本发明涉及一种本质上为蛋白质的组合物，该组合物能选择性抑制对雌激素敏感的肿瘤细胞的分裂和/或能对所说肿瘤细胞施加细胞毒性作用。本发明也涉及一种从人脂肉瘤分离到的能在培养中分裂的细胞系（该培养过程中细胞系产生所说组合物）以及涉及于其中存在所述组合物的条件培养基中的该细胞系的培养方法。 本发明还涉及所说产物在诊断和临床上的应用。
现有技术中已知大量能在体外生长的最初从人肿瘤分离到的细胞系。这些细胞系在研究其生理学性质方面以及特异因子的产生方面特别有用。
至今尽管有大量尝试，但在现有技术中仍然没有发现已知的具有与脂肪细胞（adipose cell或adipocytes）相关的分化表型的细胞系，也没有发现已知的属于脂肉瘤类的肿瘤分离到的细胞系。如果这些细胞源于基质组织（目前很少知道该组织的特性，考虑到邻近组织所起的某些功能，该组织被认为起控制作用）则特别有用。事实上，体内在有激素睾酮存在的乳腺中，脂细胞诱导上皮组织退化[Kratochwill，K.Development and loss of androgen responsiveness in the emtryonic rudiment of thd mouse mammary gland.Dev.Biol 61∶358-365，1977]，因而施加旁作用（Paracrine action），这种作用可能被所说脂细胞释放的一种或多种化合物介导[Kratochwill，K.1987，in cellular and Molecular Biology of Mammary Cancer一书（D.Medina，W.K.dweel，G.Heppner，e.E.Anderson，eds.pp 1-8 Plenum，New York]。
上述研究具体给出以能完成体内观察到地功能的细胞系的体外分离和生长所需的证据。
本发明的作者第一次分离到能够在培养中分裂，具有脂细胞表型相关表型的细胞系，并表述其特性。令人惊奇的是，该细胞系在条件培养基为主的培养基中产生至少一种能够选择性抑制源于对雌激素敏感的上皮（epithelila）肿瘤的上皮肿瘤细胞分裂的化合物。
“与脂细胞表型相关表型”一词是指至少一种象脂类合成一样脂细胞特有的分化特征的表现形式。“上皮肿瘤细胞”一词是指源于上皮肿瘤的肿瘤细胞，所说细胞已被分离出或仍存在于肿瘤块上。“雌激素敏感上皮肿瘤”一词是指由带有至少一种属于雌性激素类激素受体的细胞所组成的肿瘤。“条件培养基”一词是指在适合于细胞生长的温度、温度和PH条件下，在其中培养所述细胞至少6小时的培养基。“抑制细胞分裂能力”是指在所说细胞培养环境中培养至少3天后化合物在培养中抑制至少50%细胞生长的能力。
因此，明显需要辨别和鉴定能够选择性抑制源于雌激素敏感性上皮瘤的瘤细胞分裂的这些化合物的特性。
近期出版的文献[Mendelsohn M.E.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，11212-11216，1991]中公开了“热休克”（“heat shock”）P27人蛋白[HSD27，已由Hickey E.等识别和定序，Nucl.Acids Res.，14，10 4127-4145（1986）]具有199aa氨基酸序列，与和雌激素-受体相关的蛋白质序列相同并称作P29[Coffer A.I.等，Cancer Ressearch 45，3686-3693，1990]。
最近[Carper S.W.等，Nucl.Acids Res.18，6457，1990]一种从肺癌A549细胞系获得的CDNA克隆已被定序，该克隆的核苷酸序列编码205个氨基酸的蛋白质，其中首先的193个氨基酸与已知的人HSp27的那些氨基酸恰好一致。与编码194位氨基磺酸酯残基的密码Z相对应处检测出插入了两个胞嘧啶残基，它决定了读码（reading frame）移向位于核苷酸序列6161-618位处的下一个终止密码Z处，这种插入引起HSp27蛋白质C-端序列的修饰，使最后5个氨基酸不同（从195位到199位）并表现出延长6个氨基酸（从200位到205位）。
