CACNA1E突变基因及其检测方法和应用.pdf

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1、10申请公布号CN104293796A43申请公布日20150121CN104293796A21申请号201410524704922申请日20141008C12N15/12200601C12Q1/68200601C12N15/113201001C12N15/87200601A61K48/00200601A61P35/0020060171申请人中国科学院动物研究所地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院5号72发明人周光飚吴黎川程昕74专利代理机构北京泛华伟业知识产权代理有限公司11280代理人郭广迅54发明名称CACNA1E突变基因及其检测方法和应用57摘要本发明提供了一种检测CACNA1E。

2、突变基因的方法，该方法为全基因组深度测序法或毛细管电泳测序法。本发明还提供了CACNA1E突变基因。进一步地，本发明提供了一种检测CACNA1E突变基因的试剂盒以及上述试剂盒在肺癌的预防、检测和/或治疗中的应用。本发明还提供了上述突变基因和检测方法在肺癌的预防、检测和/或治疗中的应用。通过全基因组测序及基于特异性PCR反应，在肺癌病人样本中发现了基因CACNA1E突变位点，通过检测其突变可为临床治疗、用药提供分子分型、治疗靶点等理论基础，为预防及治疗肿瘤提供新的思路。51INTCL权利要求书2页说明书12页序列表15页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书。

3、12页序列表15页附图2页10申请公布号CN104293796ACN104293796A1/2页21一种CACNA1E突变基因，其中所述CACNA1E突变基因的至少一个突变位点位于CC356A、CC507T、CC535A、CG746T、CG823T、CG1054T、CG1173T、CG1276T、CG1637T、CG2315T、CG2385T、CG2552T、CC2773A、CT3038A、CG3981T、CG4303A、CG4994T、CG5608T、CC5825A、CG6037T、CC6871A、CC6862A、CG6865T、CA6515G、CC253A；优选地，所述突变位点还位于CA6。

4、515G，其中所述CACNA1E突变基因为HELA细胞系中的突变基因；优选地，所述突变位点还位于CC356A，其中所述CACNA1E突变基因为LXA07细胞系中的突变基因。2一种检测如权利要求1所述的CACNA1E突变基因的方法，所述方法通过全基因组深度测序法或毛细管电泳测序法确定突变基因。3根据权利要求2所述的方法，其中，所述突变位点定位于ION_TRANS结构域、PKD_CHANNEL结构域、CA_CHAN_IQ结构域和/或其它他非功能区；优选地，所述核苷酸突变位点至少具有以下的一种或多种CC356A、CC507T、CC535A、CG746T、CG823T、CG1054T、CG1173T、。

5、CG1276T、CG1637T、CG2315T、CG2385T、CG2552T、CC2773A、CT3038A、CG3981T、CG4303A、CG4994T、CG5608T、CC5825A、CG6037T、CC6871A、CC6862A、CG6865T、CA6515G、CC253A；进一步优选地，所述突变位点还位于CA6515G、CC253A。4根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述方法通过毛细管电泳测序法确定突变基因，包括以下步骤1对CACNA1E基因的每个外显子设计特异性PCR引物，并进行PCR扩增；优选地，所述PCR产物大小控制在4001200BP之间；优选地，所述PCR引物的序列如。

6、SEQIDNO1SEQIDNO92所示；2PCR产物纯化后毛细管电泳测序检测，将得到的序列与UCSC网站中的CACNA1E的基因序列GRCH37/HG19比较，从而确定CACNA1E基因的突变位点；优选地，所述方法还包括将得到的PCR产物按照正常的读码框进行翻译，以确定CACNA1E的突变位点。5一种用于检测如权利要求1所述的CACNA1E突变基因的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增CACNA1E突变位点的引物；优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增酶、缓冲液、酶切不同突变位点的相应的限制性内切酶；优选地，所述PCR引物的序列选自SEQIDNO1SEQIDNO92所示的序列中的一种或多种。6一种用于干。

