡1min后，37℃静置30min后观察结果。
能将病毒凝集红细胞的作用完全抑制的血清的最高稀释倍数即为该稀释腹水的红细胞凝集抑制效价。7株单抗的HI效价见表1。
2.细胞中和效价测定
将5倍稀释的腹水作倍比稀释(具体方法是在96孔板中先加入50μL营养液DMEM，再加50μL已稀释的腹水，混匀后吸50μL至下一孔直至倒数第三孔)，每支单抗的腹水做3个重复。然后各孔内加入50μL稀释至200TCID₅₀的JS/10细胞毒(毒价为10^7.13TCID₅₀/mL)37℃孵育1h后，吸出每孔液体，加至长满单层的MDCK细胞孔中。倒数第二列为阳性对照，即细胞仅与病毒作用；最后一列为空白对照，即正常的MDCK细胞。Reed-Muench法计算细胞中和效价。同时，将7株获得的H3N2犬流感病毒单抗用小鼠单克隆抗体Ig类/亚类鉴定ELISA试剂盒(Tiangen公司)对7株单抗亚类进行鉴定。HI效 价和中和效价及其抗体亚类见表1。单抗株D7中和效价高达1：12800。
表17株针对H3N2犬流感病毒JS/10株的单抗特性

3.单抗抗原特性鉴定
HA是流感病毒表面最重要的囊膜糖蛋白，其裂解为HA1和HA2蛋白后才能发挥病毒感染细胞的作用。为了鉴定所获单抗针对的抗原蛋白，分别原核表达H3N2犬流感病毒JS/10株全长HA蛋白及分段表达HA1和HA2蛋白，并进行Western blotting鉴定。
1)H3N2犬流感病毒JS/10株HA基因全长及分段扩增
①犬流感病毒JS/10株HA基因引物：
全长HA基因(GenBank登录号为JN247619.1)上游引物：CGGGATCCGGAAATGAAAATAA，下游引物：CCCAAGCTTAATGCAAATGTTGCACCTA。
分段HA1基因(位于HA基因的48-1035bp，去除最初48bp信号肽序列)上游引物：CGGGATCCCAGAATCTTCCAGGAAATGAA，HA1基因下游引物：CCCAAGCTTTCTGGTTTGCCTCTCAGG。
分段HA2基因(位于HA基因的1036-1698bp，去除最后终止子序列)上游引物：CGGGATCCGGCCTGCTCGGCGCAATA，HA2基因下游引物：CCCAAGCTTAATGCAAATGTTGCACCTAATGTTG。
②HA、HA1和HA2基因的PCR扩增：以犬流感病毒JS/10基因组提取的RNA反转录的cDNA为模板配制如下总体积50μL PCR反应体系：Primestar Mix(2×)25μL，去离子水19μL，上游引物2μL，下游引物2μL，cDNA2μL。
PCR反应循环参数：98℃15s，98℃5s，53℃1min30s，72℃延伸，延伸时间为1min/kb， 30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
③表达载体的构建：BamHⅠ(Takara公司)和HindⅢ(Takara公司)分别酶切PCR产物和pET-28a(+)(Takara公司)，T4DNA连接酶(Takara公司)16℃过夜连接。连接产物转入大肠杆菌DH5α(Vazyme公司)中，37℃过夜培养，提取质粒，用BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定。
④全长及分段HA蛋白的表达：阳性克隆HA-28a，HA1-28a，HA2-28a提质粒，转入去细胞毒性的感受态细胞BL21(plyss)(Vazyme公司)中。挑取单菌落接种于5mL LB培养基(含5μL,100μg/mL卡纳)37℃过夜培养。取50μL过夜培养菌液接种5mL LB培养基(含5μL,100μg/mL卡纳)，37℃180rpm/min摇菌3h，至OD₆₀₀为0.4-0.6。加IPTG至终浓度为1mM，37℃摇菌3-5h后，各取1mL菌液10000rpm/min离心8min，弃上清，沉淀用16μLPBS加4μL上样Buffer(5x)重悬后用于SDS-PAGE检测。
2)HA蛋白全长及分段HA1和HA2蛋白的检测
①SDS-PAGE：配制12％的分离胶(20mM Na₃PO₄·12H₂O；0.5M NaCl；20mM咪唑；2M脲，pH7.4)和5％的浓缩胶(1.4mL ddH₂O，0.33mL30％丙烯酰胺溶液，0.25mL1M Tris pH6.8，0.02mL10％SDS，0.02mL10％过硫酸铵,0.002mL TEMED)。样品添加上样缓冲液沸水煮10min。浓缩胶电压80V，分离胶电压120V。电泳2.5h。考马斯亮兰染色2h，脱色液脱色。HA在约69kD处有明显的条带出现，HA1在约47kD，而HA2则在34kD处有明显的条带。
②Western blot鉴定：SDS-PAGE结束后，去除浓缩胶，测量凝胶大小。根据凝胶的大小剪两张商品化转印用滤纸和一张PVDF(聚偏二氟乙烯)膜(GE公司)。将PVDF膜浸没于甲醇中5s左右，立即取出和滤纸一起浸没于膜转移缓冲液(甘氨酸2.9g，Tris5.8g，SDS0.37g，甲醇200mL，去离子水定容至1L)中，平衡5min以上。按滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序从阳极到阴极摆放正确，按照0.7mA/cm²通电转印2h。PVDF膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液(含有5％脱脂奶的TBST缓冲液，TBST缓冲液：NaCl8.8g，1M Tris-HCl(pH8.0)20mL，Tween-200.5mL，去离子水定容至1L)，37℃孵育2h。将PVDF膜转移至含有封闭液和1:5000稀释的H3N2犬流感病毒株JS/10的7株单抗腹水(ELISA效价>1:10⁷)的密封塑料袋中，37℃孵育1.5h。取出PVDF膜用，TBST漂洗3次，每次5min。PVDF膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和1：500稀释的HRP-羊抗鼠 IgG(博士德公司)。37℃孵育1h。PVDF膜放TBST中漂洗3次，每次5min，最后一次用TBST漂洗。加入沉淀型单组分TMB底物溶液(Tiangen公司)显色5-30min。4株单抗针对HA蛋白，其中3株针对HA1，只有单抗D7针对HA2抗原表位，单抗D7的Western blot结果见图3。
