自体移植方法 【技术领域】
本发明涉及软骨细胞移植，骨和软骨移植物，愈合，关节修复和预防关节炎病理改变的领域。本发明特别针对软骨细胞移植和软骨再生的新方法和仪器。
背景技术
美国每年完成超过500,000个关节成形术和全关节置换。在欧洲几乎完成相同数量的类似步骤。每年在这些数目中大约90,000的整体膝盖置换和大约50,000的膝缺损修复(在：Praemer A.，Fumer S.，Rice，D.P，Musculoskeletal conditions in the United States，Park Ridge，Ill.：AmericanAcademy of Orthopaedic Surgeons，1992，125)。软骨再生的治疗方法将非常有用，而且可在关节损伤的较早阶段来完成，从而降低需要人工关节置换手术的病人的数量。用此种治疗方法来预防，发生骨关节炎的病人数量也会减少。
用于重塑关节软骨结构表面的技术主要试图用软骨下钻孔，磨损和其它方法诱导软骨修复，在其他方法中病变软骨和软骨下骨被摘除并使血管化松质骨暴露(Insall，J.，Clin.Orthop.1974，101：61；FicatR.P等，Clin Orthop.1979，144：74；Johnson L.L.，In：(McGinty J.B.，Ed.)Operative Arthroscopy，New York：Raven Press，1991，341)。
Coon和Cahn(1966，Science 153：1116)描述了从鸡胚胎体节培养软骨合成细胞的技术。后来Cahn和Lasher(1967，PNAS USA 58：1131)使用了涉及作为软骨分化前提的DNA合成的分析系统。软骨细胞应答EGF和FGF而生长(Gospodarowicz and Mescher，1977，J.Cell Physiology 93：117)，但最终失去它们的分化功能(Benya et al.，1978，Cell 15：1313)。软骨细胞生长方法已述并如Brittberg，M.等(Brittberg，M.等，New Engl.J.Med.1994，331：889)所述，主要作微小调整来应用。用这些方法的生长细胞被用于进入病人膝关节的自体移植物。另外，Kolettas等检查了软骨特异性分子，如胶原蛋白和蛋白聚糖在延长细胞培养条件下的表达。他们发现尽管在单层培养物中培养时有形态学改变(Aulthouse，A.等，In Vitro Cell Dev.Biol.，1989，25：659；Archer，C.等，J.Cell Sci.1990，97：361；Haanselmann，H.等，J.Cell Sci.1994，107：17；Bonaventure，J.等，Exp.Cell Res.1994，212：97)当与琼脂糖凝胶，藻酸盐珠子上的悬浮培养物，或作为离心培养物(保持圆形细胞形态)比较时，表达的标记物如II型和IX型胶原蛋白，大的聚集的蛋白聚糖，聚集蛋白聚糖，多功能蛋白聚糖和连接蛋白不会改变。(Kolettas，E.et al，J.Cell Science 1995，108：1991)。
关节软骨细胞是发现在软骨仅有的专用的间充质来源的细胞。软骨是其物理特性基于软骨细胞产生地胞外基质的无血管组织。在软骨内成骨过程中，软骨细胞经历了导致以X型胶原蛋白细胞表达开始为特征的细胞过度生长的成熟(Upholt，W.B.和Olsen，R.R.，In：Cartilage Molecular Aspects(Hall，B & Newman，5，Eds.)CRC Boca Raton 1991，43；Reichenberger，E.等，Dev.Biol.1991，148：562；Kirsch，T.等，Differentiation，1992，52：89；Stephens，M.等，J.Cell Sci.1993，103：1111)。
尽管在培养软骨细胞和操作骨和软骨上有进步，在移植软骨或软骨细胞以修复损伤的关节表面努力上还没有得到重大成功。本发明的学说提供了有效且高效的途径将软骨和/或软骨细胞移植入软骨关节的缺损中，在其中软骨再生以填补缺损。
发明简述
一种实施方案中，本发明提供了一种可植入制品，其包括可支持细胞在其上生长和附着的支持基质，及植入此种制品以在植入位置再生细胞的方法。在一种实施方案中，本发明提供了在动物内有效治疗软骨关节表面软骨的方法，它是通过移植包括保留在可吸附支持基质上的软骨细胞的可植入制品。
在一种实施方案中，软骨细胞只被保留在基质边缘。在一种实施方案中，支持基质为胶原蛋白制成的覆盖基质，而且软骨细胞为自体或同种异体的。在另外的实施方案中，支持基质制备自胶原蛋白和弹性蛋白，或胶原蛋白和一或多种其它可重吸收物质。在另外的实施方案中，支持基质为动物来源的小肠粘膜下层所制成。
在另外实施方案中，支持基质为心包膜制成。在一不同实施方案中，支持基质为胶原蛋白和一或多种其它聚酯相关物质制成。
可植入制品优选通过粘附或机械滞留方法稳固在移植位置。本发明也针对在植入位置置入并操作可植入制品的仪器，及将可植入制品稳固在植入位置的滞留装置。
本发明也针对动物体内软骨修复的可可植入制品和一种制备其的方法，所述可植入制品包括保留在可吸收支持基质上的软骨细胞。
在另一实施方案中，本发明涉及治疗关节接合表面软骨的方法，其包括将软骨细胞置于将被治疗的表面，并覆盖要用覆盖基质治疗的表面。所述覆盖基质被稳固在缺损周围的软骨的区域。
附图简述
图1A为显示了骨的关节末端的典型绘图。典型地，骨物质以软骨帽覆盖在软骨表面上(如条纹标示的软骨所示)。软骨帽缺损或损伤出现(图1B的软骨帽的空隙)的缺损位置可被直接治疗，或用手术方法轻微放大。可选地，必要时，止血屏障物(数字1)可被置入软骨帽的缺损以抑制或避免血管从下面的骨头形成进入再生软骨(图1C)，例如对于伸展进入软骨下层或到其下的缺损。之后在此止血屏障物顶部，或直接在缺损顶部铺所述要植入缺损腔的软骨细胞。
图2所示为软骨帽内(点画区)治疗的缺损(点画区域的空隙)被基质覆盖的绘图，该基质用于形成覆盖缺损位置的帽/膜片或绷带。该帽缝合或胶着到朝向健康软骨的腔的边缘从而被固定在适当位置，或附着到适当位置。该帽覆盖其中移植有培养的软骨细胞的关节的缺损区域。
图3A显示了膝关节内骨的典型关节末端，它在关节表面具有软骨帽。
图3B显示了对于骨的关节末端的软骨帽的软骨内缺损或损伤。
图4显示了根据本发明的可植入制品的实施方案。
图5显示了图4的可植入制品如何可在如图6所示的关节镜检查插管器(introducer)中被处理用作植入。
图6显示了根据本发明，用于将可植入制品植入植入位置的关节镜检查插管器。
图7为阐明图5的可植入制品在软骨帽的缺损或损伤位置置入的示意绘图，它使用了两个容纳关节镜仪器的管道。
图8为不伸展到软骨下层的缺损或损伤的软骨交叉区的示意图，而且本发明的可植入制品通过粘合剂稳固到缺损或损伤的位置。
图9为缺损或损伤不伸展到软骨下层的软骨交叉区的示意图，而且可植入制品通过机械保留器被稳固到缺损或损伤的位置。
图10说明了用于将可植入制品稳固到缺损或损伤位置的机械保留器的一种实施方案。
图11为缺损或损伤伸展到软骨下层的软骨交叉区的示意图，而且本发明的可植入制品通过粘合剂被稳固到缺损或损伤的位置。
图12为缺损或损伤伸展到软骨下层的软骨交叉区的示意图，而且可植入制品通过机械保留器被稳固到缺损或损伤的位置。
图13A为软骨细胞在固体支持基质上生长的初期，该支持基质的组织标本的彩色显微照片的黑白复印件。
图13AA为图13A的数字化显微照片。
图13B为显示了在软骨细胞于图13A的支持基质上生长了三星期后，负载了软骨细胞的该支持基质的彩色显微照片的黑白复印件。
