制备环(Asp-DPhe-NMeVal-Arg-Gly)的方法 本发明涉及制备环五肽环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)的新颖方法。
EP0770622中公开了环五肽，包括环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)及其生理可接受盐。也可认为本发明是与EP0770622有关的选择发明。
通常，在肽合成的常规条件下环化线型前体分子可获得环肽。对两种氨基酸或含有多个氨基酸的两种片段进行选择性键合、或环化一种线型肽，并可采用适当的保护基团阻断不需要参与反应的相应氨基酸官能度。已开发的各种类型的保护基团如氨基、羧基、羟基、硫醇、或甲酰胺官能团，和胍官能团或咪唑氮，可为优化上述反应的需要而进行多种变化。可通过两种方法合成线型前体分子即线型肽，一方面是固相肽合成，另一方面是在溶液中。在这种情况下，可分步骤进行氨基酸的偶合或氨基酸的片段缩合。不同的偶合步骤可参与不同缩合剂，例如碳二亚胺、碳二咪唑，脲阳离子类型如TBTU，或混合酐方法或活性酯方法。
本发明目的是开发一种新颖的改进的制备环五肽环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)的方法。
令人惊奇地发现，联合使用保护基团如精氨酸侧链的胍基上的2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰(Pbf)和天门冬氨酸侧链的羧基上的苄基(Bzl)，对线型前体分子环化可合成最佳产率的环肽(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)。
本发明涉及制备环五肽环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)的方法，通过对选自
H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH，
H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH，
H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH，
H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBz)-OH或
H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH，的线型五肽进行环化并除掉保护基团而制得，如果适易，可进一步转化成其生理可接受地盐。
本发明进一步涉及制备环五肽环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)的方法，其特征在于线型五肽H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg-(Pbf)-Gly-OH是环化的。
环化选自
H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH，
H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH，
H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH，
H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-OH或
H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH的线型肽并进一步转化为其生理可接受盐的反应条件已被EP0770622公开，包括脱水剂、惰性溶剂和反应温度。
可在常规条件下除掉天门冬氨酸侧链上的苄基保护基团(参见T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective group in organic chemistry，第2版，Wiley，纽约1991年或P.J.Kocienski，Protecting groups，第1版，Ggeorg Thieme Verlag，Stuttgart-纽约1994年，H.Kunz，H.Waldman的Comprehensive organic synthesis，第6卷(B.，Trost，I.Fleming，E.W.Interfeldt)，Pergamon，Oxford.1991年，631-701页)，例如可在催化剂(例如，贵金属催化剂如钯，优选碳为载体)存在下用氢气处理。适宜的溶剂包括：醇如甲醇或乙醇，酰胺如DMF，或与惰性溶剂的混合物，例如与水的混合物。通常，在约0-100℃和约1-200巴的压力下进行氢解。优选20-30℃和约1-10巴。
例如，采用95％的三氟醋酸(TFA)处理可将Pbf保护基团(由L.A.Carpino等引入肽化学.，Tet.Lett.1993年，34：7829-7832页)除去。这种情况下，与结构相似的保护基团，如也可作为合成环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)侧链保护基的4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰(Mtr)和2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰(Pmc)相比，Pbf保护基团对TFA更不稳定。优选使用过量TFA而不另加溶剂。也可采用TFA和惰性溶剂的混合物，例如以6∶4联用的TFA/二氯甲烷。也可使用TFA加1-10％、优选2％水。裂解反应的温度约0-50℃，优选反应在15-30℃(室温)下进行。
本文采用的氨基酸缩略语代表下列氨基酸：Asp 天门冬氨酸Arg 精氨酸Gly 甘氨酸Phe 苯丙氨酸Val 缬氨酸
此外，上述和下述缩略语具有以下含义：Boc 叔-丁氧基羰Bzl 苯甲基CHA 环己胺D D-氨基酸的定性DCCI 环己基碳二亚胺DMAP 二甲氨吡啶DMF 甲基甲酰胺EDCI N-乙基-N′-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸
