本发明针对癌症化疗期间避免肿瘤细胞中出现多药物抗性的方法。具体说来，它涉及使用蛋白激酶抑制剂来避免由化疗药物对多药物抗性（MDR1）基因的诱导作用。本文已证明，在对用各种细胞毒性药物治疗产生反应时将会诱导MDR1基因表达（它在肿瘤细胞中引起随后对某些化疗药物治疗的抗性）。本文也证明，蛋白激酶抑制剂能抑制该细胞反应。因此在给癌症患者施以细胞毒性药物以前和/或同时，可将蛋白激酶抑制剂用于避免在各种肿瘤细胞中，由化疗药物引起的MDR1诱导作用。 化疗是现今常规癌症治疗的主要形式。然而伴随癌症化疗的一个主要问题是，在治疗过程中，肿瘤细胞就产生针对抗癌药物细胞毒性作用的抗性。业已观察到，肿瘤细胞甚至可以同时产生对结构不同及作用机理不同的几种化疗药物的抗性。这种现象称之为多药物抗性。有关肿瘤细胞中多药物抗性的大多数文献及临床相关机理均关系到P-糖蛋白的表达物，即MDR1基因产物。
P-糖蛋白是位于细胞膜的一种广泛特异性流向泵，它通过减少许多亲脂细胞毒性药物（包括某些广泛使用的抗癌剂例如蒽环类抗生素，长春生物碱、表鬼臼脂素、放线菌素D及红豆杉醇）在细胞内积累而发挥功能，由此便产生对这些药物的细胞抗性（Pastan andGottesman，1991，Annu.Rev.Med.42：277-286;Roninson（Ed.），1991，Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor cells，plenum Press，New York;Schinkel and Borst 1991，Seminars in Cancer Biology 2：213-226）。
在几种类型的正常表皮和内皮组织（Cordon-Cardo等人，1990 J.Histochem.Cytochem.38：1277-1287;Thiebaut等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：7735-7738），以及在生血干细胞中（Chaudhary and Roninson，1991，Cell 66：85-94）和成熟淋巴细胞的亚群体中（Neyfakh等人，1989，Exp.Cell Res.185：496-505）表达人P-糖蛋白。更重要的是，在化疗前或化疗后，在大多数类型人肿瘤中都检测出MDR1 mRNA或P-糖蛋白（Goldstein等人，1989，J.Natl.Cancer Inst.81：116-124;Noonan等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：7160-7164）。MDR1的最高水平表达通常在表达MDR1的正常组织衍生地肿瘤中发现，例如胃癌、肾上腺皮质癌或结肠直肠癌。在其它类型的实体肿瘤及白血病中，治疗前MDR1表达通常相当低或不可检测出来，但经化疗之后，则这些恶性病灶的实质部分表达极高水平的MDR1（Goldstein等人，1989，J.Natl.Cancer Inst.81：116-124）。在本发明以前，人们通常相信化疗后MDR1表达增加，是由于体内选择了因MDR1表达已经产生对化疗药物抗性的稀有预存在的肿瘤细胞所致。
即使低水平的MDR1表达，也会引起几种不同类型癌症对化疗失去反应（Chan等人，1990，J.Clin.Oncol.8：689-704;Chan等人，1991，N.Engl.J.Med.325：1608-1614;Musto等人，1991，Brit.J.Haematol.77：50-53），这一事实表明P-糖蛋白介导的多药物抗性代表临床药物抗性的一种重要组成。鉴于许多临床及临床研究强调为抑制P-糖蛋白功能而采用药物学策略（Ford and Hiat，1990，Pharmacol.Rev.42：155-199），而本发明以前，很少了解有关在癌症化疗的相应条件下，对诱导或上调肿瘤中P-糖蛋白表达起作用的种种因素。了解这些因素，可以提供研究避免肿瘤中P-糖蛋白出现的改进方法，由此降低癌症的多药物抗性发生，并导致癌症化疗更为有效。