在描述过的现有技术的蛋白质中，没有证据表明其中任何一种具有对肿瘤细胞分裂的抑制活性。
在从LSA细胞系产生和分泌的化合物中，本发明的发明人识别出一种化合物，并鉴定了其特性，它的组合物本质上实际是蛋白质，能选择性抑制雌激素敏感肿瘤上皮细胞分裂，并能对这些肿瘤细胞施加细胞毒性作用。发明人表述了所说化合物的生物化学特性，将其称作P1LSA，并测定了其氨基酸序列，证明它由205个氨基酸组成。发明人惊奇地发现所说氨基酸序列除一单个氨基酸外与Carper S.W（文献出处同上）测定的人HSp27蛋白质序列相同。所观察到的不同是在194位氨基酸（精氨酸取代脯氨酸），由编码蛋白质HSp27的序列的581位处以鸟嘌呤取代了胞嘧啶而决定的。
因此，发明人识别出一种对雌激素敏感上皮肿瘤细胞具特异性的具抗肿瘤生物活性的新化合物。
发明人识别了编码蛋白质P1LSA的核苷酸序列，并且测定了其氨基酸序列。
相应的，本发明的一个目的是一种化合物，其组合物在本质上实际上是蛋白质的，所说化合物能够选择性抑制雌激素敏感上皮肿瘤细胞的细胞分裂和/或能对所说肿瘤施加细胞毒性活性;所说的化合物的分子量范围为27到30千道尔顿（KDa）;所说化合物也含有基本上同源于相应的人蛋白质HSp27（热休克p27）序列的从1位氨基酸到193位氨基酸的氨基酸序列，或者说关系到具生物活性的所述化合物的一个片断。
“基本上同源的氨基酸序列”一词是指在本发明的范围内不引起蛋白质生物活性丧失的50%到100%同源的所指序列。“生物活性”一词是指能选择性抑制雌激素敏感性上皮肿瘤细胞分裂（抑制细胞生长活性）和/或对所说肿瘤细胞施加细胞毒性作用的能力。
按照本发明一个优选的实施方案，其组合物在本质上实际是蛋白质的所说化合物在其羧基末端含有一种基本上同源于以下序列的氨基酸序列：
GluAlaAlaLysSerAspGluThrAlaAlaLys-NH2
优选的所说本质上为蛋白质的化合物包含下列氨基酸序列：
MetThrGluArgArgValProPheSerLeuLeuArgGlyProSer 15
TrpAspProPheArgAspTrpTyrProHisSerArgLeuPheAsp 30
GlnAlaPheGlyLeuProArgLeuProGluGluTrpSerGlnTrp 45
LeuGlyGlySerSerTrpProGlyTyrValArgProLeuProPro 60
AlaAlaIleGluSerProAlaValAlaAlaProAlaTyrSerArg 75
AlaLeuSerArgGlnLeuSerSerGlyValSerGluIleArgHis 90
ThrAlaAspArgTrpArgValSerLeuAspValAsnHisPheAla 105
ProAspGluLeuThrValLysThrLysAspGlyValValGluIle 120
ThrGlyLysHisGluGluArgGlnAspGluHisGlyTyrIleSer 135
ArgCysPheThrArgLysTyrThrLeuProProGlyValAspPro 150
ThrGlnValSerSerSerLeuSerProGluGlyThrLeuThrVal 165
GluAlaProMetProLysLeuAlaThrGlnSerAsnGluIleThr 180
IleProValThrPheGluSerArgAlaGlnLeuGlyGlyArgGlu 195
AlaAlaLysSerAspGluThrAlaAlaLys 205.