盐Et 乙基Fmoc 9-芴基甲氧基羰基HOBt 1-羟基苯并三唑Me 甲基MTBE 甲基叔-丁基醚Mtr 4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰NMe N-甲基化α-氨基酸NMP N-甲基吡咯烷酮OtBu 叔-丁基酯OMe 甲基酯Oet 乙基酯Pbf 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰Pmc 2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰POA 苯氧基乙酰基Pr 丙基Su 琥珀酰亚胺TBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-四
氟硼酸脲TFA 三氟醋酸Z 苄氧基羰基
令人惊奇地发现，在合成线型肽即合成环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)中间体时，侧链保护基Pbf和Bzl分别对Arg和Asp有特异选择性，这使得各合成阶段的产率提高。这样就整体地提高了环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)的产率，也就降低了合成成本。
以固相肽和以溶液的形式合成线型肽
H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH，
H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH，
H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH，
H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-OH或
H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH，
特别是H-Asp(oBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH时，均可提高产率。
两种合成方法中所用的保护的氨基或氨基酸片段，可采用常规的氨基酸和肽合成方法制备，例如可在Principles of Peptide Synthsis，M.Bodansky编辑，Springer Verlag Berlin1984年；Houben Weyl，Methoden der organischen Chemie [Methods of OrganicChemistry]，1.c.，1974年，15/11卷，1-806页，Georg ThiemeVerlag，Stuttgart；Calbiochem/Novabiochem Catalogue and SynthesisHandbook 1999年；Synthesis Notes or Peptide SynthesisProtocols，M.W.Pennington；和B.M.Dunn，Molecular Biology，第35卷，Humana Press Totowa N.J.1994年中所描述的已知和适宜反应条件下进行。对于那些可能出现的已知变化，这里并不作进一步描述。
至于固相肽合成，其基本原理已由B.F.Gysin和R.B.Merrifiled阐述(J.Am.Chem.Soc.1972年，94：3102页以后的内容)。固相合成上述线型肽，其除掉保护基和纯化可参见A.Jonczyk和J.Meienhofer在Am.Pept.Symp第八届会议论文集(V.Hruby和D.H.Rich编辑)中的Peptides.，Pierce Comp.III，73-77页，1983年，或在Angew.Chem.1994年，104：375-391页中所描述的类似技术。
优选采用片段汇集缩合合成上述一种线型肽。
因此，本发明进一步涉及制备环五肽环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)的方法，其特征在于通过三肽R1-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH和二肽H-Arg-(Pbf)-Gly-R2的片段汇集缩合，然后除掉R1和R2而合成线型肽H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg-(Pbf)-Gly-OH，其中R1是氨基保护基团，R2是羧基保护基团。
如上所述，R1是氨基保护基团。所谓“氨基保护基团”，其含义通常是已知的，并且指可在化学反应中对氨基提供保护(或阻断)作用的基团。具体地说，典型的此类基团是未取代或取代的酰基、芳香基、芳烷氧甲基或芳烷基。在所需反应(或反应程序)后除掉这些氨基保护基团，其性质和大小并不重要，但是优选其具有1-20个C。术语“酰基”在本发明方法中具有最广泛的含义。它包括衍生于脂肪族、芳脂肪族、脂环烃、芳香族或杂环羧酸或磺酸的酰基，具体地说是烷氧羰基、链烯氧基羰基、芳氧基羰基和尤其是芳烷氧羰基。该类酰基的实施例包括甲酰基或烷酰基例如乙酰、丙酰、丁酰；芳烷酰基例如苯乙酰；芳香酰如苯甲酰、甲苯甲酰；芳氧基烷酰基如苯氧乙酰；芳烷氧羰基如甲氧羰基、乙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基、Boc、2-碘乙氧羰基；链烯氧基羰基如芳氧基羰基(Aloc)、芳烷氧羰基如CBZ(与Z同义)、4-甲氧苯甲氧基羰基(MOZ)、4-硝基苄氧基羰基或9-芴基甲氧羰基(Fmoc)；2-(苯磺酰)乙氧羰基；三甲基甲硅烷基-乙氧羰基(Teoc)或芳磺酰基如4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰(Mtr)。三苯甲基(Trt)也是已知的氨基保护基。氨基保护基优选为Boc、Fmoc和Aloc、及Z、苯甲基和乙酰基。特别优选Boc。