图13BB为图13B的数字化显微照片。
图13C为免疫组织化学染色所示，胶原蛋白制成的支持基质，其上有软骨细胞生长的照片。
图13D为免疫组织化学染色所示，在生物反应物系统内，胶原蛋白制成的支持基质，其上有软骨细胞生长的照片。
图14为显示软骨细胞24在DePuy支持基质22上的显微照片。
图15为描述了对照(黑色阴影的)，Chondro-Gide膜组(点画的)，及DePuy膜组(灰色阴影的)在第3天，第2周，和第6周的总细胞数的图表。
图16为描述了对照(黑色阴影的)，Chondro-Gide膜组(点画的)，及DePuy膜组(灰色阴影的)在第3天，第2周，和第6周的细胞生存率的图表。
优选实施方案详述
在一种实施方案中，本发明涉及抑制血管组织例如凸入所建立软骨中的毛细血管环的形成的某些产品，在软骨细胞自体移植入软骨内缺损的过程中的应用。这些产品用于修复骨内软骨缺损，在该处所述缺损伸展进入软骨下层或到其下，有时指全层缺损。从下面的骨形成的血管组织趋向凸入新形成的软骨，导致所需的间充质特定软骨细胞以外的细胞的出现。
由于血管形成而引入的污染细胞可引起植入软骨细胞侵蚀和过度生长进入形成的软骨。本发明可用的一种商品为Surgicel(Ethicon Ltd.，UK)，它在7-14天的阶段后可被吸收。这与止血装置，例如，如Ethicon Ltd.的产品插页所述的Surgicel的一般应用相反。
吃惊的是，我们已发现在需要抑制软骨的血管重新形成时，可应用止血物质并用作胶样人工凝结物。图1C描述了此种可被用于抑制软骨缺损内血管重新形成的止血屏障物(hemostatic barrier)(数字1)。如果红血球存在于被止血屏障物覆盖的关节软骨的全层缺损内，这些红血球将被化学改变为高铁血红素并因此不能诱导血管生长。因而，有或无纤维蛋白粘合剂，用作血管重新形成的抑制性屏障的止血产品，例如Surgicel，对本发明所授的预想方法有效。本发明的另一个方面，基质，例如无细胞基质或另外的下述基质，被用作覆盖或插入关节缺损区域的膜片(patch)，该区域是培养的软骨细胞，例如，移植所用的自体软骨细胞所移植入的区域。另外，本发明也可应用同种异体软骨细胞或异种软骨细胞来修复软骨缺损。图2描述了可被用作膜片以覆盖缺损区域的所述覆盖基质2，而图3B描述了软骨缺损的位置。
因此，在一种实施方案中，本发明传授了在关节的关节接合骨表面有效修复或治疗软骨缺损的方法，该法包括给药制剂或装置以阻断要修复的软骨位点的血管侵入，也提供了隔离修复位置并使移植细胞保持在适当位置的基质。因此，该发明也提供了一试剂盒，其包括可选的插入要修复位置的止血组分，从而可有效抑制血管在要修复位置形成，而且一旦移植的软骨细胞被置入要修复位置，基质2就帽状覆盖修复位置，因此该移植软骨细胞被保持在适当位置而且还能得到营养物。
已用体外系统举例说明本发明的某些方面，以研究当软骨细胞与某些抑制血管组织形成的产物或某些产物的结合物接触时的行为。这种体外试验预测了某些试验物质支持软骨细胞在其上生长的能力，试验了其上持有软骨细胞的用作植入物的基质，也试验了每种基质抑制血管形成的能力，如同体内所出现的那样，在软骨细胞自体移植进入软骨内缺损的过程中，毛细血管环凸入建立的软骨。
适宜的止血产品以具有抑制血管组织，骨细胞，成纤维细胞等生长，或侵入发育的软骨的能力为特征。适宜的止血物质将达到本发明方法的目的，因为，为了使软骨形成达到最好并实现关节软骨内任何缺损的全层修复，应该避免血管和细胞侵入发育软骨。理想地是，止血屏障物在足以使软骨完全修复的延伸时间段中是稳定的，并且随后能够被吸收或另外随时间被分解。一种经鉴定被认为适宜的物质叫做SurgicelW1912(Lot GG3DH，Ethicon Ltd.UK)，是一种可吸收的止血剂如氧化再生的无菌纤维素。
本发明也包括软骨修复植入物及植入方法和为此植入物的装置。此植入物包括支持基质和在其上保留的自体或同种异体的软骨细胞。在一种实施方案中，此软骨细胞只被保留在该基质的一或多个边缘或层。通常，该支持基质为支持软骨细胞生长并随时间会在接受植入物的病人体内被吸收的物质。该移植步骤可通过关节镜检查，最小侵入或开放手术技术完成。本发明方法也考虑将适宜的同种异体和异种软骨细胞用于软骨缺损的修复。
图4显示此种植入物。更具体的是，可植入制品20包括有软骨细胞24保留在其上的支持基质22。适宜的支持基质22将会是固体或胶样支架，它以在移植前后能够保持稳定的形态一段时间来使软骨细胞在其上生长为特征，它还提供类似软骨细胞天然环境的系统以使软骨细胞生长分化达到最好。
支持基质22在足以使软骨完全修复的时间段保持稳定，之后可随时间而被机体吸收，例如，在2到3个月内吸收，不留下明显痕迹并不形成毒性降解产物。术语“被吸收”意指包括该支持基质被天然生物过程分解的过程，而且该分解的支持基质及其降解产物可通过例如淋巴管或血管被处理。因而，支持基质22优选为生理可吸收的，无抗原性的膜样物质。而且，在一种实施方案中支持基质22优选为有相对光滑的面21和相对粗糙的面23的片状形态。粗糙面23通常面对软骨缺损18并促进软骨细胞内生，而光滑面21通常背向软骨缺损18并阻碍组织内生。在另一实施方案中，支持基质22具有两个孔隙度相似的光滑面。
在一种实施方案中，支持基质22由多肽或蛋白制成。优选，所述多肽或蛋白从天然来源获得，例如，从哺乳动物。然而，物化性质与从天然资源获得的多肽或蛋白可相比的人工物质，也可被用于形成支持基质22。在本发明的一个方面，如下述，也优选当支持基质22被使用者操作时，它会可逆变形，这样可植入制品20可被处理然后返回为它的原形。
优选的构成支持基质22的物质为胶原蛋白，如从马，猪，牛，绵羊和鸡得到的胶原蛋白。适宜的构成支持基质22的物质包括ChondroCell(商品化的II型胶原蛋白基质垫，Ed.Geistlich Sohne，Switzerland)，和Chondro-Gide(商品化的I型胶原蛋白基质垫，Ed.Geistlich Sohne，Switzerland)。尽管也可用II型胶原蛋白，由I型胶原蛋白构成的支持基质22比II型胶原蛋白构成的支持基质坚硬一点。另外优选构成支持基质的物质是PermacolTM的交联或非交联形式(Tissue Science Laboratories，UK)。
可选，如Swatschek，等，2002，Eur.J.of Pharmaceutics andBiopharmaceutics，53：107-113，及在澳大利亚专利申请号AU 3741701中所述，胶原蛋白从海绵(marine sponge)得到。简言之，通过在水中多次洗涤海绵，切碎并匀浆化海绵组织，用高浓度尿素处理溶液，离心所得溶液并从上清沉淀所述胶原蛋白，来将胶原蛋白从海绵分离。
上述的可植入制品可，例如通过在下面更具体描述的这种支持基质上培养软骨细胞来制备。
对于自体的植入物，首先用关节镜检查技术从病人关节的不承重区域收获活组织检查软骨并转移到实验室含20％胎牛血清的生长培养基中。
之后用酶如胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)，蛋白水解酶及结合剂处理该活组织检查软骨，来分离并提取软骨的软骨细胞。然后在生长培养基中培养该提取的软骨细胞，从开始细胞记数约50,000细胞到终末记数约2千万软骨细胞或更多。
重新植入3天前，将生长培养基换为含10％自体血清(换言之，如下从病人的血中提取的血清)的移植培养基。然后，移植培养基中培养的此软骨细胞被浸入并渗透入支持基质22的一或多层，并继续繁殖以形成可植入制品22。优选，软骨细胞只在支持基质22的一边缘或外层粘附。可植入制品22然后被植入病人的软骨缺损位置18。