按照本发明的一个优选方案，所说本质上为蛋白质的化合物由LSA细胞（DSM ACC.N.2029）产生，优选由所说细胞在培养基中分泌。
本发明的另一个目的是作为药用的组合物，优选用于肮肿瘤，更优选用于治疗雌激素敏感上皮肿瘤。该组合物含有本发明的本质上为蛋白质的化合物或其生理学上可接受的盐。
本发明的另一个目的是根据本发明使用本发明的所说的本质上为蛋白质的化合物或其生理学上可接受的盐制备用于抗肿瘤治疗的药用化合物，优选用于治疗雌激素敏感性上皮肿瘤。
本发明的另一个目的是含有编码本发明的化合物（其组合物根据本发明本质上是蛋白质的）的核苷酸序列的核酸。优选所说核酸包含以下核苷酸序列：
ATGACCGAGCGCCGCGTCCCCTTCTCGCTCCTGCGGGGCCCCAGC 45
TGGGACCCCTTCCGCGACTGGTACCCGCATAGCCGCCTCTTCGAC 90
CAGGCCTTCGGGCTGCCCCGGCTGCCGGAGGAGTGGTCGCAGTGG 135
TTAGGCGGCAGCAGCTGGCCAGGCTACGTGCGCCCCCTGCCCCCC 180
GCCGCCATCGAGAGCCCCGCAGTGGCCGCGCCCGCCTACAGCCGC 225
GCGCTCAGCCGGCAACTCAGCAGCGGGGTCTCGGAGATCCGGCAC 270
ACTGCGGACCGCTGGCGCGTGTCCCTGGATGTCAACCACTTCGCC 315
CCGGACGAGCTGACGGTCAAGACCAAGGATGGCGTGGTGGAGATC 360
ACCGGTAAGCACGAGGAGCGGCAGGACGAGCATGGCTACATCTCC 405
CGGTGCTTCACGCGGAAATACACGCTGCCCCCCGGTGTGGACCCC 450
ACCCAAGTTTCCTCCTCCCTGTCCCCTGAGGGCACACTGACCGTG 495
GAGGCCCCCATGCCCAAGCTAGCCACGCAGTCCAACGAGATCACC 540
ATCCCAGTCACCTTCGAGTCGCGGGCCCAGCTTGGGGGCCGAGAA 585
GCTGCAAAATCCGATGAGACTGCCGCCAAGTAA 618
本发明的另一个目的在于含有本发明核苷酸序列的质粒或噬菌体型载体。
本发明的另一个目的是能在体外分裂并且具有与脂细胞相关表型的哺乳纲细胞系，它也在其条件培养基中产生至少一种能选择性抑制肿瘤细胞分裂，优选上皮肿瘤细胞，更优选源于雌激素敏感性上皮肿瘤细胞分裂的化合物。
按照本发明的一个优选方案，所说细胞系从脂肉瘤（优选来源于人）分离出，这种细胞系更优选地是寄存于DSM登记号为2029的LSA细胞系。再一次强调根据本发明所说细胞系产生具有上述公开序列的实际上为蛋白质的化合物。
本发明另一个目的是以本文所公开的和要求保护的细胞系的生长为条件的培养基。
优选所说条件培养基包括至少一种能选择性抑制肿瘤细胞（优选上皮肿瘤细胞，更优选源于雌激素敏感上皮肿瘤的细胞）分裂的化合物，更优选的所说化合物是本发明公开的蛋白质化合物。
按照本发明的一个优选方案，所说培养基以生长LSA细胞系（DSM ACC.N.2029）为条件。
本发明的另一个目的是使用所说条件培养基产生治疗肿瘤（优选上皮肿瘤，更优选雌激素敏感肿瘤）的药物组合物。
本发明的另一个目的是使用所说条件培养基提纯，鉴别和表征至少一种能选择性抑制肿瘤细胞，（优选上皮肿瘤细胞，更优选源于雌激素敏感上皮肿瘤的细胞）分裂的化合物。
本发明将用一些实施例来加以公开，这些实施例仅用来解释和说明本发明，而不用来限制本发明。这里供参考的附图有：