7、扰如权利要求1所述的CACNA1E突变基因表达的SIRNA的组合；优选地，所述SIRNA的序列为SEQIDNO935CCUCCGGCUUCUAAGAAUA3；CACNA1E干扰1SEQIDNO945CGCCAUUUGAGUACAUGAU3CACNA1E干扰2。7一种用于干扰如权利要求1所述的CACNA1E突变基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求6所述的SIRNA序列；优选地，所述试剂盒中还包括PCR扩增酶及相应缓冲液。权利要求书CN104293796A2/2页38如权利要求7所述的试剂盒的使用方法，所述方法为二次干扰法；优选地，所述二次干扰法是通过包括以下步骤的方法实现的A将受试者的细胞。

8、接种于6孔板，接种密度为1105个细胞/孔，并使用培养基培养优选地，所述培养基为含10FBS的RPMI1640/DMEM培养基；B一天后，吸掉培养基，加入800LOPTIMEM培养基；C将转染试剂HYPERFECT2000及25LSIRNA20M加入到含200LOPTIMEM的RNASEFREE的管子中，漩涡振荡混匀，室温静止1015分钟；D将混和液加入到6孔板中，细胞培养箱中培养6小时左右；E6小时后，用新鲜培养基代替转染液；F第三天重复步骤AE。9一组用于扩增如权利要求1所述的CACNA1E突变基因的引物和/或用于干扰如权利要求1所述的CACNA1E突变基因的SIRNA在制备用于预防、检测。

9、和/或治疗肺癌的药物或试剂盒中的用途；优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增酶、缓冲液、酶切不同突变位点的相应的限制性内切酶；优选地，所述引物选自SEQIDNO1SEQIDNO92所示的序列中的一种或多种优选地，所述SIRNA为SEQIDNO93和/或94。权利要求书CN104293796A1/12页4CACNA1E突变基因及其检测方法和应用技术领域0001本发明属于肿瘤生物学领域，具体涉及一种CACNA1E突变基因的检测方法及其突变基因。进一步地，涉及检测上述突变基因的试剂盒以及该试剂盒的应用。另外，本发明还涉及检测方法、基因和/或试剂盒在肺癌的预防、检测和/或治疗中的应用。背景技术0002癌基。

10、因是一类能诱发癌症的基因。癌症的发生往往与癌基因的异常表达及其活化相关。在肿瘤组织样本中，与之相关的癌基因普遍高表达，同时这些癌基因突变后导致其活性大大增强。以表皮生长因子受体EGFR为例，在肺癌肿瘤样本中，EGFR的高表达导致了PI3KAKT信号通路异常激活，从而导致了细胞异常增生。结合临床资料分析，EGFR突变导致病人对药物吉非替尼等产生敏感性，如发生在EGFR第21号外显子L858R及第19号外显子的突变使得病人对吉非替尼敏感。另一方面，在临床治疗过程中，病人逐渐产生耐药性。进一步研究显示，这种耐药性的产生是由于EGFR第20号外显子发生突变T790M而导致的。针对于此，在肺癌患者进行临。

11、床治疗前，对其EGFR突变筛查已成为临床及个性化治疗的常规手段，并已取得较好的效果。由此可见，针对相关癌基因突变检测对于预防及治疗癌症尤其是肺癌意义重大。但是由于EGFR等其他癌基因的突变在肺癌病人中只占3050，还有一大部分病人的发病机理并不清楚，因此，应用新技术发现癌基因并检测其突变显得迫在眉睫。0003随着人类全基因组测序工作的完成以及测序技术的不断革新，全基因组测序已经逐渐成为肿瘤基因组研究的有利武器。CA2离子作为细胞内必不可少的第二信使参与了许多重要的生理、生化过程。而钙离子通道蛋白在调节钙离子的过程中起着至关重要的作用。近几年研究发现，肿瘤的发生、发展与钙相关蛋白有着密切的联系，。

12、例如，基因CACNA2D1能够维持肝癌细胞的肿瘤干细胞特点。0004基因CACNA1E是钙离子通道蛋白的1E亚基。它有3个转录本，这三个转录本编码的蛋白分别由2251、2270及2313个氨基酸组成。之前有报道，CACNA1E基因在肾母细胞瘤中呈高拷贝状态，其MRNA及蛋白均高表达，且这种高表达与肾母细胞瘤的复发正相关。但是，截止目前，基因CACNA1E在其他肿瘤中表达情况并不清楚，其在肿瘤样本中的突变与肿瘤的关系也并未报道。因此，研究CACNA1E在肿瘤中的表达与肿瘤的关系以及检测其突变及突变与肿瘤的关系对发现新的癌基因、预防及治疗肿瘤意义重大。发明内容0005发明人使用全基因组测序技术，对。

