本发明涉及的是一种用于治疗肝炎、肝硬化等疾病的药物-促肝细胞生长素，具体的讲，它是一种从幼龄动物的新鲜肝脏中提取的分子量约为一万的肝细胞刺激因子，属于一类生化药物。本发明也是本申请人的CN 89107217的后续专利。 多年来，研究人员一直在研究能阻止肝细胞坏死和能促进肝细胞再生的物质，所述的研究集中在肝脏本身所产生的肝再生刺激因子的上，并已证明它们具有刺激肝细胞再生的作用。
申请人CN 89107217中已公开了一种采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法，该制备方法简单方便，易于推广应用，便于大批量生产；但由于没有给出该方法所生产出的制品的物化参数或没有给出测试的条件，因此无法确定该多肽化合物地具体结构或无法用已公开的参数来确定该多肽化合物，这样就使所生产出的产品没有重现性。
本发明的目的在于提供一种以幼龄哺乳动物的新鲜肝脏为原料，制备一种用于治疗肝炎、肝硬化等疾病并且具有高度重现性和更高的相对活性的药物-促肝细胞生长素。
本发明的目的可以通过以下方法实现：采集幼龄哺乳动物的新鲜肝脏，除去肝膜及韧带后切碎，加入蒸馏水在高速捣碎机中高速捣碎并制成匀浆，离心沉淀去沉渣，取上清液装入透析装置中进行透析将透析物用Sephadex LH20柱层析分离后得到本发明所述的促肝细胞生长素。
本发明的附图说明如下：
图一是本发明采用小于60天乳猪的新鲜肝脏制备的促肝细胞生长素在波长为λ=254nm下的高效液相色谱；
图二是本发明采用乳猪的新鲜肝脏制备的促肝细胞生长素在波长为λ=230nm下的高效液相色谱；
图三是本发明采用乳猪的新鲜肝脏制备的促肝细胞生长素在波长为λ=280nm下的高效液相色谱；
图四是本发明所述的促肝细胞生长素的红外光谱图；
下面结合附图和各种表格所列数据对本发明所述的促肝细胞生长素作进一部的说明：
本发明的详细的制备工艺是采集猪龄（或其它动物，如乳牛、大鼠等）小于60天乳猪的新鲜肝脏，要求离体6小时以内，去肝膜及韧带切碎；按1克肝加2～5克蒸馏水的比例加入蒸馏水后打碎制成匀浆；离心沉淀去沉渣，用透析装置截取数均分子量为10685D，重均分子量为11350D的透析液，低温浓缩，调整多肽量高于5mg/ml。然护用现有技术中的除菌方法，如正压超滤除菌。
对再生肝细胞有丝分裂的影响的实验按如下步骤进行：
促肝细胞生长素的分离Sephadex LH20柱，直径9mm，柱长100cm，将20mg的促肝细胞生长素溶于0.5ml0.05MPBS(PH7.4)加于层析柱上，采用0.05MPBS（PH7.4）淋洗，流速为1.1ml/5min，收集样品，测光密度值，样品收集后冻干低温保存。
体内实验雄性Wistar大鼠，135～190g，于上午9∶00～11∶30在戊巴比妥钠（4mg/100g体重）麻醉下进行32%的肝部分切除，术后4-6小时经腹腔分别注射生理盐水4ml，促肝细胞生长素20ml，促肝细胞生长素经层析柱后的分离组分，于30小时固定于肝右叶中下1/3处取材，Bouin's液固定，包埋切片6u，H.E染色，有丝分裂计数。
体外实验，雄性豚鼠200-300G，经心脏采血致死，无菌取出肝脏，冲洗后剪碎于100目尼龙网上轻研，过滤，用含10%胎牛血清1640培养液制备肝细胞悬液，细胞计数为5-7*10的5次方个/ml,0.2%台盘蓝染色活率为81%。当活率大于70%时进行24孔板培养，每孔加1ml含血清1640培养液，37度，5%CO2，培育4小时，吸取各孔的上清液，正常对照组不加促肝细胞生长素，实验组每孔加含40ug促肝细胞生长素的无血清1640培养液，24小时每孔加2uci的3H-dTR，37度，5%CO2，2.5小时，分别收集各孔的细胞，用0.01MPBS冲洗3次，涂于玻璃纤维滤纸片上，37度干燥过夜，将纸片放入闪烁杯中，加闪烁液5ml，闪烁计数器测各样品的CPM值。
从小于60天的乳猪或其它附合上述条件的哺乳动物的肝脏中提取出来的提取物经Sephadex LH20柱层析后得6个活性峰，其中第一峰占相对面积为27%，第二峰为23.3%，第三峰为14.2%，第四峰为19.4%，第五峰为10.6%，第六峰为5.5%。然后将促肝细胞生长素及各活性峰进行对再生肝细胞有丝分裂的影响的实验。
实验结果表明，除第2峰外，其余各峰均能明显促进再生肝细胞的有丝分裂。各活性峰的使用剂量均为20mg；所述的提取物经分离后的组份尽管蛋白含量减少，但活性并未见明显降低，尤其是第6峰和第3峰，其活性分别为对照组的3.3倍和3.1倍（见表一），与20mgHGF的活性相似（3.6倍）。并使体外培养肝细胞的DNA合成增加到原来的3.24倍（表二），表明本发明所述的促肝细胞生长素能够促进细胞的DNA合成和有丝分裂。说明从乳猪中提取出来的提取物经提纯后，其产物虽蛋白含量减少，而相对活性有所提高。
