磺酰胺及其作为药剂的用途.pdf

本发明涉及式(I)磺酰胺化合物的用途：其中R1选自H、CN、卤素、三氟甲基、甲基、乙基、羟基、甲氧基、乙氧基、吗啉代，R2选自H、苯基、取代的苯基、CN、-SO2R，其中R是苯基或吗啉代、-NC(O)Me、-NC(O)Et、-CH2C(O)OMe、CH2C(O)OEt，R3选自H、NO2、NH2、卤素、-COOMe、-COOEt、RC(O)N-、吗啉代，R4选自H、支链或非支链甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、取代的或未取代的苯基、炔基、Me2SO2-、COOR，其中R是支链或非支链甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、-MeOC(O)-、取代的或未被取代的5或6元芳族或具有一个、两个或三个杂原子非芳族杂环的体系、hetaryl体系、浓缩的benzoheterocyclic体系，X是包括2或3原子的连接基，选自-NH-NH-、-NH-NH-CH2-、乙炔基、-NH-C(O)-CH2-、-NH-NH-SO2-、-C(O)-NH-CH2-、-NH-N＝CH-、-NH-N＝C(Me)-、作为杂环体系一部分的-NH-N＝CH主体，优选取代的或未被取代的吡唑或哒嗪体系的咪唑、咪唑啉-2-onyl、三唑基和四唑基体系，和其药物活性盐。此外，本发明涉及这些化合物作为药剂，特别用于治疗癌症的用途。

1、  式I的磺酰胺化合物：

其中
R₁选自H、CN、卤素、三氟甲基、甲基、乙基、羟基、甲氧基、乙氧基、吗啉代，
R₂选自H、苯基、取代的苯基、CN、-SO₂R，其中R是苯基或吗啉代、-NC(O)Me、-NC(O)Et、-CH₂C(O)OMe、CH₂C(O)OEt，
R₃选自H、NO₂、NH₂、卤素、-COOMe、-COOEt、RC(O)N-、吗啉代，
R₄选自H、支链或非支链甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、取代的或未取代的苯基、炔基、Me₂SO₂-、COOR，其中R是支链或非支链甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、-MeOC(O)-、取代的或未被取代的5或6元芳族或具有一个、两个或三个杂原子非芳族杂环的体系、hetaryl体系、浓缩的benzoheterocyclic体系，
X是包括2或3原子的连接基，选自-NH-NH-、-NH-NH-CH₂-、乙炔基、-NH-C(O)-CH₂-、-NH-NH-SO₂-、-C(O)-NH-CH₂-、-NH-N＝CH-、-NH-N＝C(Me)-、作为杂环体系一部分的-NH-N＝CH主体，优选取代的或未被取代的吡唑或哒嗪体系，及其药物活性盐。

2、  根据权利要求1的磺酰胺化合物，其中R₁位于邻位。

3、  根据权利要求2的磺酰胺化合物，其中R₁是卤素。

4、  根据权利要求2或3的磺酰胺化合物，其中R₂位于间位。

5、  根据权利要求2或3的磺酰胺化合物，其中R₂位于对位。

6、  根据上述任一权利要求的磺酰胺化合物，其中R₃位于邻位。

7.  根据权利要求6的磺酰胺化合物，其中R₃是卤素。

8、  根据权利要求7的磺酰胺化合物，其中X是H。

9、  根据权利要求1至5任一磺酰胺化合物，其中R₃位于间位。

10、  根据权利要求9的磺酰胺化合物，其中R₃是H、卤素、NO₂、NH₂，酰胺残基。

11、  根据权利要求10的磺酰胺化合物，其中X-R₄位于邻位，R₃的对位。

12、  根据权利要求11的磺酰胺化合物，其中X选自-NH-NH-、-NH-NH-CH₂-、乙炔基、NH-C(O)-CH₂-、-NH-NH-SO₂-、-C(O)-NH-CH₂-、-NH-N＝CH-、-NH-N＝C(Me)-、和作为取代的或未被取代的吡唑体系一部分的-NH-N＝CH-主体。