可以理解的是，缺损或损伤18可被直接治疗，轻微放大，或如美国专利申请09/320,246所述，在植入前用手术方法造型，从而容纳可植入制品20。所述培养方法及生长和移植培养基用实施例，在下面详述描述，首先从用于处理收获的活组织检查软骨并培养根据本发明的软骨细胞的实验室步骤描述开始。
用来在培养过程中处理所述活组织检查软骨并生长软骨的软骨细胞的生长培养基(下文的″生长培养基″)，是通过如下制备的：混合2.5ml硫酸庆大霉素(浓度70μM/L)，4.0ml两性霉素(浓度2.2μM/L；商标名为Fungizone，一种从Squibb可得的抗真菌剂)，15ml 1-抗坏血酸(300μM/L)，100ml胎牛血清(终浓度20％)，和其余DMEM/F12培养基来生产出约400ml的生长培养基。(相同生长培养基也被用于将从医院得到的活组织检查软骨转移到实验室，在实验室中软骨细胞被提取并繁殖)。
从病人获得的血液以大约3,000rpm离心以从其它血液成分分离血清。保存所述分离的血清并在培养过程和移植步骤的后期使用。
以前从病人收获的用作自体移植的活组织检查软骨在上述生长培养基中被运至其被培养的实验室。所述生长培养基被轻轻倒出以分离出活组织检查软骨，并在到达实验室后弃去。之后在普通DMEM/F12中洗涤该活组织检查软骨至少3次以去除胎牛血清在活组织检查软骨上的薄膜。
然后在加入了28ml胰蛋白酶EDTA(浓度0.05％)的包括了上述生长培养基的组合物中洗涤该活组织检查软骨。在该组合物中活组织检查软骨在37℃，5％CO2被孵育了5-10分钟。孵育后，该活组织检查软骨在生长培养基中被洗涤2-3次，以从活组织检查物清除任何胰蛋白酶。然后称重该软骨。通常，生长软骨的软骨细胞的最少软骨需要量为约80-100mg。优选稍大的量，如200-300mg。在称重后，该软骨被置于其中含2ml胶原蛋白酶(浓度5,000酶单位；一种消化酶)的大约50ml普通DMEM/F12培养基混合物中，并切碎以允许此酶部分消化该软骨。在切碎后，此切碎的软骨用漏斗被转移到一个瓶中，而且大约50ml的胶原蛋白酶和普通DMEM/F12的混合物被加到瓶中。然后此切碎的软骨在37℃，5％CO2被孵育17-21小时。
在一种实施方案中，该孵育的切碎的软骨之后用一40μm筛来过滤，离心(1054rpm，或200倍重力)10分钟，然后用生长培养基洗涤2次。之后记数软骨细胞以确定它们的生存率，然后在生长培养基中所述软骨细胞在37℃，5％CO2被培养至少2周，在这期间生长培养基被置换3-4次。
重新植入病人前至少3天，通过胰蛋白酶化移动该软骨细胞并从所述生长培养基离心，并转移到一含1.25ml磷酸庆大霉素(浓度70μM/L)，2.0ml两性霉素(浓度2.2μM/L；商标名为Fungizone，一种从Squibb可得的抗真菌剂)，7.5ml 1-抗坏血酸(300μM/L)，25ml自体血清(终浓度10％)，和其余DMEM/F12培养基的移植培养基中，以生产约300ml的移植培养基。
然后将支持基质22切割为适宜尺寸以装入NUNCLONTM细胞培养碟的孔底，然后在无菌条件下置于有1-2ml移植培养基的孔底。将大约5-10ml所述移植培养基中足够数量的培养软骨的软骨细胞(例如3-10百万软骨细胞)浸入支持基质22中，并在37℃，5％CO2孵育大约72小时以使该软骨细胞继续生长。在此孵育期间，该软骨细胞以聚簇(cluster)排列并粘附到支持基质22上。在一种实施方案中，此软骨细胞仅粘附到支持基质22一面的一外层。使用这种方法，已发现支持基质22支持在其上生长和保留足够数量的软骨细胞以形成可植入制品20，而不明显失去支持基质22的生物机械特性。支持基质22也提供了支持软骨细胞在软骨缺损位置植入可植入制品后继续生长的环境。
在另外实施方案中，在17-21小时孵育阶段后并如上讨论确定细胞记数和生存率之后，该软骨细胞被转移到移植培养基中然后如上所述直接在支持基质22上生长至少2周。
已发现无须机械破坏或失去粘附在支持基质22上的软骨细胞即可使可植入制品20临时变形。如下述，一旦可植入制品20被导入关节或被置于要处理的表面上，此变形便完全可逆。
因此，与本发明其它方面一致的是，足够数量软骨细胞生长或负载于其上的支持基质22，可以一种允许其导入到关节镜检查工作装置的方式临时变形，而无须机械破坏或失去其负载的软骨细胞。
同时，已发现此基质可用粘合剂或机械保留方法被固定到软骨缺损区域而无须损害软骨细胞的进一步原位分化和天然软骨基质物质的再生。
本发明其它方面包括将可植入制品20置入植入位置的设备，及将可植入制品20保留在植入位置的机械保留装置。
在本发明一种实施方案中，该植入步骤是用关节镜检查技术来完成的。图5显示可植入制品20如何围绕它的直径被卷起以形成螺旋状圆柱形移植物，从而可植入制品20可通过关节镜检查插管器28的工作通道26被传送到植入位置。适宜的关节镜检查插管器见图6所述。
图6中，关节镜检查插管器30包括直径和长度都适宜进入受影响的关节并传送所需尺寸的可植入制品20的工作通道32。例如对于大多数步骤，该工作通道32的直径都约为8-20mm，长度约为30-60cm。存在于工作通道32内并可纵向移动的是注射管34，它容纳可收回并可取出的针36。注射管32附着在可伸缩性压缩的至少部分进入工作管32的把手38上。针36延伸了注射管34的长度并允许流体流经到植入位置。注射管34通过伸缩地移动把手38朝向或远离植入位置而在工作通道32内移动。
插管器30也包括由橡皮或其它适宜物质制成，滑动接合到插管器30的帽40。使用中，帽40环绕软骨缺损位置并从流入软骨缺损位置将液体，如血液和其它天然液体排出。插管器30也有两或多个偏向外的抓住(gripping)元件42附着在把手38上，从而抓住导入并放置可植入制品20在植入位置。使用中，当把手38可伸缩地朝向或远离使用者移动时，抓住元件42啮合工作管32内面，以抓住的方式彼此相对移动(当把手38向使用者移动时)，彼此远离以释放抓住物(当把手38远离使用者移动时)。此可伸缩移动可用置于把手38内的偏向元件(未显示)来控制，其使注射管34和抓住元件42在工作管32内滑行前进或被收回。
图7-9显示了在植入位置，如膝关节10植入可植入制品22的关节镜检查的典型步骤。从缺损位置去除缺损软骨18，优选到在软骨下层44上留出孔46以上的深度(见图8-9)。去除软骨缺损18后，该缺损位置准备接受可植入制品22。如该软骨下层被破坏至植入位置有出血发生，任选该位置首先用可吸收物质作止血屏障物。
另外，位置准备包括通过针36将生物适合的胶注射入孔46。此种生物适合的胶，见图8的粘合剂48，可包含有机纤维蛋白胶(例如Tisseel，基于纤维蛋白的粘合剂，Baxter，Austria或在外科手术室用自体血样本制备的纤维蛋白胶)。
事先将可植入制品20切割为理想尺寸，并如图7所示卷成螺旋状圆柱形状，然后用抓住元件42将其抓住并固定在关节镜检查插管器30末端内部。关节镜检查插管器30在其末端固定可植入制品20，然后通过通道管33进入植入位置，从抓住元件42释放，并用抓住元件42打开卷(unroll)或当其离开工作管32后打开卷。通道管33包括允许装置如插管器30和可视装置通到移植位置的一或多个管。用抓住元件42，处理可植入制品20从而固定其中有软骨细胞的那面，本实施方案中可植入制品20的粗糙面23，面对孔46并被轻轻固定在孔46的位置以使粘合剂48硬化并结合孔46中的可植入制品20。
如图8所示，有一或多个管的第二通道管可被用于使装置通到植入位置以辅助可植入制品，粘合剂和/或机械保留用具的置入，或允许可视装置通到植入位置。此分离通道管也可用于完成一或多种所述涉及关节镜检查插管器30或其它关节镜检查装置的功能。
