应用LCM技术构建细胞差异表达cDNA文库及大鼠睾丸特异基因RSD-6的克隆和生物学功能 技术领域：
本发明为利用激光捕获显微切割技术构建大鼠不同生精细胞差异表达cDNA文库的新方法及利用此方法发现的大鼠圆形精子细胞特异表达的RSD-6基因/蛋白，涉及生物医学高技术中新方法、新基因、新蛋白的开发与应用领域。
发明背景：
哺乳动物精子发生是一个高度有序的细胞分化过程。在短短的时间内，精子发生经历了有丝分裂和减数分裂，从一个精原细胞到四个成熟精子，从二倍体细胞到单倍体细胞，从圆形精子细胞变形成为长形精子。在这一分化过程中的每一特定阶段均有细胞特异性和发育阶段特异性的结构形成，而众多阶段特异性基因的转录和表达则是形成生精细胞特异性结构及发挥细胞特定功能的基础。研究精子发生过程基因的转录和表达，阐明精子发生的分子机制，对人类的生殖健康、避孕疫苗的研制以及男性不育的防治均有十分重要地意义。
大约半个世纪以前，Leblond和Clermont通过对曲细精管截面上不同发育阶段的精细胞顶体进行Schiff酸性染色，描述了曲细精管上皮细胞的周期性变化。为了解释这种同一细胞群的显著形态学差异，诞生了细胞内差异基因表达的概念。随之而来的问题是，如何研究某一种特定的随曲细精管上皮周期性时空变化而改变的细胞的基因表达？如何从复杂的异源性组织中获得足够数量和纯度的特定细胞来进行进一步研究？这种组织异质性一直困扰着精子发生不同阶段的差异表达基因的研究。
本实验方法是在世界上首次将激光捕获显微切割(Laser Capture Microdissection，LCM)技术与抑制性消减杂交(Suppressive Subtractive Hybridization，SSH)相结合并成功地应用到精子发生的研究领域。
发明目的：
通过激光捕获显微切割技术在冰冻组织切片上分离获得了大鼠的初级精母细胞和圆形精子细胞。在此基础上构建了基于激光捕获显微切割技术的大鼠初级精母细胞和圆形精子细胞的双向抑制性消减cDNA文库。以筛选、克隆、鉴定精子发生过程中阶段特异性表达基因，深入研究其在精子发生中的作用，以期更加深入地理解精子发生的机理，探索其用于控制生育及防治不育的前景。
克隆在大鼠精子发生过程中起作用的特异基因RSD-6，表达其编码蛋白质，阐明其生理生化功能，为深入了解精子细胞的发生机理以及基因表达调控规律奠定基础。内容与要求：
将激光捕获显微切割技术与抑制性消减杂交相结合建立了构建细胞特异表达cDNA文库的新方法。应用斑点杂交、分子克隆、cDNA文库筛选、基因组信息学原理、DNA序列测定技术、Northern印迹杂交、RT-PCR、基因表达与蛋白纯化技术等，克隆鉴定编码RSD-6蛋白的新基因全长cDNA，通过Northern印迹杂交和RT-PCR进行组织表达谱和睾丸发育阶段表达分析，分析RSD-6基因在睾丸中的表达。
该方法及发现的新基因/蛋白质达到的技术指标为：
1.成功地利用激光捕获显微切割技术捕获和分离了大鼠初级精母细胞和圆形精子细胞。
2.在此基础上从分离的两种细胞中提取RNA，合成双链cDNA。
3.成功构建了大鼠初级精母细胞和圆形精子细胞的双向cDNA消减文库。
4.所构建文库的滴度高达8.3×109/ml，重组质粒克隆阳性率为91.67％，插入片段大小分布于250bp～1.7kb，主要集中于500bp～1kb。
5.对772个阳性克隆进行核苷酸序列测定，共产生了610个质量满意的ESTs，总测序成功率达到79.02％。其中从初级精母细胞和圆形精子细胞中分别获得403和207个质量满意的EST。
6.将所发现的新EST提交NCBI，共获得298个GenBank注册号。
7.自圆形精子细胞差异表达的EST中获得一全长1185bp的cDNA，命名为RSD-6，相应编码蛋白质有254个氨基酸，GenBank接收号为AF271155
8.RSD-6基因编码蛋白质的预测分子量为60Kd。搜索Prosite数据库后发现它具有2个糖基化位点、1个PKC磷酸化位点、17个CK2磷酸化位点。