13、  根据权利要求12的磺酰胺化合物，其中R₄选自支链或非支链甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、甲氧基、乙氧基、取代的或未被取代的苯基、取代的炔基、Me₂SO₂-、COOR，其中R是支链或非支链甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、-MeOC(O)-、取代的或未被取代的吡唑基或吡啶基、hetaryl体系、浓缩的苯并杂环体系。

14、  根据权利要求13的磺酰胺化合物，其中R₃是NO₂。

15、  根据权利要求13或14的磺酰胺化合物，其中X是包括2个氮原子的结构主体。

16、  根据权利要求15的磺酰胺化合物，其中X选自组，包括-NH₂-NH-CH₂-、-NH₂-NH₂-SO₂-、-NH＝N-CH₂-、作为取代的或未被取代的吡唑体系一部分的-NH-N＝CH-主体、-NH₂-NH-C(O)-。

17、  根据权利要求16的磺酰化合物，具有如下式II：


18、  根据权利要求16的磺酰化合物，具有如下式III：


19、  根据权利要求16的磺酰化合物，具有如下式IV：


20、  根据权利要求16的磺酰化合物，具有如下式V：


21、  根据权利要求16的磺酰化合物，具有如下式VI：


22、  根据权利要求16的磺酰化合物，具有如下式VII：


23、  根据权利要求16的磺酰化合物，具有如下式VIII：


24、  根据权利要求16的磺酰化合物，具有如下式IX：


25、  根据上述任一权利要求的磺酰化合物，作为药剂的用途。

26、  根据权利要求1至22中任一的磺酰化合物，用于制备治疗癌症的药物组合物的用途(WELCHE KREBSARTEN DAS SEIN？)。

27、  包括根据权利要求1至22中任一的化合物的药物组合物或其药物可接受的盐。

28、  根据权利要求27的药物组合物，还包括药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂中至少一种。