附图1表示LSA系在有和无血清存在的两种情况下的生长曲线;
附图2a表示人正常胸腺细胞的细胞荧光分析结果;
附图2b表示LSA细胞的细胞荧光分析结果;
附图3表示在各种细胞系中掺入3[H]-胸苷的LSA-CM刺激条形图。其中，1是对照样品，2是在1/4稀度时的LSA-CM，3是在1/2稀度时的LSA-CM，4是未稀释时的LSA-CM，5是对照样品，6是未稀释时的LSA-CM，7是对照样品，8是未稀释时的LSA-CM;
附图4表示在有和无LSA-CM存在时的两种情况下MCF-7细胞系的生长曲线;
附图5表示在有和无LSA-CM存在时两种情况下ZR-75-1细胞系的生长曲线;
附图6表示在有和无LSA-CM存在时两种情况下MDAMB-231细胞系的生长曲线;
附图7表示在有无LSA-CM存在时两种情况下NMNG细胞系的生长曲线;
附图8表示在有和无LSA-CM存在时两种情况下从卵巢（ovaric）癌得到的人细胞的生长曲线;
附图9表示在有和无LSA-CM和/或纯化的P1LSA存在时的两种情况下从卵巢癌得到的人细胞生长的条形图。
实施例1
LSA细胞系的分离
以无菌方式的外科手术从65岁成年妇女的腿部取出混合成脂细胞-纤维细胞型人脂肉瘤片断。
片断用凿子（chisel）机械捣碎，以获得1mm碎片，所得物质用相当于20μ/ml胶原酶（CLSP，Worthington，Regno Unito），075mg/ml胰蛋白酶（1/300，Inc.Pharmaceuticals），2%鸡血清的CTC溶液处理，在37℃和不断搅抖下在无Ca2+和Mg2+离子的Hank培养基（Soil）（GIBCO）和含有5%牛血清的Ham F12培养基（Soil）（GIBCO）中热灭活和透折4小时，以获得单细胞悬浮液。
细胞悬浮液以补充有5%牛血清（GIBCO）、青霉素（31μg/ml）、链霉素（50μg/ml）和二性霉素B（25μg/ml）的Ham F12（GIBCO）培养基稀释。细胞以200，000细胞/皿铺在直径为100mm的平皿（Costar）上。
一种能在培养中分裂并具有特异于脂细胞特点的细胞克隆从培养基中获得，所说克隆被称作LSA，保藏在DSM，保藏号为ACC 2029。
附图1示出LSA系的生长曲线，其中在有和无血清存在下的生长曲线是明显的。LSA系表现出90%的平皿铺盖率（plating efficiency），在有血清存在时，其倍增时间为50-52小时，在无血清存在时，则为102小时，培养基每72小时换一次。
实施例2
LSA系的特性表述
LSA细胞的DNA内含物通过细胞荧光计（Partec Pas Ⅱ flow-cytometer）来分析。细胞经胰蛋白酶解并以70%乙醇固定，用含有5μg/ml溴化乙锭、12.5μg/ml光辉霉素和15mg MgCl2于0.1M Tris缓冲液（PH 7.5）的溶液染色。在Mitotic循环各步骤中的细胞百分数用Flintoff，W.E.，Davidson，S.V.和Siminowitch，L.在“Isolation and partial Charcterization of Methotrexate-Resistent phenotype from Chinese hamster ovary cell”（Somatic cell Genet.2∶245-261 1976）一文中和Ambesi-Impiom-bato，F.S.，Parks，L.A.M.和Coon H.G.在“Culture of hormone-dependent functional epithelial cells from rat thyroid”（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77∶3455-3459，1980）一文中公开的方法获得。