在另一实施方案中(图9)，机械保留用具如可吸收针(pin)，锚，螺杆或缝线被用于将可植入制品20固定在孔46内。适宜针50包括Ortho-Pin(商品化丙交酯共聚物针，Ed.Geistlich Sohne，Switzerland)。图10显示了可吸收针50的一实施方案。在此实施方案中，针50包括头部52，轴56内的脊髓内管54，和一或多个保留环58。针50的尺寸将随具体应用来变化，但通常针50长度约为10-15mm，头部52直径约为4mm，脊髓内管54直径约为1.2mm，轴56直径约为2mm并且保留环58直径约为2.5mm。保留环58用于将针50锚定在软骨缺损周围的健康软骨上。大头针50由任何不伤害机体并可被吸收或相反一段时间后被机体分解的物质制成。例如针50可由聚交酯制成。
本发明范围也考虑结合应用粘合剂48和机械保留用具如针50来将可植入制品20固定在孔46内。
如上所述，当软骨缺损18伸展入或到软骨下层44以下，或需要如图11和12所示去除进入软骨下层44或到其下的软骨时，可选择性调整上述步骤以包括在置入可植入制品20前将止血屏障物62置入孔46中。对于此缺损，医生可选择性应用止血屏障物62来抑制血管组织，骨细胞，成纤维细胞等生长或侵入正发育的软骨。据信这可使透明软骨在移植位置生长。适宜的止血屏障物会抑制血管形成及细胞侵入正发育的软骨从而在缺损位置使软骨形成达到最好并使软骨生长至全层。优选，该止血屏障物在延长的时间段是稳定的，以允许完全的软骨修复，然后被吸收或随时间被机体分解。适宜的止血屏障物为SurgicelW1912(Ethicon，Ltd.，United Kingdom)，一种由氧化再生无菌纤维素制成的可吸收的止血剂。
上述外科工具是用任何物质，如金属和/或塑料或硅树脂所制造，适宜制造一次性或多次使用的可再度使用外性科工具。
本发明的支持基质22或覆盖基质2由胶原蛋白膜所制成，用美国专利申请5,028,695(转让给Chemokol Gesellschaft Zur Entwicklung yonKollagenprodukten)所述过程制造，在此引入作为参考。该胶原蛋白膜可从牛或猪的胶原蛋白原始物质来制备：该胶原蛋白原始物质去除脂肪酸残基，用水洗涤，用碱处理，用水洗涤，用酸处理，用水洗涤，再用强碱处理，用酸处理，使其膨胀，用无机盐处理以使其收缩，该物质被压缩至干重重量比40-50％，通过加入溶质来去除在此物质中保留的水，如需要，该物质可被交联，并以伸展形态被晾干。
支持基质22或覆盖基质2也可用包括胶原蛋白，如I型或II型胶原蛋白和弹性蛋白的膜，如美国专利申请5,397,353(转让给Oliver等，UniversityofDundee)，在此引入作为参考，所述的膜来制成。该胶原蛋白/弹性蛋白膜的胶原蛋白可从马，猪，牛，绵羊，和鸡来源来获得。在一种实施方案中，支持基质22或覆盖基质2为经过多次有机提取步骤来去除真皮中的脂肪内容的胶原蛋白/弹性蛋白猪真皮。一旦脂肪被去除，该片就经过多次酶提取来去除所有细胞性物质。此种根据美国专利申请5,397,353制备的产品被定为PermacolTM和多个PermacolTM的交联模式。
其它类似PermacolTM的膜，如Rapi-Seal Patch (Fusion MedicalTechnologies，Inc.，Fremont，CA)和组织修复膜片(Glycar Vascular Inc.，Dallas，TX)也可在本发明中使用。
所述胶原蛋白/弹性蛋白膜也可与聚异氰酸酯，优选二异氰酸环已酯(HMDI)高达20％交联。所述用作支持基质22或覆盖基质2的胶原蛋白/弹性蛋白膜可为具有两光滑面的和均一孔径和质地的片状形式。优选，所述胶原蛋白/弹性蛋白膜具有下述规格：厚度0.75mm，长度4.8-5.2cm，宽度4.8-5.2cm，胶原蛋白含量＞79％及脂肪含量0.4％。软骨细胞可如上所述在此支持物上培养来制成可植入制品。该可植入制品可被置入软骨缺损位置或在其上。
在另一实施方案中，支持基质22可由小肠粘膜下层(″SIS″)制成。该从小肠片段制备SIS的方法详见美国专利申请4,902,508，在此引入作为参考。肠片段，优选从猪，绵羊或牛种类获得，首先用纵向擦拭动作来磨擦除去其外层(特别是浆膜和肌膜)和内层(至少为粘膜的腔的(luminal)部分)。通常，该小肠粘膜下层用盐水漂洗并在如下应用前选择保存以含水或不含水状态。
然后压缩肠粘膜下组织的多层叠层，彼此固定并塑形以提供多层重建结构，如美国专利申请5,788,625，5,922,028和6,176,880所述(均转让给DePuy Orthopaedics(Warsaw，IN))，在此引入作为参考。该多层结构以足够数量的粘膜下层来制成具有置换内源性软骨结构所需的厚度的重建组织移植物结构。
其它本发明所用的SIS膜包括Mentor Corporation(Santa Barbara，CA)的Suspend SlingTM，Glycar Vascular，Inc.(Dallas，TX)的Staple StripsTM，BostonScientific(Natick，MA)的Surgical Fabrics，Cook Biotech，Inc.(West Lafayette，IN)的SurgiSISTM吊索(Sling)和SurgiSISTM网孔(Mesh)，Sentron Medical，Inc.(Cincinnati，OH)的SIS Hernia修复装置，和DePuy Orthopaedics的Restores软组织植入物。
根据本发明可用作支持基质22或覆盖基质2的其它膜为美国专利5,837,278(转让给Ed Geistlich Sohne AG)所述的可重吸收胶原蛋白膜，在此引入作为参考。该可重吸收胶原蛋白膜可来自自然形成的膜，如带粗糙(grain)面的兽皮部分，腱，和多种动物膜。此胶原蛋白膜具有纤维性的面来促进细胞在其上生长并有光滑面来抑制细胞在其上粘附。该膜用碱来处理以皂化脂肪并降解碱敏感物质，用酸处理来降解酸敏感物质，洗涤，晾干，去油脂且必要时交联。
根据本发明其它可用作支持基质22或覆盖基质2的胶原蛋白膜包括Organogenesis，Inc.(Canton，MA)的FortaFlexTM(从I型胶原蛋白制备)及GraftPatch(从交联胶原蛋白制备)。另外，Antema，一种来自Opicrin S.p.A.(Corlo，ITALY)的马的I型胶原蛋白组合物也在本发明应用。
其它适宜用作支持基质22或覆盖基质2的膜包括来自Colla-Tec，Inc.(Plainsboro，NJ)的CollaTec膜，来自NeuColl(Campbell，CA)的Collagraft，来自Integra Life Sciences Corporation(Plainsboro，NJ)的BioMend，和来自Collagen Matrix，Inc.(Franklin Lakes，NJ)的BioMend可吸收胶原蛋白膜。来自Advanced UroSciences，Inc.，Brennen Medical，Inc.(St.Paul，MN)从猪皮肤制备(本质上所有为胶原蛋白)的生物合成外科网孔，和来自Col-Bar，Ltd.(Ramat-Hasharon，Israel)的BIOBARTM都是在本发明可用的支持基质22或覆盖基质2。
另外，具有以大分子水平排列的纤维的胶原蛋白膜也适宜用作支持基质22或覆盖基质2。例如在国际专利公开号W002/09790中，此膜被描述为Mediolanum Farmaceutici S.P.A.和Opocrin S.P.A.。