磺酰胺及其作为药剂的用途
本发明涉及抑制β-连接素和BCL9和/或BCL9L蛋白质间相互作用的磺酰胺化合物，即抑制Wnt转导通路的化合物。此外，本发明涉及这些化合物制备用于治疗癌症的药物组合物的用途。
本发明中的抑制剂，能被使用干细胞研究或特征在于异常Wnt激活的疾病，例如癌症、骨和软骨疾病{M.，2005#198}{WestendorfJJ，2004#199}。例如，已经广泛报道的结肠直肠癌(综述{Pinto D，2005#197}、肝细胞癌{Lee HC，2006#194}、乳癌{Howe LR，2004#196}、黑素瘤{Lame L，2006#195}、间皮瘤(综述{Fox S.，2006#191})、淋巴瘤{Bellei B，2004#193}和白血病{Jamieson CH，2004#192}的Wnt通路的病理激活。此外，由于Wnt通路在T-细胞发育中也具有基本功能(Staal，Meeldijk等人.2001；Staal and Clevers 2003)，在此公开的Wnt信号转导通路抑制剂也能被用作免疫抑制的药物，例如，在器官移植后或处理某些自身免疫疾病，例如红斑狼疮、多发性硬化和变形性关节炎{M.，2005#198}。
通过激活相应细胞中具体目标基因的表达，Wnt/Wg蛋白质对于脊椎动物的发育发挥许多作用。已经识别几种这些目标基因，它们的一些功能相应于控制细胞生长、分化和继续存活(He，Sparks等人1998；Crawford，Fingleton等人1999；Tetsu and McCormick 1999；Kolligs，Nieman等人2002；Shtutman，Zhurinsky等人2002)。
已经具有通过磷酸化标记β-连接素降解的复杂方法。重要的是，肿瘤抑制基因APC和Axin都是这种β-连接素破坏复合物的主要组分。通过Wnt通路的激活，β-连接素避免磷酸化反应，在细胞-血浆中聚集，进入细胞核，与TCF蛋白和最近识别的Lgs/BCL9{Kramps，2002#167}蛋白结合，以作为目标基因的转导共激活物。
这种连续抑制关键换能器(transducer)的机构，对于其抑制组分的变异非常敏感。实际上，已经发现，Wnt信号的下游组分中的变异与各种人体癌症有关(Kinzler和Vogelstein 1996；Miller，Hocking等人1999)。例如，种系APC变异能引起许多良性结肠直肠瘤，其中一些发展成癌症。APC基因的体细胞变异与85％突发结肠直肠腺瘤和癌有关(Kinzler和Vogelstein 1996)，已经在许多人体癌症，例如结肠直肠癌、肝细胞癌，和黑素瘤中发现β-连接素磷酸化位置的变异(Morin，Sparks等人1997；Rubinfeld，Robbins等人1997)(Caca，Kolligs等人1999)，已经在肝细胞癌中发现Axin的变异(Satoh，Daigo等人2000)。此外，上游组分，像LRP5、sfrps、WIF-1、DKK或Wnt配位基的几种变异和/或表达变化不仅与癌症有关，而且还与骨和软骨疾病有关{Westendorf，2004#199}、{Sen，2005#198}{Moon，2004#216}。由于所有这些变异都导致细胞核β-连接素的积聚，这种蛋白质和其相互反应的对象(partners)成为抑制Wnt相关基因表达的有吸引力的目标。
实际上，已经公开了以β-连接素-Tcf4相互作用为目标的Wnt通路抑制剂和发现这种抑制剂的方法。
这个课题也是几个专利申请的主题：国际专利申请WO 98/42296公开了纯化的蛋白质和筛选抑制剂的常规方法。国际专利申请WO 02/44378描述了筛选Tcf-β-连接素抑制剂的常规方法。国际专利申请WO 03/006447涉及tcf4-β-连接素抑制剂。国际专利申请WO 02/096430公开了作为小分子β-连接素抑制剂的头孢菌素衍生物。
国际专利申请WO 01/19353 A2公开了使用3D-模式Tcf4-β-连接素相互作用在连接素中“可命中目标的”口袋。也描述了在基于所述相互作用的硅筛选过程以识别抑制剂及通过这种方法识别的许多抑制剂。
上述的方法的主要缺点是，β-连接素-Tcf4的相互作用。特别是，这种蛋白质-蛋白质相互作用的表面非常大，至少部分地与其它β-连接素反应对象，像ECadherin和APC合用(Graham，Weaver等人2000；Eklof Spink，Fridman等人2001；Huber和Weis 2001；Poy，Lepourcelet等人2001)，这导致关于其特异性的严重问题。由于这个原因，需要Wnt通路替换目标。
在遗传筛选中，识别Legless(Lgs)/BCL9族蛋白质作为果蝇APC肿瘤抑制Wnt通路下游新的正调节基因。在人体中，具有两种同源染色体，BCL9和BCL9类似物(BCL9L，也称为B9L或BCL9-2)，像果蝇蛋白质，作为转导活性组分Pygo和β-连接素间的主要衔接分子{Kramps，2002#167}{Katoh，2005#211}。BCL9蛋白质和β-连接素的连接，对于癌细胞中的Wnt信号传导非常重要{Adachi S，2004#200}{Brembeck FH，2004#201}。能够通过小的RNAs(siRNA)干涉破坏这种蛋白质-蛋白质相互作用或减少BCL9L表达的竞争性(competitor)，缩氨酸强烈抑制Wnt通路，导致癌细胞从不能分化的恶性类型分化为适度、到高度分化的组织({Brembeck FH，2004#201}{Adachi S，2004#200}，US 2002/0086986)。然而，尽管它们对Wnt通路进行具体并有效的活性抑制，这些缩氨酸或siRNA分子由于其差的膜渗透性和弱的体系有效性并不是肿瘤治疗的理想药物。
因此，本发明的一个目标是提供新的β-连接素/BCL9-BCL9L相互作用的抑制剂，特别是具有改善药物特性，例如低分子量和好的细胞渗透性的化合物。
通过提供通式I的新型磺酰胺化合物解决了这个目标：