9.该基因的表达具有组织特异性和阶段特异性，即该基因仅在大鼠睾丸组织有表达，表现为出生后30天内的大鼠睾丸中未见RSD-6基因明显表达，45天开始出现表达，60天表达量明显升高，一直维持到120天。此结果表明，RSD-6基因的表达具有组织特异性和发育阶段性特异性。
10.pEGFP-RSD-6真核表达载体转染CHO细胞后48小时，在荧光显微镜下观察，发现绿色荧光出现于细胞的胞浆内，表明RSD-6基因编码的蛋白质表达于CHO细胞的胞浆。
11.该基因及其编码蛋白可能与圆形精子细胞到长形成熟精子的变态过程相关。可用于精子发育不全等不孕症相关疾病的基因诊断和基因治疗，对于抗生育领域以及新药的设计与开发具有潜在应用价值。
附图说明：
图1.大鼠初级精母细胞的捕获
A.捕获前；B.捕获时膜与细胞粘合；C.细胞转移后的空缺；D.捕获的初级精母细胞
图2.大鼠圆形精子细胞的捕获
A.捕获前；B.捕获时膜与细胞粘合；C.细胞转移后的空缺；D.捕获的圆形精子细胞
图3.大鼠初级精母细胞和圆形精子细胞双链cDNA琼脂糖凝胶电泳
M：DL2000(TaKaRa)；1：大鼠初级精母细胞双链cDNA；2：大鼠圆形精子细胞双链cDNA
图4.消减杂交后两次PCR扩增产物的分析
M：DL2000 Marker(TaKaRa)；1：两轮消减后样品的初次PCR；2：未消减对照样品的初次PCR
3：试剂盒所提供的阳性对照的初次PCR；4：两轮消减后样品的二次PCR；5：未消减对照样品的二次PCR；6：试剂盒所提供的阳性对照的二次PCR
图5.pGEM-T Easy Vector转化重组子的鉴定
M：DL2000 Marker(TaKaRa)
图6.SSH克隆的斑点杂交分析
根据抑制性消减的结果使用32P标记的正向和反向消减cDNA探针分别与初级精母细胞(A)和圆形精子细胞(B)差异表达的克隆杂交。使用管家基因G3PDH为内对照，校正探针量。
图7.大鼠RSD-6基因的组织表达谱Northern Blot分析1：心2：睾丸3：脑4：肠5：脾6：肾7：肝8：骨骼肌
图8.RSD-6基因在不同发育阶段睾丸组织中的表达Northern Blot分析1-8分别为7、10、20、30、45、60、80和120天大鼠睾丸组织总RNA
图9.GST-RSD-6融合蛋白在大肠杆菌中的表达1：诱导的DGEX4T3-RSD-6-BL21(DF3)菌体裂解液沉淀；2：诱导的pGEX4T3-RSD-6-BL21(DE3)菌体裂解液上清；3：诱导的pGEX4T3-RSD-6-BL21(DE3)菌体蛋白；4：未诱导的pGEX4T3-RSD-6-BL21(DE3)菌体蛋白
实施例：
1.应用激光捕获显微分离技术分离大鼠初级精母细胞和圆形精子细胞
将大鼠新鲜睾丸标本在15min之内包埋在OCT中，液氮中冻存。现场进行组织包埋。制作睾丸冰冻切片，切片苏木精染色。使用LCM仪分离细胞：将染色并用二甲苯脱水干燥的切片放在LM200主机平台上，把CapSureTM帽放置在切片上。调节好焦距和照明，通过监视器中的数码图像进行操作。激光束直径≈7.5μm，激光束能量在25mW-80mW。在捕获细胞的过程中，根据捕获效果和观察需要调节以上各参数。根据初级精母细胞和圆形精子细胞在显微镜下的形态特点进行确认。分别捕获初级精母细胞利圆形精子细胞(图1，图2)。一张转移膜上捕获约2000-3000个细胞后，使用转帽把手取下CapSure帽，把它按紧在装有Trizol的0.5ml Eppendorf管上。将Eppendorf管反复颠倒2分钟，将膜上的细胞消化下来。
2.大鼠初级精母细胞和圆形精子细胞总RNA的提取
利用TRIzol总RNA提取试剂分离LCM捕获的大鼠初级精母细胞和圆形精子细胞总RNA。用DNase去除DNA，重新抽提RNA。
3.DNA第一链的合成及LD-PCR
利用CloneTech的SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链，并LD PCR扩增cDNA(图3)。
4.PCR产物的纯化
使用CHROMA SPIN+TE-400Column层析纯化SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit合成的大鼠初级精母细胞和圆形精子细胞cDNA。