在另外的实施方案中，支持基质22和/或覆盖基质2可用胶原蛋白原纤维制成，该胶原蛋白原纤维相互通过还原糖或还原糖的衍生物彼此交联，例如美国专利申请5,955,438(转让给ColBar R & D Ltd.，Ramat-Hasharon，Israel)所公开的，在此全文引入作为参考。此糖可包括，但不限于酮或醛单糖，核糖，甘油糖，苏糖，赤藓糖，来苏糖，木糖，阿糖，阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，古洛糖，艾杜糖，半乳糖，塔罗糖，或者任何其他的二糖，丙糖，丁糖，戊糖，己糖，庚糖，辛糖，壬糖，或者癸糖，及它们的一或多种组合。支持基质22和/或覆盖基质2也可包括在软骨再生时具有治疗效果的抗微生物剂(antimicrobial agents)。这些抗微生物剂包括青霉素，头孢菌素，四环素，链霉素，庆大霉素，磺胺类药物的抗微生物剂，抗真菌药，如myconazole，以及抗炎药物，如可的松，和上述一或多种的组合。具有组织诱导特性的因子，如成纤维生长因子，血小板衍生的生长因子，转化生长因子，分化生长因子及其类似物，也都被包括在支持基质22中。
其它本发明所用的胶原蛋白物质见公开的美国专利5,256,418和5,993,844(转让给Organogenesis，Inc.)，美国专利6,206,931(转让给CookBiotech，Inc.)，和美国专利5,026,381(转让给Colla-Tec Inc.)，上述所有都引入本文作为参考并属于本文所讨论的一或多种产品。
还未在美国上市的，可用作支持基质22或覆盖基质2的产品，包括MACI-MaixR(Matricel，Herzogenrath，Germany)，Bio-Seed C(Biotissue，Miami，FL)，以及VivesCart和PLA/PGA共聚物(IsoTis，Bilthoven，Netherlands)。
在另一实施方案中，支持基质22或覆盖基质2可由含抗菌物质二氧四氢二嗪(taurolidine)和/或二氧四氢噻二嗪(taurultam)的胶原蛋白纤维的海绵制成，如EP 446,262(Geistlich Soehne AG，Wolhusen，Switzerland)所述，在此引入作为参考。该胶原蛋白海绵可从，如Basel，Switzerland的PentapharmAG，Billerbeck，West Germany的Dr.Otto Suwelak GmgH，或Wolhusen，Switzerland的Ed Geistlich Sohne A.G.购买。该胶原蛋白海绵也可用常规方法制备。例如可用化学和机械方法处理牛皮肤来将表皮与其下相连的脂肪分离。之后该层也可用弱碱，之后用酸处理，再洗涤。可用蛋白水解酶来使胶原蛋白与其他蛋白分离，而且可用脂肪酶去除残余脂肪。之后此胶原蛋白产物也可用氧化剂处理，匀质化再使其冻干。二氧四氢二嗪或二氧四氢噻二嗪的引入可在冻干前进行或可通过在二氧四氢二嗪或二氧四氢噻二嗪的溶液中复溶冻干的胶原蛋白并再冻干来进行。
在另一实施方案中，支持基质22或覆盖基质2可根据W099/27315(Heshcel Ingo Dipl Ing，Germany)所述，在此引入作为参考，用制造有孔结构的方法来制成。该有孔结构由物质的液体或糊状混合物制成，通过在可测量温度并且温度可变化的两散布(interspersed)表面之间冷却该混合物来可至少部分固化该混合物。在固化过程中会形成规则结构。然后该部分固化产物被冻干以产生均一的有孔结构。
支持基质22或覆盖基质2也可由一或多种具有大的互联孔的生物可吸收聚合物，如胶原蛋白，纤维蛋白，层粘连蛋白和纤连蛋白(fibronectin)根据美国专利5,869,080(转让给Johnson & Johnson MedicalInc.，NJ)所述的方法制成，在此引入作为参考。此生物可吸收聚合物可交联，例如在冷冻前与二异氰酸环已酯(HMDI)交联。
支持基质22或覆盖基质2可由胶原蛋白海绵如InstatTM(Johnson &Johnson)，如Johnson & Johnson的册子，标题为″Instat胶原蛋白可吸收止血剂″(Sept.1985)所述来制成，在此引入作为参考。
在另一实施方案中，支持基质22或覆盖基质2可由生物可吸收海绵，根据美国专利5,700,476(转让给Johnson & Johnson Medical Inc.，NJ)的所述方法制成，在此引入作为参考。该海绵包含基质结构及至少一种亚结构和至少一种药物活性剂。除外，该基质和亚结构可由生物可吸收物质如胶原蛋白，层粘连蛋白，弹性蛋白和和纤连蛋白制成。而且，该海绵基质可包含一或多种蛋白或一或多种多糖，或其混合物。除外，此药剂可包括抗微生物剂，细胞因子，生长因子，或抗体。
在另一实施方案中，如W096/25961(Geistlich Soehne AG)所述，在此引入作为参考，支持基质22或覆盖基质2由胶原蛋白纤维制成。该基质还可包含含糖胺聚糖，如硫酸软骨素，硫酸角质素，硫酸皮肤素与透明质酸的水凝胶样物质，和生长因子。此基质的实施例见Orgill等，美国专利5,489,304所述，在此全文引入作为参考。
支持基质22和覆盖基质2也可由多层膜制成，该膜如W099/19005(Geistlich SoehneAG)和美国公开号2002/0013627(Geistlich，等)所述，包含主要为胶原蛋白II的有孔基质层及至少一厚的屏障物层(barrier layer)，在此全文引入作为参考。该基质层有开放海绵样质地且该屏障物层有紧密的相对不渗透性的质地。另外，该基质层还可包含糖胺聚糖，如透明质酸，硫酸软骨素，硫酸角质素和硫酸皮肤素。该基质层也可包含层粘连蛋白，纤连蛋白，海藻酸钙或锚定蛋白II和生长因子。该屏障物可由胶原蛋白I和III或如下的合成物质制成：如聚酯，聚乙醇酸和聚乳酸的均聚物和共聚物，乙交酯和丙交酯的共聚物，聚原酸酯(polyorthoesters)和聚己内酯(polycaprolactones)。
本发明中包括引入合成物质如聚酯的膜的实例，举例可见来自SofradimProduction(Trevoux，France)的ParietexMesh和ParietexComposite Mesh，Genzyme Corporation(Framingham，MA)的SepraMeshTM，和C.R.Bard，Inc.(Murray Hill，NJ)的ComposixTM Mesh。
在本发明另一实施方案中，支持基质22和/或覆盖基质2由心包膜制成。本发明所用的由心包膜制成的膜的举例包括Tutogen Medical，Inc.(Parsipanny，NJ)的Tutopatch，BioVascular(St.Paul，MN)的Peri-Guard系列膜和Bio Vascular Sling。
本发明的某些方面已用体外系统举例研究与不同支持基质接触时的软骨细胞行为。此体外试验预测了某些物质机械耐受关节镜检查方法的能力并提供了涉及软骨细胞生长行为的信息。
从如下用来说明但并非用来限定本发明的实施例，可更好地理解本发明的诸多方面。
实施例1
根据我们的发明为将Surgicel用于避免血管发育入自体植入软骨或软骨细胞，我们用固定剂，如戊二醛来处理该Surgicel；我们已选用0.6％戊二醛处理该Surgicel1分钟，之后洗涤以消除可能对组织有毒性的戊二醛残余。或者，在如实施例2所述用戊二醛处理之前，该Surgicel用叫做Tisseel(Immuno AG，Vienna，Austria)的纤维蛋白粘合剂处理。我们发现该Surgieel例如，用固定剂如戊二醛固定，用无菌生理盐水(0.9％)洗涤并在冰箱中保存，在1-2个月不溶解。通常，Surgicel在7-14天被重新吸收。这时间太短，因为在植入软骨细胞生长入固体软骨层并从周围软骨得到它的营养需要之前，需要较长时间来避免从骨结构发育血管或同样地形成血管进入到植入软骨。换言之，血管形成的足够抑制需要较长时间如，例如一个月。因而，该产物不应在那时间前被充分吸收。另一方面最终需要重吸收。从而，该用作抑制屏障物(barrier)的有机物质应具有这些能力，而且我们发现用这种方式处理Surgicel可提供那种功能。