其中
R₁选自H、CN、卤素、三氟甲基、甲基、乙基、羟基、甲氧基、乙氧基、吗啉代，
R₂选自H、苯基、取代的苯基、CN、-SO₂R，其中R是苯基或吗啉代、-NC(O)Me、-NC(O)Et、-CH₂C(O)OMe、CH₂C(O)OEt，
R₃选自H、NO₂、NH₂、卤素、-COOMe、-COOEt、RC(O)N-、吗啉代，
R₄选自H、支链或非支链甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、取代的或未取代的苯基、炔基、Me₂SO₂-、COOR，其中R是支链或非支链甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、-MeOC(O)-、取代的或未被取代的5或6元芳族或具有一个、两个或三个杂原子非芳族杂环的体系、hetaryl体系、浓缩的benzoheterocyclic体系、优选的取代的或未被取代的苯基、吡啶基、萘基、喹啉基、异喹啉基、异噁唑啉基(isoxaxolinyl)、苯硫基、1，3，4-thiadiazazolidinyl、呋喃基、四氢化喹啉基(hydroquinolinyl)、四氢化异喹啉基、呋喃基、和苯并吡喃-2-on-某基，
X是包括2或3原子的连接基，选自-NH-NH-、-NH-NH-CH₂-、乙炔基、-NH-C(O)-CH₂-、-NH-NH-SO₂-、-C(O)-NH-CH₂-、-NH-N＝CH-、-NH-N＝C(Me)-、作为杂环体系一部分的-NH-N＝CH主体，优选取代的或未被取代的吡唑或哒嗪体系的咪唑、咪唑啉-2-onyl、三唑基和四唑基体系，和其药物活性盐。
在本发明优选的实施方案中，R₁位于邻位，由式Ia表示这些化合物。邻位是与磺胺部分N原子相连的环的2位置。取代的含义如上：

在优选的实施方案中，R₁是卤素。在本发明的上下文中，“卤素”指的是Cl、Br、I和F。特别优选Cl、Br和F。
在另一优选的实施方案中，R₂位于间位。为了更好地理解，间位是与磺胺部分N原子连接的环的3或5位置。在本文中最优选的是5位置，即R₁和R₂互为对位，由式Ib表示这些化合物。取代基的含义如上：

在其它优选的实施方案中，R₂位于对位，即与磺胺部分N原子连接的环的4位置。
在本发明另一优选的实施方案中，R₃位于邻位，并且X是H。邻位是与磺胺部分硫原子相连的环的2位置。在这种情况下，R₃是卤素，最优选Cl和Br。可以由下式Ic和Id表示优选的结构主体：

在这些根据式Ic和Id的优选实施方案中，X是H。
在另一优选的实施方案中，根据式Ie，R₃位于间位。间位是与磺胺部分硫原子相连的环的5位置。

由式If、Ig和Ih表示特别优选的结构主体。取代基的含义如上：

如能看到的，特别优选的是X-R₄基团位于邻位并于R3的对位。
在这些式中，特别优选的是R₃是H、卤素、NO₂、NH₂或酰胺(-C(O)NR’₂，其中R’是H、甲基、乙基或正和异丙基)。
X优选选自-NH-NH-、-NH-NH-CH₂-、乙炔基(-CC-R”，其中R”是H、C₁-C₈支链或非支链、取代或未被取代的烷基、优选甲基、乙基、正和异丙基、正、异和叔丁基、戊基、正戊基、正己基、环己基、正庚基以及正辛基或其氰基取代的衍生物)、NH-C(O)-CH₂-、-NH-NH-SO₂-、-C(O)-NH-CH₂-、-NH-N＝CH-、-NH-N＝C(Me)-、并且作为取代或未被取代的吡唑体系一部分的-NH-N＝CH-主体。
特别优选的是，R₄选自支链或非支链甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、甲氧基、乙氧基、取代或未被取代的苯基、取代的炔基、Me₂SO₂-、COOR，其中R是支链或非支链甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、-MeOC(O)-、取代或未被取代的吡唑基或吡啶基、hetaryl体系、浓缩的苯并杂环体系。
在本发明最优选的实施方案中，R3是NO₂。
在本发明另一特别优选的实施方案中，X是包括2个氮原子的结构主体、更优选是选自包括-NH₂-NH-CH₂-、-NH₂-NH₂-SO₂-、-NH＝N-CH₂-、作为取代或未被取代的吡唑体系一部分的-NH-N＝CH-主体、-NH₂-NH-C(O)-。
在细胞分析中，具有特别高活性的、特别优选的具体化合物由以下各式表示：