如附图2b所示，这些值与用正常人胸腺细胞作为倍性标准的方法获得的值相比。将胸腺细胞的G1-G0峰值定为1，在相同的条件下，LSA细胞的G1-G0峰值是1.79，这意味着DNA内含物几乎是四倍。如附图2a所示，DNA内含物/细胞也几乎是用胸腺细胞获得的两倍。
在对数生长期的LSA细胞群的细胞循环的各种阶段的细胞分布情况示于下列表1。
表1
阶段 细胞百分比
G1-G059
S 27
G2/M 14
S阶段的细胞百分比说明细胞群处于活性生长阶段。
染色体计数证明染色体数/细胞在80和90之间。
当在光学显微镜下观察时，LSA细胞看上去象带有丰富（abudant）细胞质的拉长体。而在电子显微镜下，则发现细胞核含有许多核仁和位于核周区的细胞器。细胞相互同源，线粒体相对丰富，细胞质泡在数量上和大小上恒定不变。最明显的特点是在细胞质内存在液泡区域，此区域是电子反射的并且是高脂含量带的典型，为在电子显微镜下观察而将细胞处理配制的结果则将它们除去。此外，也存在一个发育良好的高尔基体（Golgi）。为了估算脂的含量，将LSA细胞铺到Lab-Teck（NUNC）培养斜面上，在半汇合下（Semi-confluence）生长。将细胞冲洗后，用4%多聚甲醛和在PBS（磷酸盐水缓冲液）中15%饱和苦味酸固定6分钟，用蒸馏水冲洗细胞2次，然后用油红O溶液染色5分钟，再用PBS冲洗两次，用1%甲基胺蓝染色10秒钟。
假如细胞在5%牛血清存在下生长，类脂被分散到细胞质中，成园形的泡。在无血清培养基中生长的细胞中则不形成类脂，但当用甲基黄嘌呤/desamethasone培养细胞48小时和用胰岛素再培养48小时后则被刺激生成。
实施例3
以LSA（SA-CM）为条件的培养基对不同细胞系体外生长的作用
LSA细胞在盛有含5%牛血清的F12培养基的100mm平皿（Costar）中长到80%汇合后，以PBS洗涤细胞单层，用无血清F12培养基培养。24小时后，用新鲜培养基取代原培养基，该条件培养基每6-24小时收集一次，持续30天。细胞继续生长，用锥虫蓝（Trypan Bluc）染色后，在相对照显微镜下观察它们在结构上和功能上都显示是有生命的。
以LSA细胞为条件的培养基能刺激正常上皮细胞的生长，像CHO（CCL-61）、FRTL-5（CRL-1468）和NIH-3T3（ECACC-87100803）在无血清下生长24小时的情况，正如由3H-胸苷掺入试验所证明的（见附图3）。与上述结果相反，以LSA细胞为条件的培养基，在用含有雌激素受体的肿瘤细胞体外分析时，表现出对细胞溶解活性生长的抑制作用。使用的细胞是：
从人乳房癌获得的MCF-7细胞（Land，H.等，Science 222∶778（1980），ECACC-86012803），该细胞具有雌激素受体（Soule，H.O.等，Natl.Cancer Inst.S1，1409-1413（1973））、雄激素受体（Horowity，K.B.等，Steroids 26，785-795（1975））、胰岛素和triodothyronine受体（MacGrath，C.M.Cancer Res.，43∶1355-1360（1983））;
从人乳房癌获得的ZK-75-1（CRL-1504）细胞，所说细胞对雌激素受体呈阳性。
从人乳房癌获得的MDAMB-231（ATCC-HTB26）细胞，而它对雌激素受体呈阴性。
从鼠乳房上皮获得的NMMG（Burker，R.E.等，Cancer Res.，38∶3769-3773（1978），CRL-1636）细胞，所说细胞对雌激素受体呈轻微阳性。
从患有因卵巢癌转移引起的腹膜渗漏的妇女获得的卵巢癌人细胞等。所说细胞系对雌激素受体呈阳性。