实施例2
所述Surgicel也用有机胶(glue)包被，且在此例中，我们已经用Tisseel作为胶。此产物与Surgicel一起可产生为我们具体目的所用的有用屏障物。任何其它止血或血管抑制屏障物都可用。此Tisseel被如下述混合。然后用Tisseel以在两面喷涂Surgicel直至浸透的方式包被该Surgicel。然后使该Tisseel(纤维蛋白胶)在室温固化。在马上完全固化之前，将该Surgicel置于0.6％戊二醛中1分钟并用无菌生理盐水(0.9％)洗涤。然后用PBS和/或NaOH调节pH直至pH稳定在7.2-7.4。之后此处理过的Surgicel再在组织培养培养基，如极限必需培养基/F12与15mM Hepes缓冲液中洗涤。
如本实施例所提及，我们已用Tisseel作为纤维蛋白粘合剂来包被Surgicel。而且该纤维蛋白粘合剂或胶也可直接应用在Surgicel所胶着的位置，对着骨的病灶底部。所用代替体内试验的此体外系统，是由用于细胞研究工作的NUNCLONTM Delta 6-孔无菌一次性平板(NUNC(InterMed)Roskilde，Denmark)组成。每孔测量直径约为4cm。
本发明中所述纤维蛋白粘合剂可为任何与所述纤维蛋白成分一起会生产在人体耐受的胶的粘合剂(Ihara，N，等，Bums Incl.Therm.Ini.，1984，10：396)。本发明预计任何其它胶成分也可用来代替纤维蛋白粘合剂。在本实施例中，我们用Tisseel或Tissucol(Immuno AG，Vienna，Austria)。此Tisseel试剂盒由下述成分组成：
Tisseel，冻干的灭活病毒后的密封物(Sealer)，含可凝固蛋白即：纤维蛋白原，血浆纤连蛋白(CIG)和因子XIII，和血纤蛋白溶酶原
抑蛋白酶肽溶液(牛)
凝血酶4(牛)
凝血酶500(牛)，和
氯化钙溶液
该Tisseel试剂盒包含DUPLOJECT应用系统。用Tisseel试剂盒时，该纤维蛋白粘合剂或此两-成分密封剂是以根据Immune AG产品插页单(sheet)的方式组合。
实施例3
软骨细胞在含HAM F12和15mM Hepes缓冲液及5-7.5％自体血清的极限必需培养基中，在37℃CO2培养箱中生长，并在Verigen Europe A/S，Symbion Science Park，Copenhagen，Denmark的Class 100实验室中处理。培养基的其它组分可用于培养软骨细胞。此细胞用胰蛋白酶EDTA胰蛋白酶化5-10分钟并用台盼蓝生存率染色在Burker-Turk室(chamber)记数。该细胞记数被调整为7.5×105细胞/ml。在Class 100实验室揭开一NUNCLONTM平板。
切割Surgicel止血屏障物达适宜装入NUNCLONTM组织培养碟的孔的底部的尺寸。在这种情况下一个尺寸约为4cm(但也可为任何可能尺寸)的环在无菌条件下被置入NUNCLONTM组织培养碟的孔的底部。用于细胞研究工作的是NUNCLONTM Delta 6-孔无菌一次性平板(NUNC(InterMed)Roskilde，Denmark)。该置于孔底的止血屏障物如实施例1所述被预处理。该处理明显延迟了Surgicel的吸收。然后在蒸馏水中多次洗涤此止血屏障物然后再多次洗涤直至未反应的戊二醛被洗去。应用小量含血清的细胞培养基使其被止血屏障物吸收而且同时使该止血屏障物在孔底保持湿润。
在1ml培养的培养基中约为106个细胞被直接置于止血屏障物顶部，分布于该止血屏障物表面，如上述用0.4％戊二醛预处理。该平板然后在37℃CO2培养箱中培养60分钟。含5-7.5％血清的2-5ml的量的组织培养培养基被小心加入含有细胞的孔，以避免在排出培养基时由于所持吸液管顶端与孔边呈切向而溅出细胞。看似该培养基的pH太低(pH约6.8)。然后该pH被调整至7.4-7.5。第二天一些软骨细胞开始在止血屏障物上生长，聚簇排列。一些细胞由于在调整pH之前暴露于低pH而死亡。该平板然后孵育3-7天，并在第3天更换培养基。
在孵育过程结束时，倒出培养基，并将冷藏的含0.1M二甲次胂酸钠(也叫甲次胂酸钠)的2.5％戊二醛，用HCL调整pH到7.4后，作为固定剂加入，用于制备细胞和支持物(止血屏障物)，以为后来作电子显微镜检作准备。
实施例4
软骨细胞在含HAM F12和15mM Hepes缓冲液及5-7.5％自体血清的极限必需培养基中，在37℃CO2培养箱中生长，并在Verigen Europe A/S，Symbion Science Park，Copenhagen，Denmark的Class 100实验室中处理。培养基的其它组分可用于培养软骨细胞。此细胞用胰蛋白酶EDTA胰蛋白酶化5-10分钟并用台盼蓝生存率染色在Burker-Turk室记数。该细胞记数被调整为7.5×105细胞/ml。在Class 100实验室揭开一NUNCLONTM平板。
如实施例1所述，该Surgicel(用作止血屏障物)用0.6％戊二醛处理1分钟，然后用0.9％无菌氯化钠溶液洗涤，或优选用缓冲液如PBS缓冲液或培养基如MEM/F12洗涤，因为戊二醛处理后pH为6.8，应优选在7.0-7.5。用DUPLOJECTX系统将Tisseel应用在Surgicel的两面，然后包被Surgicel的两面，该膜片(patch)应与纤维蛋白粘合剂使用。在无菌条件令这种胶干燥至少3-5分钟。将″包被″的止血屏障物置于NUSCLONTMDelta 6-孔无菌一次性平板的孔底做细胞研究工作(NUNC(InterMed)Roskilde，Denmark)。应用小量含血清的细胞培养基并使其被止血屏障物吸收。在1ml的包含血清的培养基中约为106个细胞被直接置于止血屏障物顶部，分布于该止血屏障物表面。该平板然后在37℃CO2培养箱中孵育60分钟。含5-7.5％血清的2-5ml的量的组织培养培养基被小心加入含有细胞的孔，以避免在排出培养基时由于所持吸液管顶端与孔边呈切向而溅出细胞。3-6天后显微镜检查显示细胞以满意的方式粘附并生长进入Surgicel，这表明Surgicel对软骨细胞不显示毒性而且该软骨细胞以满意的方式生长进入Surgicel。
该平板孵育3-7天，并在第3天更换培养基。在孵育过程结束时，倒出培养基，并将冷藏的含0.1M二甲次胂酸钠(也叫甲次胂酸钠)的2.5％戊二醛，用HCL调整pH到7.4后，作为固定剂加入，用于细胞和支持物(止血屏障物)，以为后来作电子显微镜检作准备。
实施例5
软骨细胞在含HAM F12和15mM Hepes缓冲液及5-7.5％自体血清的极限必需培养基中，在37℃CO2培养箱中生长，并在Verigen Europe A/S，Symbion Science Park，Copenhagen，Denmark的Class 100实验室中处理。此细胞用胰蛋白酶EDTA胰蛋白酶化5-10分钟并用台盼蓝生存率染色在Burker-Turk室记数。该细胞记数被调整为7.5×105至2×106个细胞/ml。在Class 100实验室揭开一NUNCLONTM平板。