5.大鼠初级精母细胞和圆形精子细胞抑制性消减cDNA文库的构建
双链cDNA的Rsa I酶切及纯化。正向和反向实验方(tester)cDNA接头的连接，分别用大鼠初级精母细胞和圆形精子细胞作为tester进行正向和反向消减。用G3PDH引物进行接头连接效率的分析。第一次杂交，68℃孵育6～12小时。随后立即进行第二次杂交反应。用1.0μl第二次杂交产物进行第一次PCR扩增。取第一次PCR产物3μl进行第二次PCR扩增(图4)。利用PCR扩增的方法通过比较已知cDNA在消减前后丰度的差别来进行消减效率的分析。这里所检测的已知cDNA是管家基因G3PDH。消减后PCR产物的克隆：质粒转化，所用质粒载体为：pGEM-T Easy vector，Promega；转化重组子的鉴定；克隆片段的PCR扩增，随机挑取多个克隆，利用T Easy载体克隆位点两端的通用引物直接进行PCR扩增，观察是否有片段插入以及插入片段的大小(图5)。
6.cDNA文库质量鉴定
利用适量的LB液体培养基将转化后形成的菌落从琼脂培养板上洗脱下来，合并后即为所构建的人初级精母细胞和圆形精子细胞cDNA消减文库。加入甘油至终浓度为20％，分装于多个1ml微量离心管中，取部分进行文库质量的鉴定，其余-70℃冻存。
7.抑制性消减杂交克隆的斑点杂交分析
cDNA克隆插入片段的PCR扩增及杂交膜的制备，点膜量为1μl变性样本。杂交探针的制备，使用Promega的Prime-a-GeneLabeling System，对杂交探针进行50μCi[α-32p]dCTP同位素标记。72℃预杂交40-60分钟。将探针混合液加入每个杂交管中，注意不要将探针直接加到膜上。72℃杂交过夜。将洗过的杂交膜于X-ray底片盒中压片，置-70℃放射自显影48小时。暗室内将曝光48小时的X-ray底片先后浸于显影液2分钟，定影液20分钟，常规显像。于Molecular Dynamics公司的Storm680扫描仪中扫描，分析膜上各点杂交信号(图6)。
8.大鼠初级精母细胞和圆形精子细胞差异表达基因的生物信息学分析
根据抑制性消减杂交和Dot-Blotting的结果，从大鼠初级精母和圆形精子双向消减cDNA文库中选择有显著表达差异(表达强度相差3倍以上)克隆进行DNA序列自动分析，将测序结果进行同源性比较、EST拼接等相应的生物信息学分析，并参考互联网上相关的公共数据库进行相应的比较和分析，初步探讨大鼠精子发生过程中差异表达基因的作用和意义。
9.大鼠睾丸cDNA文库的筛选
选取以上所获取的差异表达的EST，进行放射性标记并用作探针筛选大鼠睾丸λgt10 5’-stretch cDNA文库(Clontech Laboratories公司)。斑点杂交法共筛选了1×106个克隆，采用噬菌体载体通用引物扩增阳性克隆的插入片段，并将产物克隆入Promega公司的pGEM-T Easy载体，进行序列测定。应用BLAST软件查询GenBank数据库进行最大同源性比较，通过DNASIS软件分析所测序列的酶切位点及开放阅读框等，利用Prosite，SignalP及PC gene软件进行编码蛋白质序列分析。
10.RNA的制备和Northern印迹分析
将成年Wistar雄性大鼠引颈处死，于无菌条件下分别快速切取睾丸、肌肉、肠、肝、脾、脑、心、肾等8种组织，各约100mg，采用Trizol试剂(Life Technologies)提取总RNA。同样分别提取出生7天、10天、20天、30天、45天、60天、80天和120天的大鼠睾丸组织总RNA。
以随机引物法标记的RSD-6 cDNA全长序列为探针，进行Northern Blot杂交分析。同时，以哺乳动物组织恒定表达的β-actin基因为对照，监测所用RNA质量及Northern Blot结果(图7，图8)。
11.RSD-6基因原核表达载体的构建
为构建原核表达质粒，以RSD-6第132-153位碱基序列为5’端引物，以878-895位相对应的碱基序列为3’端引物，扩增RSD-6阅读框全长，并在5’及3’端分别加上BamHI和XhoI酶切位点。用以上引物对以前环化的pBK-CMV-RSD-6质粒进行PCR扩增，扩增片段长度为762bp。将扩增后的PCR产物首先克隆到pGEM-T载体上，再筛选阳性重组体。经BamHI、XhoI双酶切后，回收插入片段，然后将其定向克隆到同样双酶切处理的pGEX-4T-3载体上，重组质粒命名为pGEX4T3-RSD-6。