13、来自中国多环芳烃污染严重的肺癌高发地区的14个病人的癌及癌旁组织进行了深度测序，数据分析发现，钙离子信号通路及钙离子通道蛋白在这些病人体内发生了大量突变。在全基因组测序结果中，钙离子通道蛋白突变不仅得到富集而且有着很高的突变频率，尤其是基因CACNA1E。0006进一步地，发明人针对基因CACNA1E的每一个外显子序列特点，设计每一个外显说明书CN104293796A2/12页5子的特异性引物，通过聚合酶链式反应PCR，在164例病人标本以及5个细胞系L78细胞系、95D细胞系、HELA细胞系、NCIH1975细胞系及XLA07细胞系中将CACNA1E的所有外显子扩增出来，并通过毛细管电泳测序。

14、找出引起CACNA1E氨基酸改变的突变。结果发现，在164例病人中共发现16例病人发生突变，其中在宣威/富源地区的79例病人中，有15例发生突变，突变频率达到19；在广州及云南非宣威/富源地区的85例病人中只有1例病人发生突变，突变频率为12。0007本发明提供了一种检测CACNA1E突变基因的方法，该方法为全基因组深度测序法或毛细管电泳测序法。0008本发明还提供了CACNA1E突变基因。0009本发明进一步提供了一种检测CACNA1E突变基因的试剂盒以及上述试剂盒在肺癌的预防、检测和/或治疗中的应用。0010本发明还提供了上述突变基因和检测方法在肺癌的预防、检测和/或治疗中的应用。0011。

15、根据本发明的一方面，本发明提供了一种检测CACNA1E突变基因的方法，所述方法为全基因组深度测序法或毛细管电泳测序法。0012优选地，所述方法为毛细管电泳测序法，所述方法包括以下步骤00131对CACNA1E基因的每个外显子设计特异性PCR引物，并进行PCR扩增；0014优选地，所述PCR产物大小控制在4001200BP之间；0015优选地，所述PCR引物的序列如SEQIDNO1SEQIDNO92所示；00162PCR产物纯化后毛细管电泳测序检测，将得到的序列与UCSC网站中的CACNA1E的基因序列GRCH37/HG19比较，从而确定CACNA1E基因的突变位点；00173将得到的PCR产物。

16、按照正常的读码框进行翻译，以确定CACNA1E的突变位点。0018优选地，所述核苷酸突变位点至少具有以下的一种或多种CC356A、CC507T、CC535A、CG746T、CG823T、CG1054T、CG1173T、CG1276T、CG1637T、CG2315T、CG2385T、CG2552T、CC2773A、CT3038A、CG3981T、CG4303A、CG4994T、CG5608T、CC5825A、CG6037T、CC6871A、CC6862A、CG6865T。进一步优选地，所述突变位点还位于CA6515G、CC253A。0019再一方面，本发明提供了一种CACNA1E突变基因，其中所。

17、述CACNA1E突变基因的核苷酸序列至少一个突变位点位于CC356A、CC507T、CC535A、CG746T、CG823T、CG1054T、CG1173T、CG1276T、CG1637T、CG2315T、CG2385T、CG2552T、CC2773A、CT3038A、CG3981T、CG4303A、CG4994T、CG5608T、CC5825A、CG6037T、CC6871A、CC6862A、CG6865T、CA6515G、CC253A。0020优选地，所述CACNA1E突变基因的编码蛋白质序列至少一个氨基酸突变位点位于PP119H、PL169F、PH179N、PR249L、PA275S、P。

18、G352W、PE391D、PD426Y、PG546V、PR772L、PE795D、PS851I、PR925S、PL1013Q、PK1327N、PE1435K、PW1665L、PA1870S、PS1942Y、PD2013Y、PP2291T、PR2288S、PG2289W。进一步优选地，所述突变位点还位于PY2172C、PL85I。0021本申请中所有的突变命名是基于国际上突变的命名原则，包含了三部分，突变前氨基酸突变的氨基酸位置突变后氨基酸，如A275S，即突变导致了第275个氨基酸由突说明书CN104293796A3/12页6变前的丙氨酸A变成了突变后的丝氨酸S，核苷酸突变同理。0022本发明。