该Bio-Gide为重吸收的双层膜，它将被用作膜片(patch)或绷带(bandage)，来覆盖此培养的软骨细胞通过自体移植被移植入的关节的缺损位置。该Bio-Gide为通过E.D.Geistlich Sohne AG，CH-6110 Wolhusen的标准化可控生产加工(controlled manufacturing processes)获得的纯胶原蛋白膜。该胶原蛋白从兽医鉴定的猪提取而且被仔细纯化以避免抗原反应，而且在双层泡罩(double blisters)中用γ-辐射灭菌。该双层膜具有有孔表面和密度大的表面。该膜由I型和III型胶原蛋白制成无须进一步交联或化学处理。该胶原蛋白在24周内重吸收。该膜甚至在湿润时仍保持其结构的完整性并且可用缝合线或钉子固定。也可用纤维蛋白粘合剂如Tisseel来替代缝合线或与缝合线一起将该膜″胶着″到周围软骨或组织。
在class 100实验室揭开Bio-Gide并在无菌条件下置于NUNCLONTM组织培养碟的孔底。用于细胞研究工作的NUNCLONTMDelta 6-孔无菌一次性平板(NUNC(InterMed)Roskilde，Denmark)，使双层膜的有孔表面或致密表面朝上。在包含血清的1ml培养基中约为106个细胞被直接置于Bio-Gide顶部，分布于该Bio-Gide的有孔或致密表面上。该平板然后在37℃CO2培养箱中孵育60分钟。含5-7.5％血清的2-5ml的量的组织培养培养基被小心加入含有细胞的孔，以避免在排出培养基时由于所持吸液管顶端与孔边呈切向而溅出细胞。
在软骨细胞被置入含Bio-Gide的孔后第2天，在Nikon Invert显微镜中检测该细胞。可见一些软骨细胞已粘附到Bio-Gide的边缘。当然用这个显微镜不可能透过所述Bio-Gide本身观察。
该平板孵育3-7天，并在第3天更换培养基。在孵育过程末，倒出培养基并冷藏。含0.1M二甲次胂酸钠(也叫甲次胂酸钠)的2.5％戊二醛，用HCL调整pH到7.4，作为固定剂加入，以制备细胞和在有孔或致密表面培养有细胞的Bio-Gide支持物。该Bio-Gide膜片然后被送到Department ofPathology，Herlev Hospital，Denmark作电子显微镜检。
电子显微镜检显示在Bio-Gide的致密表面培养的软骨细胞不生长进入Bio-Gide的胶原蛋白结构，而培养在有孔表面的细胞确实生长进入胶原蛋白结构，而且还显示了存在蛋白聚糖且无成纤维细胞结构的征象。此结果向我们表明当所述胶原蛋白膜片，例如Bio-Gide膜片，作为覆盖软骨缺损的膜片被缝合时，胶原蛋白基质的有孔表面应朝下面对该培养的软骨细胞所注入的缺损。然后它们能够渗透入胶原蛋白并产生与完整表面在一条水平线上的光滑软骨表面，并且在这个区域建立蛋白聚糖的光滑层。然而，如果该胶原蛋白膜片的致密表面朝下进入缺损，所植入的软骨细胞将不会与该胶原蛋白整合，而且该细胞将不会如上述产生相同的光滑表面。
实施例6
软骨细胞在含HAM F12和15mM Hepes缓冲液及5-7.5％自体血清的极限必需培养基中，在37℃CO2培养箱中生长，并在Verigen Europe A/S，Symbion Science Park，Copenhagen，Denmark的Class 100实验室中处理。此细胞用胰蛋白酶EDTA胰蛋白酶化5-10分钟并用台盼蓝生存率染色在Burker-Turk室记数。该细胞记数被调整为7.5×105至2×106个细胞/ml。在Class 100实验室揭开一NUNCLONTM平板。
该用作可重吸收的双层膜的Bio-Gide也可如产物插页所述，与有机胶如Tisseel一起应用，该Tisseel有比一般在Tisseel所发现的明显更高的抑蛋白酶肽(Aprotinin)。通过增加抑蛋白酶肽的含量到约25,000KIU/ml，该物质的重吸收将会被延迟数周而不是一般的时间段数天。
为体外检测该特征，该Tisseel被应用到NUNCLONTM平板的孔底，并使其不完全固化。然后将胶原蛋白膜片如Bio-Gide置于Tisseel上并胶着到孔底。此Bio-Gide和Tisseel的组合被设计作为会抑制或避免血管发育或渗透入软骨细胞移植区域的止血屏障物。此杂合胶原蛋白膜片现既可在损伤的底部被用作止血屏障物(离要修复表面最近)也可作为软骨形成的支持，因为远处表面可为胶原蛋白膜片的有孔面，从而促进软骨细胞和软骨基质的渗透。因而，该杂合胶原蛋白膜片也可被用于覆盖植入物的顶端，胶原蛋白的有孔表面直接面对植入的软骨细胞而且屏障物形成顶端。该杂合胶原蛋白膜片，也可无须任何有机胶如Tisseel，与提高的抑蛋白酶肽成分应用并被直接置入缺损内，并通过自然力粘附。然后该胶原蛋白膜片既可用作止血屏障物又可作为修复/移植位置的无细胞覆盖物，同时膜片的有孔表面朝向移植的软骨细胞/软骨。另一种变化方式是了可应用由II型胶原蛋白(Geistlich Sohne AG，CH-61 10 Wolhusen)组成的胶原蛋白膜片。
因而，本发明提供了杂合胶原蛋白膜片，其中所述膜片为胶原蛋白基质，该基质抑蛋白酶肽成分的水平提高，优选约25,000KIU/ml，与有机基质胶结合，其中该胶原蛋白成分与Bio-Gide可重吸收的双层物质或II型胶原蛋白相似，而且该有机胶与Tisseel物质相似。在另一实施方案中，该杂合胶原蛋白膜片不用任何有机胶来粘附到修复位置上。
实施例7
预想的试剂盒可方便操作本发明方法。在优选的实施方案，本发明的试剂盒会提供适宜在外科环境容易应用的无菌成分，也会提供适宜的止血屏障物，适宜的覆盖膜片，和必要时的有机胶。本发明的试剂盒也会提供无菌，无细胞的基质物质来支持中的将被植入关节接合处表面缺损自体软骨细胞。在一种实施方案中，本发明的试剂盒包含Surgicel止血屏障物和适宜包被了Ti5seel有机胶的Bio-Gide覆盖膜片，其中所述Surgicel和Bio-Gide已根据本发明所授进行了处理来延长时间直至重吸收时。例如，在一种实施方案中在Tisseel被预包被的情况下，该Tisseel用额外的抑蛋白酶肽来补充以延长重吸收时间。
在另一优选的实施方案中，该止血屏障物和覆盖膜片都是半渗透胶原蛋白基质，对其处理以延长物质的重吸收时间。也可能提供增强形式的Tisseel胶，作为分离成分应用，这是应每种修复/移植方法将面对的内在可变性和具体环境所需要的。
本领域技术人员可理解具体实施方案所示的对本发明在不背离本发明精神或范围所做的多种泛指的变化和/或修改。因而本实施方案和实施例可被认为是从各个角度阐述而并非限制。
实施例8
软骨细胞在上述生长培养基中，在37℃CO2培养箱中培养3周，并在Verigen Transplantation Service ApS，Copenhangen，DK或University ofLubeck，Lubeck，Germany的Class 100实验室中处理[注意：生长培养基的其它组分也可以用于培养软骨细胞]。此细胞用胰蛋白酶EDTA胰蛋白酶化5-10分钟并用台盼蓝生存率染色在Burker-Turk室记数。该细胞记数被调整为7.5×105细胞/ml。在Class 100实验室揭开一NUNCLONTM平板。
支持基质物质，具体为Chondro-Gide胶原蛋白膜(等同于Bio-Gide，除了Chondro-Gide比Bio-Gide较宽且较长；两者均从Ed Geistlich Sohne，Geistlich Pharma AG，Wolhusen，Switzerland可得)，被切割达适宜装入NUNCLONTM细胞培养盘的孔的底部的尺寸。此案中一个尺寸约为4cm的环在无菌条件下被置入孔底。
3周后，软骨细胞从生长培养基被转移到上述移植培养基，5ml移植培养基中的约5×106软骨细胞被直接置入支持基质顶部并分布于其表面。该平板然后在37℃CO2培养箱中孵育3天。在此阶段后，该软骨细胞聚簇排列并开始在支持基质上生长，而且不能通过用培养基漂洗甚至通过向该基质机械施加轻微的压力从该支持基质上去除。