12.重组蛋白的大量表达
将重组质粒pGEX4T3-RSD-6转化到BL21(DE3)宿主菌中。挑转化了表达质粒的单菌落分别加入含100ml新鲜LB(含Amp50μg/ml)的500ml锥形瓶中。37℃，200rpm，培养过夜；将上述培养物按1/25(16ml)的比例转移接入四个含400ml LB(含Amp50μg/ml)的2000ml锥形瓶；37℃，250rpm，培养1-1.5小时，使菌液的OD600值达到0.6-0.8；加入终浓度为0.2mmol/L'TG诱导表达3小时。培养物用250ml离心杯收集，离心，5000rpm，15分钟，弃净上清培养基。将诱导后菌体沉淀以1×PBS液25ml/400ml菌液重悬，冰浴下超声破碎细胞(工作12秒/冷却25秒/200-400W)25×4次。12,000rpm离心20分钟。取少量进行SDS-PAGE鉴定(图9)。
13.RSD-6的真核表达
利用以下引物扩增RSD-6-PBK-CMV质粒：5’引物：5’-CCCTCGAGAACATGGCGAAGGAAGATATC-3’；3’引物：5’-CGGGATCCCGCATCATGAGTTCATCTGG-3’。PCR产物电泳后回收扩增片段。将回收后的PCR扩增产物与pGEM-T Easy载体室温连接2-3小时后转化DH5α感受态细胞。挑6个菌落，培养过夜后，常规提质粒，行BamH I/Xho I双酶切，37℃3小时，电泳分析酶切片段大小。将经鉴定阳性的RSD-6-T easy vector质粒与真核表达载体pEGFP-N1分别用BamH I/XhoI双酶切，37℃5小时。取酶切回收的适量目的DNA与同样处理的pEGFP-N1质粒混合，使片段与载体摩尔比达5-8∶1。16℃连接16-20h后转化DH5α感受态细胞。挑6个菌落，培养过夜后，各样保留0.5ml菌种，余菌常规提质粒并行BamH I/Xho I双酶切，37℃3小时，电泳分析酶切片段大小。保留BamH I/Xho I双酶切鉴定为阳性的菌种。将阳性菌种转接至15ml新鲜LB培养液(Kana+)，37℃，200rpm，培养过夜。采用GIBCO公司质粒提取试剂盒提取pEGFP-N1-RSD-6质粒。转染时细胞应处于对数生长期。转染前一天传代。35mm2的培养皿接种1-3×105个细胞。待细胞长至50-80％汇合时，进行转染。取提取的pEGFP-N1及RSD-6-pEGFP-N1质粒1-5μl(1μg)加到含无血清培养液及1μl FuGENE转染试剂的离心管内，轻弹混匀。室温孵育15-30min。分别向待转染细胞中加入上述混合试剂，轻轻旋转培养皿以混匀。37℃，5％CO2孵育箱中培养。全长RSD-6 cDNA序列及其编码蛋白质的氨基酸序列
1 G
2 GCA CCA GCC ACT CCG ACT GAA ACT ACC AAC TCC AAA CCT AAG GAA
47 TCA ATT ACT GAA AAT TTC ATT CCG GTG AAA ATT GGA AAT ATC TCA
92 TCC CCA GTT GGC ACT GTT TCT TTA ATT GAT TTT TCC AGT AAC ATG
1 M
137 GCG AAG GAA GAT ATC CTC TTA GCC ACC ATT GAC GCA GAA GAC AAA
2 A K E D I L L A T I D A E D K
182 GAA GTC AAA CCC ACT ACT GAG CTC TCT GAA ACA CAG GAG GAC AGC
17 E V K P T T E L S E T Q E D S
227 TCT GCC AAT GAT GAG GAT ACC TCT GTA CCT CCA GAT GAG AAT ACT
32 S A N D E D T S V P P D E N T