许多基因转移研究证明，提高的MDR1基因表达足以造成多药物抗性表型（Roninson（Ed.），1991，Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cell，Plenum Press，New York）。例如用携带人MDR1 cDNA的重组逆转录病毒感染的小鼠NIH 3T3细胞、与其表面人P-糖蛋白的密度成比例地转变成多药物抗性。此种相关性不受是否存在细胞毒性选择所影响（Choi等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7386-7390）。
此外，某些其它生物化学变化与多药物抗性细胞始终相关这一事实，表明这样的变化对多药物抗性也可起作用，可能通过影响P-糖蛋白的表达或功能来起作用。这些变化最突出的是增加蛋白激酶C（PKC）的活性，所说蛋白激酶在许多（尽管不是全部）多步骤细胞毒素选择之后获得的多药物抗性细胞系中发现（Aguino等人，1990，Caner Commun.2：243-247;Fine等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：582-586;O′Brian等人，1989，FEBS Lett.246：78-82;Posada等人，1989，Cancer Commun.1：285-292）。PKC激活表明要增加某些药物敏感和多药物抗性细胞系中的药物抗性水平（Ferguson and Cheng，1987，Cancer Res.47：433-441;Fine等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：582-586;Yu等人，1991，Cancer Commun.3：181-189）。虽然PCK很明显可磷酸化为P-糖蛋白（Chambers等人，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.169：253-259;Chambers等人，1990，J.Biol.Chem.265：7679-7686;Hamada等人，1987，Cancer Res.47：2860-2865），但不知道是否这样的磷酸化作用要对所观察到的药物抗性变化负全部责任。虽然业已表明某些PKC抑制剂能逆转某些P-糖蛋白表达细胞系中的多药物抗性（O′Brian等人，1989，FEBS Lett.246：78-82;Posada等人，1989，Cancer Commun.1：285-292;Palayoor等人，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.148：718-725），但已有证据表明，至少某些观察到的影响是由于试验化合物对P-糖蛋白功能的直接抑制，而非对PKC介导的磷酸化作用的抑制（Ford等人，1990，Cancer Res.50：1748-1756;Sato等人，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.173：1252-1257）。上面的研究未证明PKC相互作用因子可能对表达而不是对P-糖蛋白的磷酸化作用或功能有影响。
有几个实验室已对正常细胞和恶性细胞中调节MDR1基因表达的因素进行过研究。一个MDR1同系物的正常生理调节的明显例子是在鼠子宫内膜发现的，其中在怀孕开始时小鼠mdr基因的表达由类固醇激素所诱导（Arceci等人，1990，Mol.Repro.Dev.25：101-109;Bates等人，1989，Mol.Cell.Biol.9：4337-4344）。在大鼠肝中，发现mdr基因的表达可由几种致癌的或细胞毒性的异生物素所诱导，相似的诱导作用也在肝再生期间观察到（Fairchild等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：7701-7705;Thorgeirsson等人，1987，Science，236：1120-1122）。