(三)单抗对3株流感病毒株的动物交叉保护试验
小鼠一直是研究流感病毒常用的动物模型[Barnard DL.Animal models for the study of influenza pathogenesis and therapy.Antiviral Res,2009,82:A110–122]。为了评估mAb D7对流感病毒感染的保护效果，利用BALB/c小鼠开展了交叉保护试验。使用的毒株为：犬流感病毒株JS/10；犬流感病毒株A/Canine/Guangdong/12/2012(简称GD/12)，GenBank序列号为从KF826944到KF826951；猪流感病毒株A/swine/Shandong/3/2005(简称SD/05)，GenBank序列号为从EU116037到EU116044。毒株及其序列参照网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore。
105只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为3个病毒感染组和1个对照组：每个病毒感染组30只小鼠，分别滴鼻接种50μL10⁷TCID50的上述三种病毒，15只小鼠作为PBS空白对照组。每个病毒感染组小鼠又随机分为两个小组，每个小组15只，分别为病毒感染组和单抗D7处理+病毒感染组。单抗的使用在接种病毒前24h，腹腔注射100μL纯化的单抗D7，剂量为20mg/kg小鼠体重。每天记录小鼠体重情况，持续14d。体重变化见图4，单抗D7处理的小鼠体重增长速度明显高于病毒感染组。
选取攻毒后2，4，6，10，14天5个时间点，处死小鼠，取肺脏，采用荧光定量PCR进行病毒载量的检测。采用RNA提取试剂盒(TaKaRa公司)提取肺脏病毒RNA，然后反转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR的检测，定量M基因上游引物为：TCTATCGTCCCATCAGGC，下游引物为：GGTCTTGTCTTTAGCCATTC，具体操作参照[Lin Y,Zhao YB,Zeng XJ,Lu CP,Liu YJ.Genetic and pathobiologic characterization of H3N2canine influenza viruses isolated in the Jiangsu Province of China in2009-2010.Vet Microbiol,2012,158:247-258]。各组小鼠肺脏的病毒载量见图5。在每一时间点，单抗处理组与病毒感染组相比，病毒载量明显下降。以分别感染病毒株JS/10、GD/12以及SD/05后第6天为例，单抗处理组中小鼠肺脏的病毒载量比病毒感染组分别降低了99.38％，98.75％以及92.82％。
选取感染后第6天各组小鼠的肺脏做组织病理学观察，所有病毒感染组的小鼠均表现出明显的病变，肺间质显著增宽，支气管管腔变狭窄，肺泡间隔增厚，炎性细胞浸润，并 伴有肺实变，而单抗D7处理组小鼠仅表现出轻微的支气管炎。为了比较各组之间病变的程度，参照[Alymova IV,Green AM,van de Velde N,McAuley JL,BoydKL ,Ghoneim HE,McCullers JA:Immunopathogenic and antibacterial effects of H3N2influenza A virus PB1-F2map to amino acid residues62,75,79,and82.J Virol2011,85:12324-12333]进行了病变计分，结果见图6。相比病毒感染组，单抗D7处理组小鼠有明显更低的病变计分。小鼠在感染病毒株JS/10、GD/12以及SD/05后，病毒感染组的肺脏病变计分分别为2.67分、2.33分以及3分，而单抗处理组的肺脏病变计分则分别为1分、1分以及1.33分。相比病毒感染组，单抗D7处理组的肺脏病变计分显著降低。
小鼠试验表明，针对H3N2亚型的犬流感病毒和猪流感病毒感染，mAb D7的使用有助于提高小鼠增重速度、降低病毒载量及肺脏病变计分，显示了较好的抗病毒感染效果。
综上所述，本发明制备的mAbD7既具有很高的中和效价而且针对HA2抗原表位，对H3N2犬流感病毒株感染具有广泛的保护性，可用于临床治疗。本发明创新性体现在：1.采用注射单克隆抗体的方法预防和控制流感病毒的感染，具有特异性强、效价高等优点；2.所获单抗具有中和活性，中和效价高达1：12800，可阻止病毒吸附或病毒与宿主细胞间的融合，从而有效预防流感病毒的感染；3.本发明所获单抗针对HA2蛋白，而HA2是所有亚型流感病毒HA的保守区域，并且对病毒的吸附以及病毒入侵宿主细胞膜起到关键作用，故该单抗用于临床治疗具有明显的应用价值。
                         SEQUENCE LISTING
 