如上所述，R2是羧基保护基团。所谓“羧基保护基团”，其含义通常是已知的，并且指可在化学反应中对羧酸的羟基提供保护作用的基团。典型的此类基团是未取代或取代的芳香基、芳烷基、芳酰基或酰基，及烷基、芳基或芳烷基甲硅烷基。这些羧基保护基团及羟基保护基的性质和大小并不重要，在所需反应(或反应程序)后会除掉这些保护基团；优选这些基团具有1-20个C、特别优选1-10个C。羟基保护基的实施例尤其包括：芳烷基如苯甲基、4-甲氧基苯甲基或2，4-二甲氧基苯甲基、芳酰基如苯甲酰基或对硝基苯甲酰基，酰基如乙酰基或新戊酰、对-甲苯磺酰基、烷基如甲基或叔丁基，还有烯丙基、烷基甲硅烷基如三甲基甲硅烷基(TMS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)或三乙基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基乙基或芳烷基甲硅烷基如叔丁基联苯基甲硅烷基(TBDPS)。优选羟基保护基为甲基、苯甲基、乙酰基、叔丁基或TBS。特别优选甲基和叔丁基。
通常，天门冬氨酸侧链上的羧基保护基优选为直链或支链烷基，如甲基、乙基或叔丁基，或芳烷基如苯甲基；本发明为苯甲基。
通常，精氨酸侧链上的胍基保护基优选为Z、Boc、Mtr或Pmc。本发明为Pbf。
不同情况下采用的保护基可参见文献(如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective group in organic chemistry，第2版，Wiley，纽约1991年或P.J.Kocienski，Protective groups，第1版，GgeorgThieme Verlag，Stuttgart-纽约1994年)。也可用那些可能出现的已知变体，这里并不作进一步描述。
如上所述，本发明涉及一种方法，其特征在于通过Z-DPhe-OH与H-NMeVal-OMe反应生成H-DPhe-NMeVal-OMe，然后再与活化的R1-Asp(OBzl)-OH衍生物反应并分解掉甲酯，从而线型合成三肽R1-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH，其中R1是氨基保护基团。
R1-Asp(OBzl)-OH衍生物优选为琥珀酰亚胺R1-Asp(OBzl)-Osu。可能采用的其它活化酯可见常规的肽合成文献。
如上所述，本发明涉及一种方法，其特征在于线型合成Z-Arg-(Pbf)-OH并除掉保护基团Z，从而制得二肽H-Arg-(Pbf)-Gly-R2，其中R2是羧基保护基团。
本发明还涉及选自以下的线型五肽
H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH，
H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH，
H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH，
H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-OH或
H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH，作为合成环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)的中间体。
本发明涉及制备环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)的方法，即通过：
a)将Z-Arg-(Pbf)-OH与H-Gly-R2反应并除掉保护基团Z从而线型合成的二肽H-Arg-(Pbf)-Gly-R2与
b)通过Z-DPhe-OH与H-NMeVal-OMe反应并除掉保护基团Z生成H-DPhe-NMeVal-OMe，然后再与活化酯R1-Asp(OBzl)-OH衍生物偶合并分解掉甲酯，从而线型合成的三肽R1-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH反应，最终得到线型五肽R1-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-R2，
c)除掉保护基R1和R2，
d)将所得五肽H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH环化成环(Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal)，
e)除掉苯甲基保护基，
f)用TFA除掉Pbf保护基，并选择性地通过步骤a)-f)将环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)三氟乙酸盐转化为其它生理可接受的盐。
生理可接受盐可以是无机酸的盐，例如硫酸、亚硫酸、连二硫酸、硝酸、氢卤酸如盐酸或氢溴酸、磷酸如正磷酸、氨基磺酸，和有机酸的盐，例如脂肪族、脂环族、芳脂肪族、芳族或杂环一元或多元羧基、磺酸或硫酸如甲酸、乙酸、丙酸、己酸、辛酸、癸酸、十六烷酸、十八烷酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲基-或乙基磺酸、苯磺酸、三甲氧基苯甲酸、金刚烷羧酸、对-甲苯磺酸、乙醇酸、扑酸(embonic acid)、氯苯氧基乙酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、乙醛酸、棕榈酸、对氯苯氧基异丁酸、环己烷羧酸、葡糖-1-磷酸、萘一或萘二磺酸或月桂基磺酸。
特别优选生理可接受盐为环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)的盐酸盐或内盐。
如果R1是Boc并且R2是叔丁基，那些端基叔丁基样的保护基可用甲酸裂解掉，而没有保护基Pbf和Bzl的侧链会受到攻击。
下面的实施例具体描述了每一合成步骤的实施方案。
上下文中的所有温度均以℃表示。
实施例1
合成Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH
1.将25.3ml三甲基氯硅烷滴加到含26.5g Z-NMeVal-OH的200ml甲醇溶液中，混合液搅拌过夜。反应混合物除去溶剂，并将残余物加到甲基叔丁基醚(MTBE)中，用5％的Na2CO3和水洗涤。除去溶剂后将残余物加到甲醇和1N HCl中，与水-湿Pd/C(10％)混合，并用轻微H2流进行氢化。反应完全后，滤除催化剂，滤液除去溶剂并用乙酸乙酯重结晶残余物，得到产率为75％的H-NMeVal-OMe盐酸盐。