此外MDR1的一种啮齿类的同系物，也能在对使用某些细胞毒性药物治疗产生反应的几种细胞系中诱导出来（Chin等人，1990，Cell Growth Diff.1：361-365）。相反，在同样研究中，任何试验的人细胞系中都没有检测出细胞毒性药物对人MDR1基因的诱导作用。其它的研究人员也没检测出由于以细胞毒性药物治疗所产生的MDR1诱导作用（Schinkel and Borst，1991，Sem.Cancer Biol.2：213-226）。
然而几种研究已表明，在一定条件下人的MDR1基因也可能对所强调的诱导作用是敏感的。这样在某些人细胞系中MDR1的表达会由于以热休克，亚砷酸盐（Chin等人，1990 J.Biol.Chem.265：221-226）或某些分化剂治疗（Mickley等人，1989，J.Biol.Chem.264：18031-18040;Bates等人，1989，Mol.Cell Biol.9：4337-4344）而提高。某些细胞毒性P-糖蛋白底物，据报道能刺激从人MDR1启动子转录报告基因（Kohno等人，1989，Biochem.Biophys.Res.Commun.165：1415-1421;Tanimura等人，1992，Biochem.Biophys.Res.Commun.183：917-924），并且在延长暴露之后可提高间皮瘤细胞系中P-糖蛋白的表达（Licht等人，1991，Int.J.Cancer 49：630-637）。尽管有MDR1诱导作用的这类报道，但还从来没有肯定，在短期暴露于癌症化疗所使用的任何药剂时，是否可以诱导人细胞中MDR1基因的表达，以及是否这样的诱导作用可以通过药剂来避免。
最近，Kioka等人已报道，加入类黄酮，五羟黄酮可以避免由亚砷酸盐（一种不用于治疗癌症的化合物，但已知它能激活启动子的热休克反应成分介导的转录途径）所诱导的MDR1在肝癌细胞中的表达（Kioka等，1992 FEBS Lett 301：307-309）。虽然Kioka等人的文献中并未提到，但PKC活性的抑制作用是五羟黄酮的生物学作用之一（Gschwendt等人，1984，Biochem.Biophys.Res.Commun.124：63），因此由五羟黄酮产生的PCK抑制作用，可能要对观察到的由亚砷酸盐所产生的MDR1诱导作用的抑制作用负部分责任。但是值得注意的是，本领域技术人员相信五羟黄酮抑制由热休克反应成分介导的转录反应的能力与PKC抑制作用无关（Kantengwa and Polla 1991，Biochem.Biophys.Res.Commun.180：308-314）。而且Kioka等人的文献也未提出非类黄酮PKC抑制剂能抑制亚砷酸盐的MDR1诱导作用，或当与化疗药剂或任何不知道可激活热休克反应成分介导途径的其它药剂结合使用时，五羟黄酮能抑制MDR1表达的诱导作用。
本发明涉及使用蛋白激酶抑制剂来避免癌细胞中多药物抗性出现，以及体外鉴定为实现该目的有用的蛋白激酶抑制剂的方法。
本发明部分（无论是否由P-糖蛋白运输的）抗癌药物可以诱导MDR1基因在各种组织来源的人肿瘤细胞中表达这一发现。MDR1基因表达的增加在RNA和蛋白水平均观察到。MDR1诱导作用当以PKC激动剂处理细胞时也观察到。而且，由细胞毒性药物或PKC激动剂所产生的该诱导作用，可以通过以蛋白激酶抑制剂处理细胞而避免，这表明在MDR1基因诱导作用中卷入了蛋白激酶介导途径，并且蛋白激酶抑制剂可以用来阻止MDR1基因在暴露于化疗剂的癌细胞中表达。特别是，因对PKC无活性的蛋白激酶抑制剂不能抑制MDR1诱导作用，该抑制作用便与PKC抑制作用相关，因而对PKC具有效作用的蛋白激酶抑制剂则有效地抑制该反应。