在孵育过程末，倒出该移植培养基，而且其上固定生长有软骨细胞的支持基质在加入作为固定剂的含0.1M二甲次胂酸钠的2.5％戊二醛中冷藏。该支持基质用Safranin O染色来做组织学评估。其彩色显微图像的黑白复印件见图13A所示。显微图像的彩色版也作为图13AA递交从而更好阐述该显微图像的特征。
实施例9
软骨细胞在上述生长培养基中，在37℃CO2培养箱中培养3周，并在Verigen Transplantation Service ApS，Copenhangen，DK或University ofLubeck，Lubeck，Germany的Class 100实验室中处理。此细胞用胰蛋白酶EDTA胰蛋白酶化5-10分钟并用台盼蓝生存率染色在Burker-Turk室记数。该细胞记数被调整为5×105细胞/ml。在Class 100实验室揭开一NUNCLONTM平板。
如实施例1所述Chondro-Gide支持基质被被切割达适宜装入NUNCLONTM细胞培养盘的孔的底部的尺寸。此案中一个直径约为4cm的环在无菌条件下被置入孔底。
3周后，软骨细胞从生长培养基被转移到上述移植培养基，5ml移植培养基中的约5×105软骨细胞被直接置入支持基质顶部并分布于其表面。该平板然后在37℃CO2培养箱中孵育3周。
在孵育过程末，倒出该移植培养基，而且其上固定生长有软骨细胞的支持基质在加入作为固定剂的含0.1M二甲次胂酸钠的2.5％戊二醛中冷藏。该支持基质用Safranin O染色来做组织学评估。做免疫组织化学检测时，胶原蛋白膜在甲醇-丙酮中固定并用兔抗人II型胶原蛋白和小鼠抗人聚集蛋白聚糖来染色聚集蛋白聚糖(aggrecane)和II型胶原蛋白。第一抗体可用荧光第二抗体来观察。其彩色显微图像的黑白复印件见图13B所示软骨细胞24。彩色版也作为图13BB递交从而更好阐述该显微图像的特征。
在Chondro-Gide支持基质上培养3周的过程中，可观察到该软骨细胞已经生长并在支持基质上繁殖，在载体中心聚集成簇而且沿表面排列。
实施例10
软骨细胞在上述生长培养基中，在37℃CO2培养箱中培养3周，并在Verigen Transplantation Service ApS，Copenhangen，DK或University ofLubeck，Germany的Class 100实验室中处理。此细胞用胰蛋白酶EDTA胰蛋白酶化5-10分钟并用台盼蓝生存率染色在Burker-Turk室记数。该细胞记数被调整为5×105细胞/ml。在Class 100实验室揭开一NUNCLONTM平板。
如实施例1所述，Chondro-Gide支持基质被被切割达适宜装入NUNCLONTM细胞培养盘的孔的底部的尺寸。此案中一个直径约为4cm的环在无菌条件下被置入孔底。
3周后，软骨细胞从生长培养基被转移到上述移植培养基，5ml移植培养基中的约5×106软骨细胞被直接置入支持基质顶部并分布于其表面。该平板然后在37℃CO2培养箱中孵育3周。
固定生长有软骨细胞的支持基质与胶原蛋白酶一起孵育16小时。然后离心此固定软骨细胞的支持基质。细胞被接种在NUNCLONTM平板上并用台盼蓝生存率染色在Burker-Turk室等份记数。其显微图像见图11C所示。发现总记数细胞数为6×106且其生存率＞95％。
实施例11
本实施例描述了一个根据U.S.Patent No.4,902,508；(转让给DePuy，Ethicon，Inc.的分公司；图16的DePuy膜或″Ethicon″)制备的膜和Chondro-Gide膜(Ed Geistlich Sohne，Geistlich Pharma AG，Wolhusen，Switzerland)的毒性和生物适应性的试验。粘附在DePuy和Chondro-Gide膜上3天，2周和6周的软骨细胞的生存率和数量，通过记数粘附在膜上的可见细胞数来确定。
此DePuy膜试验以Chondro-Gide膜作为阳性对照，阴性对照是用相同方法但是无任何膜。
以前冻存的人软骨细胞(1.4×107个细胞)解冻并洗涤，确定细胞数和生存率。3.2×106个细胞以解冻后87％生存率被回收。1.6×106个细胞以5.3×104细胞/ml的浓度加入到两个组织培养瓶中的每一组织培养瓶中，并在37℃孵育3天。瓶中所得细胞数和生存率分别为3.5×106个细胞，98％生存率，和3.6×106个细胞，93％生存率。
分析每个膜的6个样本，和对照组无任何膜的6个样本的细胞记数和生存率。所述膜在3天，2周和6周做分析。所述DePuy和Chondro-Gide膜的样本被切割为1英寸的方块。因为该DuPuy膜的干燥坚硬，切割此膜会有点困难。
软骨细胞被胰蛋白酶化而且细胞生存率和细胞数按如上所确定的。离心沉淀该细胞并以浓度1,000,000细胞/ml重悬。
该DePuy和Chondro-Gide膜用pH为7.17的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。每片膜都被插入培养碟的孔中。1,000,000细胞/ml浓度的软骨细胞悬浮液100μl被加到每片膜上和6个无膜的孔底。向每孔另外加入培养基(3ml)。该培养平板在37℃被孵育至少3天。
图14阐释了粘附在DePuy膜上的软骨细胞。收获细胞并在3天，2周和6周记数。
用含2ml 0.25％胰蛋白酶和1ml胶原蛋白酶(总5000单位)的混合物的酶溶液处理该DePuy和Chondro-Gide膜，来溶解此膜从而确定细胞记数和生存率。一旦溶解，离心收获该软骨细胞并记数。用酶溶液处理的时间长度随膜的种类而变化。对于DePuy膜，胶原蛋白酶消化的时间比对Chondro-Gide膜会长很多。该DePuy膜在消化2小时后不会完全溶解，而Chondro-Gide膜在约1-1.5小时已完全溶解。为避免细胞应激(stress)，胶原蛋白酶消化不应长于2小时。
对照组的软骨细胞被胰蛋白酶化，洗涤，并离心沉淀。然后在DMEM培养基中重悬并确定最终细胞数。
此实验结果如下。对照细胞比较在DePuy和Chondro-Gide支持基质上生长的细胞，其生存率无实质变化。如图16所示，在3天，对照，Chondro-Gide支持基质和DePuy支持基质的细胞生存率是高的，在对照约为87％，在Chondro Gide支持基质约为94％，在DePuy支持基质为93％。在2周间隔期，对照组的生存率约为90％，Chondro Guid组的生存率约为91％，而DePuy组的生存率约为83％。在6周时，对照条件下细胞存活约为80％，Chondro-Gide膜上细胞存活约为81％，而用DePuy支持基质条件细胞存活约为74％。因而，细胞在不同生长条件的生存率无大范围的变化。
事实上，细胞数直至培养晚期才受DePuy和Chondro-Gide支持基质的明显影响。如图15所示，在3天时间点，对照细胞记数约为72,000个细胞，而支持基质上Chondro Gide细胞记数约为109,167个并且DePuy细胞记数约为169,583个细胞。在2周时，对照细胞增生约8倍到575,167，而Chondro-Gide细胞数量大约翻四倍到427,500，而DePuy细胞数量大约翻三倍到494,167。最后在6周时，对照细胞数量些微减少到约528,333，而Chondro-Gide细胞和DePuy细胞数量分别大量减少到153,333和100,833。
当本发明参照具体实施方案来公开时，很明显本发明的其它实施方案和变化不背离本发明的精神和范围，可被本领域其他技术人员修改。所附的权利要求被正确解释可包括所有这些实施方案及等同变化。