这里提到的细胞系的生长曲线通过按100，000细胞/皿铺覆在直径为100mm盛有带有10%牛胎血清（FCS，GIBCO）的10ml DMEM（GIBCO）培养基中而获得。有2ml LSA-CM被加到每个皿中。
附图4表示MCF-7系的生长曲线，其中LSA-CM的抑制作用明显。特别是，经4天处理后，由于胞溶作用，移去LSA-CM仍不能重新恢复MCF-7细胞的增殖能力。
附图5表示在有或无LSA-CM存在的两种情况下7R-75-1系的生长曲线，LSA-CM的存在引起强烈的生长抑制作用，并无任何胞溶作用。
附图6和7表示MDAMB-231细胞和正常上皮NMMG细胞的生长曲线，其中明显无由于LSA-CM引起的生长抑制作用，这样的细胞不表现出雌激素受体。
附图8表明，即使培养24小时后，LSA-CM条件培养基对人卵巢癌细胞具有细胞毒性作用。
在不同细胞系中LSA-CM对3H-胸苷掺入的作用列在下表2中。
表2
在不同细胞系中LSA-CM对3H-胸腺苷掺入的作用
细胞系 无作用 激活 抑制
MCF 7 +
ZR-75-1 +
NMMG +
FRTL-S +
CHO +
NTH-3T3 +
实施例4
LSA-CM对动物的作用
挑选20只受Bittner病毒感染有明显肿瘤块的Balb/c fc 3H鼠（Charles River），系患雌激素依赖乳房癌，由病毒本身诱导而致。
每天腹膜注射200μl LSA-CM 15天后，80%经治疗过的鼠中观察到肿瘤组织生长被抑制和坏死。
实施例5
从LSA-CM分离P1LSA蛋白质
LSA-CM培养基浓缩100倍，在PH 7.4下对等溶磷酸盐缓冲液渗析，然后在P6树脂（Pharmacia）上凝胶过滤。将洗脱组分用来试验选择性抑制MCF-7细胞生长的能力。仅一个组分显示所说生物活性。将所说组分的一个样品在非变性条件下于聚丙烯酰胺胶上电泳而分离，鉴别为一种约29KDa的蛋白质，称作P1LSA。将所说蛋白质电洗脱，用来生产以下所说的多克隆抗体和用于序列分析。
该蛋白质序列如下表3所示。
如附图9所示，纯化的P1LSA蛋白质对人卵巢肿癌细胞具有明显的细胞毒性作用。
表3
P1LSA蛋白质的氢基酸序列和相应的编码序列
ATGACCGAGCGCCGCGTCCCCTTCTCGCTCCTGCGGGGCCCCAGC 45
MetThrGluArgArgValProPheSerLeuLeuArgGlyProSer 15
TGGGACCCCTTCCGCGACTGGTACCCGCATAGCCGCCTCTTCGAC 90
TrpAspProPheArgAspTrpTyrProHisSerArgLeuPheAsp 30
CAGGCCTTCGGGCTGCCCCGGCTGCCGGAGGAGTGGTCGCAGTGG 135
GlnAlaPheGlyLeuProArgLeuProGluGluTrpSerGlnTrp 45
TTAGGCGGCAGCAGCTGGCCAGGCTACGTGCGCCCCCTGCCCCCC 180
LeuGlyGlySerSerTrpProGlyTyrValArgProLeuProPro 60
GCCGCCATCGAGAGCCCCGCAGTGGCCGCGCCCGCCTACAGCCGC 225
AlaAlaIleGluSerProAlaValAlaAlaProAlaTyrSerArg 75
GCGCTCAGCCGGCAACTCAGCAGCGGGGTCTCGGAGATCCGGCAC 270
AlaLeuSerArgGlnLeuSerSerGlyValSerGluIleArgHis 90
ACTGCGGACCGCTGGCGCGTGTCCCTGGATGTCAACCACTTCGCC 315