促肝细胞生长素及其组分对再生肝细胞有丝分裂百分率的作用影响见下表1；各活性峰的使用剂量均为20mg促肝细胞生长素经SephadexlLH20柱层析分离后的组分：
表1.促肝细胞生长素及各活性峰对再生肝细胞有丝分裂的影响
动物数 有丝分裂百分率 倍数 P值
对照组 8 0.944 0.166
HGF(20mg) 10 3.416 0.434 3.6 <0.001
峰1 3 2.421 0.625 2.6 <0.001
峰2 5 0.460 0.311 0.5 >0.05
峰3 4 2.925 0.605 3.1 <0.001
峰4 4 2.394 0.930 2.5 <0.05
峰5 6 1.860 0.581 2.0 <0.05
峰6 3 3.130 0.640 3.3 <0.001
从表一可知，从小于60天的乳猪中提取出来的提取物的第2峰有丝分裂百分率为0.460±0.311，比盐水对照组0.944±0.166还低，但没有显著性差异（P＞0.55），因此，第2峰具有抑制肝细胞增生的作用或第2峰就是所谓的肝抑制因子。
表2 本发明促肝细胞生长素对体外肝细胞
DNA3H-dTR掺入量的影响
孔数 CPM值 倍数 P值
对照组 4 6565.3 1579.2
实研组 4 21275.5 7683.3 3.24 <0.05
本实验结果表明，从乳猪中提取出来的提取物的分子量在10，000左右，经Sephadex LH20柱层析分离后得6个峰，5个峰具有促进肝细胞增生的活性，说明HGF的分子量在1万左右呈连续性分布（表一）。因此，促进肝细胞增生的生物因子并不是单一分子，而是许多不同分子量的蛋白和核酸共同作用的结果。
现有技术所述的肝细胞生长因子有两种来源：1.肝外来源：包括血清中肝特异性的生长因子，PDGF、胰岛素，胰高血糖素等；2.肝脏来源：即本发明所述的促肝细胞生长素。而对于上述1所述的因子能否促进肝细胞的有丝分裂没有文献报道。本发明所述的促肝细胞生长素的研究结果表明：促肝细胞生长素能促进肝细胞的DNA合成，和促进再生肝细胞的有丝分裂，证实促肝细胞生长素可做为肝细胞的有丝分裂原而存在。
将本发明所述的促肝细胞生长素不进行Sephadex LH20柱层析分离，而用高效液相色谱进行分析，在λ=280下测定本发明所述的促肝细胞生长素主要峰保留时间（tr）和峰的面积（A%）
表三 λ=280本发明所述的促肝细胞生长素主要峰保留时间（tr）和峰的面积（A%）
设定方法如下，在分离较完全的条件下：
1、可用（2+3）及4号峰表示促肝细胞生长素的主成份峰，其面积和占总峰面积的27%；
2、可用6、7、9、10号峰表征第二类峰，其面积约占总峰面积的35%；
3、其它可看作第三类表征峰；
4、所有峰的保留时间（tr）是在上述特定的色谱条件下测定的，除色谱分离的流动相外，也会受到使用不同厂家生产的柱而有所变化（均为反相碳十八柱）。这样，上数述批号的试样的平均数为：
峰号 1 2+3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A% 5.5 10.02 17.19 3.76 7.13 8.90 6.24 9.82 9.126 4.81 4.27
在λ=230nm下测定本发明所述的促肝细胞生长素主要峰保留时间（tr）和峰面积（A%）
表四 在λ=230nm本发明所述的促肝细胞生长素主要峰保留时间（tr）和峰面积（A%）
RECALC
TITLE:HPLC ANALYSIS OF HGF PRODUCTS 11:47 6 JUL 93
CHANNEL NO:1 SAMPLE:930504,λ=230nm METHOD:HGF
PEAK PEAK RESULT TIME AREA SEP
NO NAME A% (MIN) COUNTS CODE
1 14.57 1.847 1058320 BV
2 1.17 1.975 295812 VV
3 2.42 2.026 175749 VV
4 7.39 2.121 536837 VV
5 11.30 2.404 820881 VV
6 2.59 2.697 187853 VV
7 1.80 2.837 130449 VV
8 4.07 2.917 295518 VV
9 6.86 3.121 498003 VV
10 3.82 3.573 277642 VV
11 16.46 3.852 1195300 VV
12 7.88 4.131 572303 VV
13 2.52 4.662 183398 VV
14 3.59 5.377 260895 VV
15 2.03 6.986 147232 VV
16 5.36 7.974 389223 VV
17 1.71 8.446 124053 VV
18 1.57 9.334 113865 VV
TOTALS: 100.01 7263330