具有高活性的另一优选化合物是具有式V的各化合物：


本发明的另一目标是，根据本发明的化合物作为药剂和用于制造治疗癌症的药物组合物的用途(Sie schon sagen welche KREBSARTEN DAS SEINBei den lgs Anmeldungen hatten wir zumeist colon caner)。
本发明涉及还包括，根据本发明化合物的药物组合物或者其药物可接受的盐，并在另一实施方案中，还包括药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。
表1示出，根据本发明具体化合物的体外活性。TGC ID指的是申请人国内识别码；特异性值描绘化合物抑制β-连接素-BCL9的特异性(具体指的是它们不显著抑制E-钙粘素-β-连接素、Tcf-4-β-连接素或BCL9-Pygo相互作用)；MW平均分子量。
根据本发明的化合物，可单独给药或以其药物可接受的盐的形式给药。包括本发明化合物的药物组合物或其药物活性盐，还可包括药物活性载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。应理解的是，在具体实施方案中，组合物中还可含有活性化合物。
根据本发明的化合物，可配制成，例如以片剂、凝胶、胶囊剂、块、软膏、乳膏形式的用以表面、口腔、穿过表皮、肠胃外、舌下、鼻内、胸内、直肠、吸入或静脉的药剂。可通过仓库、注射器、安瓿或小瓶进行肠胃外传送。
因此，本发明的化合物连同常规助剂、载体或稀释剂，可制成药物组合物形式和其单位剂量形式，以这种形式，能以固体、液体或无菌注射溶液形式使用。如果使用固体载体，可制备片剂，以粉末或球粒形式或以片剂或锭剂形式放入硬的胶囊。固体载体可含有常规赋形剂，例如粘合剂、药片润滑剂、填料、崩解剂、润湿剂，等等。片剂可通过传统技术涂覆薄膜。如果使用液体载体，可以制备浆液、乳剂、软胶囊、注射无菌溶剂、含水的或不含水的悬浮液，或可为干燥产物，在使用前用水或其它适合溶剂重构。液体药剂可含有常规添加剂，例如悬浮剂、乳化剂、润湿剂、无水溶剂(包括食品油剂)，防腐剂及调味剂和/或着色剂。对于肠胃外投药，溶剂通常包括无菌水，至少大部分，尽管可使用盐溶液、葡萄糖溶液，等等。也可使用注射悬浮液，而在这样情况下，可使用常规悬浮剂。在肠胃外剂型中，也可添加常规防腐剂、缓冲剂，等等。然而，也能，例如以栓剂形式进行直肠给药，或者阴道，例如以阴道栓剂、棉塞、乳膏形式，或例如以软膏、奶乳膏或酊剂的形式经皮肤给药。
对于哺乳动物、特别是承受或可能承受在此描述任何条件的人体，本发明化合物或药物组合物的适合剂量是活性成分量约0.1μg/kg(NB：只具有少量化合物以较低量传送，例如一些激素)-500mg/kg体重。对于肠胃外投药，剂量可为0.1μg/kg-100mg/kg体重。对于静脉内的给药，优选每日相同剂量活性成分给药1-4次。式(I)的化合物，也能以体内释放活性化合物的前体(前体药物)或适当改进的形式使用。通常，逐渐增加给药剂量，直到治疗主体的最佳有效剂量。由内科医师或该领域内其它技术人员决定最佳给药剂量，取决于相关的环境，包括治疗条件、要给药化合物的选择、给药途径、性别、寿命、体重和相对于个体症状严重程度的治疗个体的具体响应。
通过适于制备含有适合活性成分量，即本发明化合物的药物的常规方法制备药物组合物。这种药物组合物和其剂型能以常规比例，包括常规组分，有或者没有附加活性化合物或成分，这种单位剂型可含有与要使用的每日剂量范围适当比例的任何适合的有效量活性成分。
以下实施例进一步说明发明人所预期的实施发明的最佳方式。实施例涉及优选的实施方案，不认为限制本发明的范围。
表1.通过如实施例1所述的基于ELISA蛋白质-蛋白质相互作用，分析测定的化合物活性。