ThrAlaAspArgTrpArgValSerLeuAspValAsnHisPheAla 105
CCGGACGAGCTGACGGTCAAGACCAAGGATGGCGTGGTGGAGATC 360
ProAspGluLeuThrValLysThrLysAspGlyValValGluIle 120
ACCGGTAAGCACGAGGAGCGGCAGGACGAGCATGGCTACATCTCC 405
ThrGlyLysHisGluGluArgGlnAspGluHisGlyTyrIleSer 135
CGGTGCTTCACGCGGAAATACACGCTGCCCCCCGGTGTGGACCCC 450
ArgCysPheThrArgLysTyrThrLeuProProGlyValAspPro 150
ACCCAAGTTTCCTCCTCCCTGTCCCCTGAGGGCACACTGACCGTG 495
ThrGlnValSerSerSerLeuSerProGluGlyThrLeuThrVal 165
GAGGCCCCCATGCCCAAGCTAGCCACGCAGTCCAACGAGATCACC 540
GluAlaProMetProLysLeuAlaThrGlnSerAsnGluIleThr 180
ATCCCAGTCACCTTCGAGTCGCGGGCCCAGCTTGGGGGCCGAGAA 585
IleProValThrPheGluSerArgAlaGlnLeuGlyGlyArgGlu 195
GCTGCAAAATCCGATGAGACTGCCGCCAAGTAA 618
AlaAlaLysSerAspGluThrAlaAlaLys 205
通过与贮存在数据库中的序列比较，证明该序列除仅一个氨基酸外，与上面提到的由Carper S.W.描述的对应的人HSp27蛋白质相同，不同之点在于194位氨基酸的取代，所说氨基酸是由精氨酸取代脯氨酸。
实施例6
抗-P1LSA多克隆抗体的生产和P1LSA蛋白质活性的抑制
将从10%聚丙烯酰胺胶上洗脱的100μg P1LSA蛋白质溶解在1ml PBS（磷酸盐水缓冲液），并与1ml费氏完全佐剂混合。每隔10天将混合物通过肌内注射兔子，共四次。20天内每隔一天从兔子取出30ml免疫血清。按厂商说明用Mab Trap G（Pharmacia）纯化免疫球蛋白（Ig）部分。
免疫沉淀和免疫印迹（immunoblotting）试验表明，免疫球蛋白以一种特定方式与LSA-CM来源的P1LSA蛋白质反应。
37℃下预培养带有10μl 1mg/ml Ig溶液的100μl LSA-CM30分钟可终止抑制肿瘤上皮细胞（MCF-7）分裂的活性，恢复到类似于未处理的对照样品的3H-胸腺掺入和生长曲线，证明以预免疫血清培养后LSA-CM活性未改变。
这些实验数据表明，按以上实施例5公开的方法分离和纯化的，具有表3公开的序列的P1LSA蛋白质实际上对抑制本文所说的上皮细胞分裂的活性起主要作用。
实施例7
编码P1LSA蛋白的核苷酸序列
编码P1LSA蛋白质的核苷酸序列由按标准方法从LSA细胞提纯的RNA poly A+，使用下列引物进行PCR反应来测定：
Oligo 5'：GGGAATTCTGAGCAGACGTCCAGAG
ECORI
Oligo 3'：CGGAATTCCGGGCTAAGGCTTTACTTG
ECORI
该两序列分别从5'和3'位不转译编码HSp27基因的序列推测出。
扩增产物在载体pGEM4Z（Promega）的EcorI位点被直接克隆，并用双脱氧（dideoxy）法测序。编码蛋白质的完全序列示于表3。
本发明以结合其优选方案而加以公开，但需理解，由本专业技术人员所作的修饰和改变并不背离本发明的精神和范围。