19、还提供了一种检测CACNA1E突变基因的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增CACNA1E突变位点的引物，优选地，所述试剂盒包括SEQIDNO1SEQIDNO92所示的引物。0023优选地，所述试剂盒还包括常用的PCR组分，例如PCR扩增酶以及相应的缓冲液。0024需要说明的是，试剂盒中的引物可以根据已知的氨基酸序列设计，这是本领域的常规技术手段。0025本发明提供的试剂盒的具体使用方法如下所示00261CACNA1E各外显子特异性PCR引物的设计0027运用软件PRIMER5设计CACNA1E48个外显子的特异性引物，共46对引物；设计引物时，将产物大小控制在4001200BP之间，并通过NCBI。

20、BLAST功能BLAST结果为单一性，在本发明的一个优选的实施方案中，所述引物如表1所示。00282PCR产物扩增0029PCR反应体系为20L，模板DNA用量为10NG。0030PCR程序为95,5分钟，95,30秒，60,45秒，72，1分钟，35个循环，最后72延伸10分钟。00313PCR产物进行毛细管电泳测序，将得到的序列与CACNA1E的基因序列比较，从而判断是否存在突变位点。0032另外，也可以直接针对某个或某些突变位点设计引物，例如引物可以为SEQIDNO1SEQIDNO92所示的序列中的一种或多种。0033由于上述试剂盒可以检测到CACNA1E基因的突变情况，而CACNA1E。

21、基因在肺癌病人，尤其是中国多环芳烃污染严重的肺癌高发地区及细胞系中具有较高的突变率，因此该试剂盒可以应用到肺癌的预防、检测和/或治疗中。0034同样地，本发明提供的CACNA1E突变基因和检测方法也可以应用到肺癌的预防、检测和/或治疗中的应用。例如，由于本发明发现了在中国多环芳烃污染严重地区的肺癌中基因CACNA1E发生了突变，并通过一系列实验证实了基因CACNA1E与肺癌发生相关，因此基因CACNA1E及其突变位点可以作为肺癌的治疗靶点。0035优选地，可以通过SIRNA干扰技术，干扰掉CACNA1E，从而达到降低肿瘤的成瘤能力或者抑制肿瘤生长的目的，用于治疗和/或预防肺癌。0036因此，本。

22、发明还提供了一种SIRNA的组合，所述SIRNA为用于干扰CACNA1E表达的特异性SIRNA。优选地，所述SIRNA的序列为0037SEQIDNO935CCUCCGGCUUCUAAGAAUA3；CACNA1E干扰10038SEQIDNO945CGCCAUUUGAGUACAUGAU3。CACNA1E干扰20039本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述SIRNA序列。所述试剂盒中还包括PCR扩增酶及相应缓冲液。0040本发明提供还提供了上述试剂盒的使用方法，优选地，所述方法为二次干扰法。0041在一个优选的实施方案中，所述二次干扰法是通过包括以下步骤的方法实现的0042A将受试者的细胞接种。

23、于6孔板，接种密度为1105个细胞/孔，并使用培养基培养；说明书CN104293796A4/12页70043优选地，所述培养基为含10FBS的RPMI1640/DMEM培养基；0044B一天后，吸掉培养基，加入800LOPTIMEM培养基；0045C将转染试剂HYPERFECT2000及25LSIRNA20M加入到含200LOPTIMEM的RNASEFREE的管子中，漩涡振荡混匀，室温静止1015分钟；0046D将混和液加入到6孔板中，细胞培养箱中培养6小时左右；0047E6小时后，用新鲜培养基代替转染液；0048F第三天重复步骤AE。0049由于上述试剂盒可以干扰CACNA1E突变基因的表达。