2.将含16.1g Z-DPhe-OH、10g H-NMeVal-OMe盐酸盐和10.1ml二异丙基乙胺的100ml二氯甲烷溶液冷却至0-5℃，并加入11.35gEDCI。混合物先于0-5℃下搅拌1小时，然后室温下搅拌过夜。除去溶剂，将残余物加到MTBE中，用5％Na2CO3、1N HCl和水洗涤并干燥，得到Z-DPhe-NMeVal-OMe的产率为84.5％。
3.将12g Z-Cphe-NMeVal-OMe溶于80mlTHF和20ml水中，与10mg百里酚酞混合并滴加10M的NaOH直至指示剂变蓝。当指示剂褪色时，重复滴加10M的NaOH。当指示剂不再褪色时，用10％KHSO4水溶液将pH调到2，除去甲醇并用MTBE提取产物。用Na2SO4干燥后，向滤液中加入2.9mlCHA得到CHA盐，Z-DPhe-NMeVal-OH x CHA的产率为90％。
4.将16.4g Z-DPhe-NMeVal-OH x CHA(环己铵盐)置于250mlMTBE和100ml H3PO4(10％)中搅拌至全部溶解。除去水相后，有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤并干燥。除去溶剂，将残余物加到15.2ml2N的NaOH和150mlTHF中，然后加入湿催化剂(1gPd/C(10％))，并用轻微H2流进行氢化。滤除催化剂，清液用12.1gBoc-Asp(OBzl)-Osu和4.5ml三乙胺处理，并于室温下搅拌过夜。除去溶剂后，将残余物置于MTBE中并用H3PO4(10％)、水和饱和NaCl溶液洗涤。有机相用3.3ml CHA处理。所得Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH x CHA盐过滤并真空干燥。产率为93％。
实施例2
合成H-Arg(Pbf)-Gly-OtBu
1.将33.0gZ-Arg(Pbf)-OH x CHA置于300ml乙酸和300ml H3PO4中搅拌至溶。除去水相后，有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤并干燥。除去溶剂，将残余物溶于8.38g H-Gly-OtBu x HCl的250ml二氯甲烷中，并冷却至0℃。然后加入17.12ml二异丙基乙胺和16.05gTBTU，混合物于0℃下搅拌60分钟后于室温搅拌过夜。除去溶剂后，替换为250ml乙酸乙酯。用Na2CO3(5％)、水和饱和NaCl溶液洗涤后，除去溶剂。Z-Arg(Pbf)-Gly-OtBu产率为86％。
2.将含30gZ-Arg(Pbf)-Gly-OtBu的350mlTHF溶液与3g水-湿Pd/C(10％)混合，并用轻微H2流进行氢化以除掉Z基团。滤除催化剂并除去溶剂。将残余物置于乙酸乙酯中并进一步按实施例2.1处理。得到H-Arg(Pbf)-Gly-OtBu的产率为86％。
实施例3
合成H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH
1.按常规方法将1.23gBoc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH x CHA转化成游离酸，并将其溶于含0.81g H-Arg(Pbf)-Gly-OtBu和0.22gDAMP的12.5ml二氯甲烷中。溶液冷却至0-5℃并用0.345gEDCI处理。于0-5℃搅拌2小时后室温下搅拌过夜。除去溶剂，残余物置于MTBE中，并进一步按实施例2.1处理。得到Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OtBu的产率为82％。
2.将2.3g Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OtBu溶于23ml95％的甲酸中以除去端基保护基，并于真空下浓缩30分钟。产物用醚研磨，过滤并真空干燥。所得H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH x HCOOH的产率为95％。
实施例4
合成环(Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal)
将含11.9g H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH xHCOOH的60mlNMP溶液滴加到含有7.25gTBTU和7.45ml N-甲基吗啉的180mlN-甲基吡咯烷酮搅拌液中。反应液搅拌20小时并滴加到含47.5gNaHCO3的1800ml水溶液中。过滤沉淀，真空干燥，所得环(Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal)的产率为73.4％。
实施例5
合成环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)
1.将含2g环(Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal)的26mlTHF液与0.5g Pd/C(10％)混合。通H2流2小时，真空下除去混合物的催化剂和溶剂。加入32ml丙酮结晶产物，并过滤和干燥。所得环(Arg(Pbf)-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)的产率为83％。
2.将1.5g环(Arg(Pbf)-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)溶于15ml95％的TFA中。1小时后将溶液滴加到150ml异丙醚中，滤除掉固体并干燥。将干燥的产品溶于30ml 1∶2的异丙醇/水中，并用离子交换剂III(醋酸根；Merck KGaA)处理。浓缩滤液并冷冻干燥。所得环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)内盐的产率为96％。