如实施例所述，进行ELISA和细胞分析(CA)测量。
表示ELISA和CA试验的数字解释如下：
1：0-20％抑制
2：21-40％抑制
3：41-60％抑制
4：61-80％抑制
5：81-100％抑制
试验
制备根据本发明的化合物如下：

邻位溴基磺酰胺
溶于二氯甲烷(1ml/mmol磺酰氯)的2-溴苯磺酰基氯化物(1当量)和吡啶(2当量)引入圆底烧瓶中。反应混合物冷却到0℃。缓慢添加取代的苯胺(1当量)。将获得的混合物搅拌整夜。添加0.5M盐酸溶液。分离有机相，用水，然后用盐水清洗。有机相干燥用硫酸钠，过滤、蒸发干燥。残余物用最少量甲醇研磨。获得所需化合物白色固体。

邻位炔基磺酰胺
N-取代的-2溴苯磺酰胺(1当量)与相应部端为炔基的化合物(1当量)在二异丙胺(5ml/mmol N-取代的-2溴苯磺酰胺)混合。在这种混合物中，添加三苯基膦(0.01当量)、碘化亚铜(0.01当量)和乙腈氯化钯配合物(0.01当量)。获得的反应混合物回流整夜，用硅藻土层过滤，在减压下浓缩。柱状色谱分离产生所需产物白色-浅黄色粉末。

邻位腙磺酰胺
磺酰胺肼(1当量)溶于THF(5ml/mmol肼)，并在回流温度在存在催化剂量的对位甲苯磺酸下，用相应的醛(1当量)处理整夜。获得的反应混合物在减压下浓缩，残余物从甲醇中再结晶和/或柱状色谱分离产生所需产物明亮浅黄色粉末。

邻位吡唑磺酰胺
磺酰胺肼(1当量)溶于纯乙醇(5ml/mmol肼)，并在回流温度用相应的酮炔(1当量)处理4小时。获得的反应混合物在减压下浓缩，残余物从甲醇中再结晶和/或柱状色谱分离产生所需产物明亮浅黄色粉末。

邻位氨甲酰磺酰胺
邻位甲基碳酸酯磺酰胺(1当量)与相应苄胺(1当量)在乙腈中混合(5mL/mmol酯)。反应混合物加热到50℃半小时，缓慢添加纯三乙胺(1.2当量)。获得的混合物回流整夜。通过溶剂蒸发，柱状色谱分离产生所需羧酰胺磺酰胺白色固体。

邻位酰胺磺酰胺
取代的酰基氯(1当量)在二氯甲烷(5mL/mmol酰基氯)中溶解，冷却到0℃。缓慢添加溶于二氯甲烷(5ml/mmol酰基氯)的冷吡啶(2当量)，获得的溶液室温培养2小时。获得反应混合物冷却到0℃。缓慢注射2-氨基-4-取代的苯磺酰胺(1当量)的二氯甲烷溶液(5mL/mmol磺酰酰胺)。获得的反应混合物搅拌整夜，同时允许温度升高至室温。添加0.5M盐酸溶液。有机相分离，用水，然后用盐水清洗。有机相用硫酸钠干燥，过滤，蒸发干燥。残余物用最少量甲醇研磨，柱状色谱分离，获得所需产物白色固体。
选择性质谱和1H-NMR数据(相对于氘化二甲亚砜以ppm给出，s：单峰，d：双峰，t：三峰，q：四峰，dd：双二重峰，dt：双三峰，m：多峰，b：谱带)。