当于体外短期暴露，化疗药物能诱导MDR1在人细胞中的表达这一事实表明，癌症化疗可直接诱导多药物抗剂，而不是通过预先存在的稀有变种的选择来进行。这种直接诱导多在患者的药物治疗过程中出现，这至少部分是经治疗的恶性病变相对于未经治疗的恶性病变来说，出现MDR1表达增加这一现象的原因。因此在涉及用细胞毒性药物的化疗以前或同时施用蛋白激酶抑制剂，对于避免MDR1诱导是有用的，并且由此避免了多药物抗性癌细胞的出现，从而收到更好的治疗效果。
本发明以实施例的方法来加以评述，在这些实施例中表明PKC激动剂可诱导MDR1在正常外周血淋巴细胞（PBL）及肿瘤细胞中的表达，此外，各种细胞毒性抗癌药物也表明能激活MDR1基因。更重要的是，蛋白激酶抑制剂被证明能阻止由PKC激动剂或细胞毒性药物介导的该MDR1诱导作用，特别是治疗以前肿瘤细胞中只有很少或者没有可检测的P-糖蛋白的情况下更是如此。各种用途包括在本文描述的本发明中，包括（但并不只限于）防止在癌症化疗期间多药物抗性肿瘤细胞的出现。
有关附图的简要介绍
图1.佛波醇酯（TPA）、二酰基甘油（DOG）及Staurospcrine（staur）对P-糖蛋白功能及在H9细胞系表达的影响。
A.未处理及经TPA或DOG处理的细胞3hr的Rh123积累。
B.未处理的细胞及以Staurosporine予处理然后以TPA或DOG处理的细胞3hr Rh123积累。
C.以IgG2a同型对照物染色未处理及以TFA或DOG处理的细胞。
D.同C，以UIC2抗体染色。
E.未处理细胞及仅以Staurosporine处理或以Staurosporine予处理后再以TPA或DOG处理的细胞经UIC2沾染。
图2.cDNA-PCR分析TPA、DOG及Staurosporine对MDR1 mRNA在不同细胞系中表达的影响。每一泳道中，上谱带（167bp）相应于MDR1，而下谱带（120bp）相应于β2-微球蛋白特异性的PCR产物。
A.TPA或DOF（用或不用Staurosporine予处理）对MDR1 mRNA在H9细胞中表达的影响。
B.TPA在H9细胞中对MDR1 mRNA的诱导时间过程。两个阴性对照（neg.con.）相应于以无RNA的水或反转录酶混合物代替cDNA完成的PCR。
C.TPA或DOG在K562细胞中以及TPA在MCF-7细胞中对MDR1 mRNA的诱导作用。
图3.药物诱导的MDR1表达的流式细胞计数分析。
A.在不存在30μM异博停（VER）（左）或存在30μM异博停（右）情况下，从K562细胞中P-糖蛋白-输送萤光染料的流出物。上图：从未处理细胞（-）流出的Rh123及从以50μM Ara-C（ARA）处理细胞12小时或以10μM Ara-C处理2天或3天细胞流出的Rh123。下图：从未处理细胞及从以1μg/ml长春碱（VBL）处理36小时的细胞流出的DiOC2（3）。
B.在Ara-C处理过的KGI白血病细胞中增加的P-糖蛋白表达。左图：未处理细胞中或以10μM Ara-C处理1.5天的细胞中Rh123的积累。右图：相同细胞以抗P-糖蛋白UIC2抗体或IgG2a同型对照物进行的间接免疫萤光法标记。
C.暴露于不同药剂已经保持于无药物介质中的，并由使用DiOC2（3）（横轴）和UIC2抗体双标记或以藻赤藓素（PE）（垂轴）间接标记的IgG2a同型对照（右图）分析得出的K562细胞的计数密度（左图）。从上到下：未处理的细胞，以60ng/ml阿霉素处理3天并无药生长5周的细胞、以30μM苯丁酸氮芥（CHL）处理5天并无药生长2周的细胞，以10μM Ara-C处理3天并无药生长5周（该实验使用其它检测中所用抗体一半之量）的细胞、以Ara-C按上面所述处理并在从药物中移出后周以萤光激活细胞分类术分离的灰暗Rh123细胞解体。
图4.在药物处理过的细胞中MDR1 mRNA表达的cDNA-PCR分析。每一泳道中上谱带（167bp）相应于MDR1，下谱带（120bp）相应于β2-微球蛋白特异性的PCR产物，在分开的管中扩增。
A.在K562细胞中Ara-C对MDR1的诱导作用。细胞暴露于所示Ara-C浓度4.5天。与未处理细胞相关的细胞生长由与RNA提取同时的MTT试验测定。