24、，从而抑制细胞的增殖、克隆形成、成瘤能力，并使细胞内的钙离子浓度以及细胞内磷酸化EGFR、ERK、AKT也随之下降，因此该试剂盒可以应用到肺癌的预防、检测和/或治疗中。0050本发明为检测癌基因CACNA1E突变提供了理论基础，设计了检测突变的特异性引物。在此基础上，本发明通过全基因组测序及PCR、毛细管电泳测序等方法公开了基因CACNA1E在肺癌病人尤其是中国多环芳烃污染严重的肺癌高发地区及细胞系中的突变情况。除此之外，本发明通过干扰的方式初步揭示了癌基因CACNA1E在肺癌发病中的作用。发明人发现，在带CACNA1E突变的细胞中干扰CACNA1E后，细胞的增殖、克隆形成、成瘤能力皆受到抑制。

25、，细胞内的钙离子浓度以及细胞内磷酸化EGFR、ERK、AKT也随之下降。0051本发明适用于检测癌基因CACNA1E的突变，包括病人来源的肿瘤组织及细胞系。通过检测其突变可为临床治疗、用药提供分子分型、治疗靶点等理论基础，为预防及治疗肿瘤提供新的思路。0052通过全基因组测序及基于特异性PCR反应在肺癌病人样本中发现了基因CACNA1E突变位点，这些突变位点在肺癌预防、诊断及治疗过程中的作用。设计针对CACNA1E的特异性小核酸RNA干扰序列SIRNA，通过干扰的方式在CACNA1E突变以及野生型的细胞中将蛋白CACNA1E干扰掉，检测细胞增殖，克隆形成能力、钙信号变化以及下游信号通路的变化。。

26、结果显示，在CACNA1E突变的细胞中，干扰CACNA1E后能明显抑制细胞的增殖以及克隆形成能力，并能导致细胞内钙离子浓度降低。同时，检测其下游信号通路发现，在带CACNA1E突变的细胞中，干扰CACNA1E，磷酸化的EGFR、ERK、AKT都下调。附图说明0053以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中0054图1为肺癌病人样本及细胞系中CACNA1E蛋白突变的结构示意图；其中图A为肺癌病人样本中CACNA1E蛋白突变的结构示意图；其中图B为肺癌细胞系XLA07和HELA细胞中CACNA1E蛋白突变的结构示意图；0055图2在基因CACNA1E发生突变的HELA细胞及肺癌细胞XLA07。

27、中，干扰CACNA1E后细胞增殖、克隆形成及相关信号通路变化；其中，A为HELA及XLA07细胞干扰CACNA1E后，增殖能力受到抑制；B为HELA细胞干扰CACNA1E后克隆形成能力受到抑制；C为HELA及XLA07细胞干扰CACNA1E后，磷酸化EGFR、磷酸化AKT及磷酸化ERK下调；0056图3为基因CACNA1E发生突变的HELA细胞及肺癌细胞XLA07中，干扰CACNA1E后细胞内钙离子浓度降低；其中，横坐标表示荧光强度，细胞内钙离子浓度越高，荧光越强；纵坐标是发射荧光的细胞比例；如图中所示，对照组中的细胞荧光强度要高于CACNA1E干说明书CN104293796A5/12页8扰后。

28、的细胞，即CACNA1E干扰后，细胞内钙离子浓度降低；0057图4为基因CACNA1E发生突变的HELA细胞中，干扰CACNA1E后，细胞成瘤能力受到抑制。其中，图A是在荷瘤的不同时间点测量肿瘤的体积，对照组中的瘤子体积明显大于CACNA1E干扰后的瘤子体积；图B是处死老鼠后将瘤子剥离下来后的瘤子照片；图C是老鼠处死时的荷瘤照片。具体实施方式0058下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。0059除非特别指明，以下实施例中采用的HELA细胞系购自协和细胞库；XLA07细胞系购自中国科学院昆明动物所；L78细胞系购自中国科学院上海细胞库、95D细胞系购自中。

29、国科学院上海细胞库、NCIH1975细胞系购自ATCC；0060除非特别指明，以下实施例中采用的裸鼠为NUDEMOUSE，购自北京大学医学部。0061除非特别指明，以下实施例中所用的试验方法均为本领域中所用的常规方法。0062除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。0063实施例1CACNA1E引物设计0064CACNA1E为R型电压门依赖性钙离子通道蛋白亚基1E，属于细胞膜表面蛋白，调控钙离子的细胞内入。同时还参与了多种钙离子依赖性的细胞生理生化反应，如肌肉收缩、神经递质的传递、基因表达调控、细胞运动、细胞分裂以及细胞死亡等。该基因目前发现有三个转录本，。