272 GAA ACT GAT GTT AGT TCT TCA ACT AGC TCT GAC GTT CCT GAT GAT
47 E T D V S S S T S S D V P D D
317 GGA GCT GTC CAG GTC ACT GAC TCC TTT AGT CCT GAG TCT GAC GTC
62 G A V Q V T D S F S P E S D V
362 CCT CCC TCT ACT GAA AAG GAG GTC ACC ACC ATT CCA GAC AAC GTT
77 P P S T E K E V T T I P D N V
407 GCA GAA GAC AAA GTA ACT AAG ATT GAC TTG ATT GTT TCA GAA GAT
92 A E D K V T K I D L I V S E D
452 AGG CCC AAA ACT GTG ACT AAA TTA AGT GAC TCC GAA GAA GAA AAA
107 R P K T V T K L S D S E E E K
497 TTT ATC ACT GTT TTT GAA CTC ACT AAC TCA GCT GAA AAA GCC AAA
122 F I T V F E L T N S A E K A K
542 GAT AAC CCA GAA GAT CCT TTA ACT GAT GAG GAG CCA GCT GAC GGA
137 D N P E D P L T D E E P A D G
587 GTT AAT ACT TGG GTG GAA AAA GAT GCT GCA AAT GAG GCA GAG TCT
152 V N T W V E K D A A N E A E S
632 CAT GCT GTT CTG CTT ACC GCC GTT GAA TCT AGG TAC GAC TTC GTT
167 H A V L L T A V E S R Y D F V
677 GTC ACT GCC TCC GAA ACT AAC AGC GTC GTC GTG GAG GAA CCA CAC
182 V T A S E T N S V V V E E P H
722 GTT GAC ACA AAG AAT TCG CCT GAA AAG GAT GCA GCA GAG TCT GTC
197 V D T K N S P E K D A A E S V
767 ACT AAT GTC ACA GAG GAA TTT CCT TCA GTG ACC TCT GTA GTA GAA
212 T N V T E E F P S V T S V V E
812 CAG AGT GGG AAC AAG GAG GAC TTA TCT ACC AAT GAC TCC GGT ATC
227 Q S G N K E D L S T N D S G I
857 TTT AAA CTG CTC AAA GAA GAA CCA GAT GAA CTC ATG ATG TAA AAC
242 F K L L K E E P D E L M M *
902 CAG TAA CAT AAG GGA AGC CAC ATA GAC ACA CAT GAT GGG TTA AGA
947 GAT AGT CAT AAT ATC TAA GAA GTT ACT CAT CAA GAA AAA TCT TTA
992 AAA GAA AAA AAA TAC TGT GAG CAT TTA AGA TCT TAA ACG TTG ACT
1037 ATT GTA CTC TTC TTA GAC AGT TGG TTA GCA ATT CAA GGA CAC ATA
1082 TCT TCA TTC TTT TCT GAT ACA GAC TTT TCA AGT GGG TCT GTT GTC
1127 ACT GGG CTG ATT CTT CTC AAT AAA TTA TTC TGG CAG CAA CTG AAA
1172 AAA AAA AAA AAA AA