MULTIPLIER:1.00000
具体的谱图见图二；
本发明制备出来的促肝细胞生长素，经高效液相色谱组份分析证明，促肝细胞生长素的数均分子量为10685D，重均分子量为11350D的小分子物质；并排除促肝细胞生长素中含有胰岛素、胰高糖素的存在；活性测定表明有明显的刺激肝细胞DNA合成的作用，与盐水对照有显著的差异。
本发明所束述的促肝细胞生长素还含有多种微量元素和多种氨基酸。
表五：促肝细胞生长素的氨基酸含量的分析测定结果
表5说明：采用本发明的方法制备的促肝细胞生长素含有18种氨基酸，总量点25.06。
表六促肝细胞生长素微量元素分析测定平均值（μg/ml)
Fe Se Mg Zn Ca Mn Co Cu K
7-8 <0.05 100-150 13-16 35.0 0.40 <0.005 0.76 >2000
表6表明，促肝细胞生长素中除含有K、Na、Ca、Mg外，还存在着比正常人血清高15倍的Zn和微量的Se。
实施例一
按前述方法制备促肝细胞生长素，所述样品的数均分子量为10685D，重均分子量为11350D；以表七的表头所列条件进行色谱分析，结果如表七。
实施例二
和实施例一同样的方法制备样品，在λ=280nm的波长下对本发明所述的促肝细胞生长素进行高效液相色谱分析，相应的图是图三，具体的结果见表八。
实施例三
和实施例一同样的方法制备样品，在表九所列的条件下对本发明所述的促肝细胞生长素进行色谱分析，相应的图是图一，具体的结果如表九列出：
实施例四
和实施例一同样的方法制备样品，对本发明所述的促肝细胞生长素进行红外光谱分析，见图四；
本发明与现有技术中所述的类似产品相比具有无过敏反应、降酶幅度大、速度快、退黄显著等优点，并能明显改善患者肝区疼痛、乏力、腹胀等症状。
表七
SAMPLE: DATA FJLE:-57.BFF DATE:07/28/93
METHOD: METHOD FJLE:-05.MTH TIME:08:09:00
ANALYST: SYSTEM FILE:1
TYPE:AREA PERCENT RUN NUMBER:4 JNDEX:1
WAVELENGTH:254nm
PEAK# AREA% RT AREA BC
1 0.058 0.37 20523 02
2 0.229 0.67 81398 02
3 0.058 0.69 20634 02
4 0.229 0.93 81152 02
5 0.407 0.97 144363 02
6 0.105 1.25 37126 02
7 0.096 1.31 34182 02
8 0.087 1.37 30791 02
9 0.078 1.44 27597 02
10 0.079 1.47 28088 02
11 0.626 1.65 222148 02
12 3.737 2.11 1325509 02
13 5.03 2.54 1784302 02
14 70.657 2.67 25064159 08
15 3.46 3.17 1227501 05
16 4.297 3.7 1524113 01
17 0.064 3.88 22789 01
18 2.773 4.41 983652 01
19 0.078 5.04 27440 62
20 0.063 5.25 22371 62
21 0.211 5.67 74896 62
22 1.931 5.88 685214 02
23 0.062 6.2 21836 02
24 1.099 6.41 390033 02
25 0.144 6.72 50889 02
26 0.356 7.6 126410 02
27 1.268 9.07 449748 02
28 0.193 9.97 68480 02
29 0.557 10.09 197559 02
30 0.111 10.97 39440 02
31 0.092 11.49 32485 02
32 0.132 12.04 46970 02
33 0.088 12.1 31185 02
34 0.086 12.16 30314 02
35 0.161 12.25 57239 02
36 0.068 12.37 24198 02
37 0.067 12.42 23552 02
38 0.072 12.47 25795 02
39 0.071 12.53 24923 02
40 0.103 12.65 36570 02
41 0.056 12.73 20005 02
42 0.279 12.82 99026 02
43 0.2 13.12 70894 02
44 0.08 13.45 28336 02
45 0.178 13.77 63086 02
46 0.056 14.01 20068 02
47 0.068 14.16 23983 03
TOTAL 100. 35472972