30、其最长的转录本为NM_0012052931，包含48个外显子，编码2313个氨基酸。其蛋白结构包含了三个ION_TRANS结构域、一个CA_CHAN_IQ结构域和一个PKD_CHANNEL结构域。登陆UCSC网站下载CACNA1E的基因序列，通过软件PRIMER5设计CACNA1E每一个外显子的特异性引物，将产物大小控制在4001200BP之间，并通过NCBIBLAST功能BLAST结果为单一性，具体的引物序列如表1所示。0065表1CACNA1E外显子特异性引物序列0066说明书CN104293796A6/12页90067说明书CN104293796A7/12页100068说明书CN1042。

31、93796A108/12页110069说明书CN104293796A119/12页120070实施例2CACNA1E突变基因的筛查0071通过PCR反应筛查164例患者及5例细胞系L78细胞系、95D细胞系、HELA细胞系、NCIH1975细胞系及XLA07细胞系中基因CACNA1E的突变情况结果见图1。007221筛查对象在164例肺癌患者中，79例来自中国多环芳烃污染严重的肺癌高发地区，即宣威/富源地区，85例来自对照地区，即广东/云南非宣威、富源地区。其中用以全基因组测序的14个患者来自宣威/富源地区，年龄跨度为3864岁。14个样本中，根据肺癌的组织学类型，11个是肺腺癌，3个是肺鳞癌。

32、；根据患者是否吸烟，6个是吸烟患者，8个是非吸烟患者。所有164例患者都有癌组织及相应的癌旁组织。007322DNA提取0074组织的破碎00751取小于30MG的肺癌组织，用组织破碎仪将其破碎；00762根据所取组织的重量加入一定体积的裂解液RLTBUFFER，室温裂解051小时，最高转速离心3分钟，小心地将上清吸走；00773将下面的裂解液转移到DNA柱子中，DNA柱置于2ML收集管中，轻轻地盖上盖子，8000G离心30秒；0078基因组DNA的提取00791接着组织破碎中的步骤3，往DNA柱中加入500LAW1缓冲液，DNA柱置于新的2ML收集管中，轻轻地盖上管盖，8000G离心15秒，。

33、弃滤液，此步的目的是漂洗DNA柱子的滤膜；00802向DNA柱中加入500L缓冲液AW2，轻轻地盖上管盖，高速离心2分钟，漂洗DNA柱子的滤膜；00813将DNA柱置于新的15ML收集管中，向滤膜中央滴加100L缓冲液EB，盖上管盖，室温静置1分钟，8000G离心1分钟，洗脱DNA。008223PCR扩增说明书CN104293796A1210/12页130083PCR条件为95,5分钟，95,30秒，60,45秒，72，1分钟，35个循环，最后72延伸10分钟。0084PCR扩增的反应体系0085008624结果分析0087PCR产物经3730毛细管电泳测序；0088测序结果用GENIOUS软。

34、件比对，找出与参考序列不一致的碱基突变；根据突变的位置及对比蛋白编码的三连密码子，确定突变对应的氨基酸编号结果见表2，在164例患者中共发现16例患者发生突变，其中，在宣威/富源地区的79例患者中，有15例发生突变，突变频率达到19；在广州及云南非宣威/富源地区的85例患者中只有1例患者发生突变，突变频率为12。具体地，编号为6和7的两例患者发生突变的位置相同，均为第823位的鸟嘌呤G突变为胸腺嘧啶T，其氨基酸突变为275位的丙氨酸突变为丝氨酸详见表2；编号为1的患者有两个位点发生突变，其对应的核苷酸突变和氨基酸突变分别为CC356APP119H、CC5825APS1942Y；编号为2的患者共。