 
 
<110>  南京农业大学
 
 
 
<120>  针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体
 
 
 
<130>  说明书
 
 
 
<160>  6    
 
 
 
<170>  PatentIn version 3.1
 
 
 
<210>  1
 
<211>  22
 
<212>  DNA
 
<213>  人工
 
 
 
<220>
 
<221>  全长HA基因上游引物
 
<222>  (1)..(22)
 
<223> 
 
 
 
<400>  1
cgggatccgg aaatgaaaat aa                                              22
 
 
<210>  2
 
<211>  28
 
<212>  DNA
 
<213>  人工
 
 
 
<220>
 
<221>  全长HA基因下游引物
 
<222>  (1)..(28)
 
<223> 
 
 
 
<400>  2
cccaagctta atgcaaatgt tgcaccta                                        28
 
 
<210>  3
 
<211>  29
 
<212>  DNA
 
<213>  人工
 
 
 
<220>
 
<221>  HA1基因上游引物
 
<222>  (1)..(29)
 
<223> 
 
 
 
<400>  3
cgggatccca gaatcttcca ggaaatgaa                                       29
 
 
<210>  4
 
<211>  27
 
<212>  DNA
 
<213>  人工
 
 
 
<220>
 
<221>  HA1基因下游引物
 
<222>  (1)..(27)
 
<223> 
 
 
 
<400>  4
cccaagcttt ctggtttgcc tctcagg                                         27
 
 
<210>  5
 
<211>  26
 
<212>  DNA
 
<213>  人工
 
 
 
<220>
 
<221>  HA2基因上游引物
 
<222>  (1)..(26)
 
<223> 
 
 
 
<400>  5
cgggatccgg cctgctcggc gcaata                                          26
 
 
<210>  6
 
<211>  34
 
<212>  DNA
 
<213>  人工
 
 
 
<220>
 
<221>  HA2基因下游引物
 
<222>  (1)..(34)
 
<223> 
 
 
 
<400>  6
cccaagctta atgcaaatgt tgcacctaat gttg                                 34