实施例
实施例1：体外基于ELISA的蛋白质-蛋白质相互作用分析
在细菌中产生蛋白
在pGEX-4T诱导的细菌表达载体(Pharmacia中，包括Lgs和β-连接素结合域的cDNAs融合谷胱甘肽-S-转移酶(GST)cDNA下游。按照厂商介绍在BL21细菌中(例如Stratagene)产生融合蛋白。
为了分离产生的融合蛋白质，在超声处理的缓冲液中研磨细菌，获得的粉末在旋转条件下，在溶菌缓冲液(10mM Tris HCl pH 8.0，150mM NaCl，1mMEDTA，1.5％肌氨酸，2％Triton-X-100，1mM DTT和蛋白酶抑制剂)溶解细菌。然后，短暂超声处理在冰上(例如3×20秒，以中间功率)并离心分离。透明上清液在4℃培养2小时，并用谷胱甘肽珠(Amersham Pharmacia)平缓旋转。最终，在清洗缓冲液中(20mM Tris pH 8.0，200mM NaCl，1mM EDTA，1mMDTT，1mM MgCl₂，0.5％NP40)清洗珠几次，并用存储缓冲液(20mM Tris pH8.0，200mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，1mM MgCl₂，10％甘油，0.5％NP40，和蛋白酶抑制因子)储存。通过本领域技术人员公知的标准方法，用SDS-凝胶电泳检查制备的质量。
连接分析
为了检测变异体与相应对象的连接，如上所述的固定在谷胱甘肽珠上的谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白，置于连接缓冲液中(20mM Tris pH 8.0，200mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，1mM MgCl₂，10％甘油，0.5％NP40，0.05％BSA，和蛋白酶抑制因子)45分钟。然后，在连接缓冲液中，用0.5-4μl IVT蛋白培养2μg固定的GST蛋白1.5小时。在清洗缓冲液(20mM Tris pH 8.0，200mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，1mM MgCl₂，0.5％NP40)中清洗珠4次，在Laemmli SDS样品缓冲液中煮沸。分别使用Coomassie着色和自动射线照相，通过SDS-PAGE分析证实使用等量完整intact GST-融合和IVT蛋白。
实施例2：癌细胞中Wnt活性抑制
可以使用对Tcf/Lef族转录因子敏感的报告基因在细胞培养体系中或通过在适合细胞系中Wnt目标基因的定性分析，对在基于ELISA的蛋白质-蛋白质相互作用分析中，确定的β-连接素/BCL9抑制剂对Wnt通路的作用进行评价。
报告基因包括，容易检测或分析的基因，例如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白质、氯霉素乙酰基转移酶或荧光素酶，与转录因子响应元件和最少启动子顺式连接。取决于使用的表达载体，可应用这种方法，例如对于哺乳动物以及果蝇细胞系。例如，具有固有constitutively活性Wnt通路的结肠癌细胞，像DLD-1或SW620(ATCC)是非常适合的体系。因此，Tcf-4调控的荧光素酶指示质粒(即TOP-FLASH，Upstate biotechnology，NewYork，USA)染瞬或稳定转染到本领域中已知的细胞上。能使用任何方式在细胞中引入遗传物质，包括，但不局限于感染、电穿孔或转染。例如，为了在DLD-1细胞中引入DNA，能使用脂质体lipofection剂，例如脂质体转染试剂(Life Technologies，Inc.)。通过染瞬转染方式，第二报告基因，例如Renilla荧光素酶报告质粒pRL-SV40(PromegaCorporation，Madison USA)，需要共同转染，以使转染效率标准化。在转染24小时后(染瞬转染)或在细胞放入晶种24小时后(稳定转染细胞)，在介质中添加药物。制备细胞提取物24-48后，如厂商描述分析报告基因活性(例如对于荧光素酶活性：Promega Corporation)。与溶剂单独处理细胞相比，降低报告基因活性多于50％的化合物作为采样。同时，能例如通过黄色四唑嗡盐细胞增殖分析(MTT)，分析评价毒性。
参考文献
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