35、有四个位点发生突变，其对应的核苷酸突变和氨基酸突变分别为CC507TPL169F、CC2773APR925S、CG4303APE1435K、CG6037TPD2013Y；编号为4的患者有两个位点发生突变，对应的核苷酸突变和氨基酸突变分别为CG746TPR249L、CG2315TPR772L；编号为7的患者共有四个位点发生突变，其对应的核苷酸突变和氨基酸突变分别为CG1054TPG352W、CG1173TPE391D、CG3981TPK1327N、CC6862APR2288S。0089表2CACNA1E突变基因的分布0090说明书CN104293796A1311/12页140091实施例3CAC。

36、NA1E突变基因中细胞增殖、克隆形成能力及相关信号通路研究0092通过SIRNA干扰，在带CACNA1E突变的细胞HELA及XLA07中检测细胞增殖、克隆形成能力及相关信号通路0093用50NM的CACNA1E小干扰序列SEQIDNO93和SEQIDNO94以11的比例混合使用SICE，GENEPHARMA及阴性对照序列SINC，GENEPHARMA分别处理带CACNA1E突变的细胞HELAY2172C和XLA07L85I。24小时后再次用50NM的SICE及SINC处理细胞。24小时后取1105细胞接种6孔板，分别于第2天、第4天收取细胞，用台盼蓝染色后对活细胞计数，发现在带CACNA1E突。

37、变的细胞中干扰掉CACNA1E后细胞增殖受到抑制。同说明书CN104293796A1412/12页15时，取1000个细胞接种至下层含06琼脂、10胎牛血清，上层含03琼脂、10胎牛血清的35MM培养皿中，在37、5CO2的细胞培养箱中培养15天。15天后用结晶紫染色，统计细胞克隆数。结果显示，在HELAY2172C细胞中干扰掉CACNA1E后，其克隆形成能力受到抑制图2B。WESTERNBLOTTING检测HELAY2172C、XLA07L85I细胞中CACNA1E干扰后下游分子变化。结果显示，在带CACNA1E突变的HELAY2172C及XLA07L85I细胞中，干扰掉CACNA1E后，细。

38、胞内磷酸化EGFR、ERK、AKT水平下降图2C。0094实施例4CACNA1E突变基因中钙离子浓度研究0095用50NM的SIRNASEQIDNO93和94SEQIDNO93和SEQIDNO94以11的比例混合使用处理带CACNA1E突变的细胞HELAY2172C和XLA07L85I，随机SIRNA作为对照。24小时后再次用50NM的SIRNACACNA1E及随机SIRNA处理这2个细胞。48小时后运用显微荧光测钙系统测量细胞内钙离子浓度。结果显示，在带CACNA1E突变的HELAY2172C及XLA07L85I细胞中，干扰掉CACNA1E后细胞内钙离子浓度下降图30096实施例5裸鼠成瘤能。

39、力研究0097用50NM的SIRNASEQIDNO93和SEQIDNO94以11的比例混合使用处理带CACNA1E突变的细胞HELAY2172C，随机SIRNA作为对照。24小时后再次用50NM的SIRNASEQIDNO93和SEQIDNO94以11的比例混合使用及随机SIRNA处理HELAY2172C细胞。分别取1106干扰及对照细胞接种至裸鼠腹部一侧，于接种后第7天，第10天，第13天及第16天测量肿瘤体积及老鼠体重。结果显示，在带CACNA1E突变的细胞HELAY2172C中干扰掉CACNA1E后，裸鼠成瘤能力受到抑制图4。0098HELA细胞干扰CACNA1E后通过皮下注射的方式注入裸。

40、鼠体内，不同时间点测量肿瘤体积大小。NCSIRNA作为阴性对照。结果显示，干扰CACNA1E后，肿瘤体积明显减小。说明书CN104293796A151/15页1600010002序列表CN104293796A162/15页170003序列表CN104293796A173/15页180004序列表CN104293796A184/15页190005序列表CN104293796A195/15页200006序列表CN104293796A206/15页210007序列表CN104293796A217/15页220008序列表CN104293796A228/15页230009序列表CN104293796A239/15页240010序列表CN104293796A2410/15页250011序列表CN104293796A2511/15页260012序列表CN104293796A2612/15页270013序列表CN104293796A2713/15页280014序列表CN104293796A2814/15页290015序列表CN104293796A2915/15页30序列表CN104293796A301/2页31图1图2说明书附图CN104293796A312/2页32图3图4说明书附图CN104293796A32。