B.用不同药物处理的K562细胞中MDR1的诱导作用。暴露于药品的时间被标出。药品及其浓度如下：一未处理过的细胞;DAU，250ng。ml柔红霉素;ADR，500ng/ml阿霉素;VBL，20ng/ml长春碱;VP，1μg/ml鬼臼乙叉甙;MTX，200ng/ml氨甲蝶呤，CDDP，3μg/ml顺氯氨铂;CHL，50μM苯丁酸氮芥;5FU，2μg/ml 5-氟尿嘧啶，HU30μM羟基脲。
C.KB-3-1癌细胞中MDR1的诱导作用，未处理过的或以200ng/ml阿霉素或10μM Ara-C处理2天的情况。
D.在EJ癌细胞中MDR1的诱导作用，未处理过的（-）或以10μM Ara-C处理4天的情况。
E.药物诱导MDR1在K562细胞中表达的维持。细胞以60ng/ml阿霉素、10μM Ara-C或200ng/ml氨甲蝶呤处理3天，并且在无药物介质中培养所标明的时间。
图5.蛋白激酶抑制剂对H9细胞中细胞毒性药物对MDR1 mRNA诱导作用的影响。在每个试验中，抑制剂Staurosporine（ST）、H7、ISO-H7（IH7）或HA1004（HA）加入过两次，第一次在紧接相应药物加入之前，第二次在特定一段时间之后。
A.H9细胞，未处理的或以50μM Ara-C处理过22小时的。抑制剂按所标明的浓度在实验开始及16小时后加入。
B.H9细胞，未经处理的或以200ng/ml阿霉素处理过22小时的。相等量的抑制剂（0.03μM Staurosporine，10μM H7，HA-1004和ISO-H7）在实验开始及16小时后加入。
C.H9细胞，未经处理过的或以40ng/ml长春碱或200ng/ml氨甲蝶蛉处理过36小时的。相等量抑制剂（0.1μM Staurosporine;50μM H7）在实验开始及24小时后加入。
图6.在Ara-C或阿霉素处理过的K562细胞中的长春碱抗性。
A.在未经处理过的及以Ara-C或阿霉素（ADR）处理过的细胞中，长春碱的生长抑制作用。细胞按图3C处理，并于无药条件下生长6周。长春碱抑制作用检测进行10天。
B.在未经处理过的细胞中及Ara-C处理过的细胞的Rh123灰暗群体和Rh123明亮群体中，长春碱的生长抑制作用。Ara-C处理过的细胞从药物中移出后六个星期由Rh123流出方法染色并由萤光激活细胞分类法分成Rh123灰暗群体和Rh123明亮群体。该Rh123灰暗群体的纯度>60%（FIG.3C），而Rh123明亮群体纯度是90-95%。分类后一周，长春碱抑制作用检测进行7天。
本发明涉及使用蛋白激酶抑制剂避免在癌细胞中出现多药物抗性表现型。细胞毒性药物对MDR1的诱导以及蛋白激酶抑制剂避免该诱导作用的能力的发现在下面将给以充分叙述并举例说明。为便于讨论，本发明就抗PKC活性的二种蛋白酶抑制剂及一组专门的人肿瘤细胞系来加以介绍。但其原则适用于使用任何蛋白激酶抑制剂用于以任何化疗药物治疗的很宽范围的各种体外细胞系及体内肿瘤。
MDR1基因表达的诱导作用
TPA（12-O-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯），一种有效的PKC激活剂，及二酰基甘油，一种PKC生理刺激剂，在下面实施例1中表明能增加在正常人PBL中及从不同类型白血病或实体肿瘤衍生的细胞系中MDR1基因的表达。TPA的作用在治疗前表达P-糖蛋白的所有实验细胞系中均观察到，并且也在不带有可检测出的P-糖蛋白的某些其它细胞系（但不是所有该其它细胞系）中观察到。但是使用比本文所述实验浓度更高的TPA，MDR1表达可能在无反应的细胞系中被诱导出。所观察到的TPA和二酰基甘油的作用表明，在人细胞中MDR1的表达可以通过PKC介导信号转导途径来调节。
以PKC激动剂处理的细胞中，在P-糖蛋白及MDR1 mRNA水平均观察到MDR1表达的增加，增加的稳定状态水平的MDR1 mRNA降解募跎佟SΦ弊（14）獾饺耍停模遥被虻闹餐O掠纹舳ˇ樱（Ueda等人，1987，J.Biol Chem.262：505-508）包含负责由TPA刺激转录的AP-1位点（Angel等人，1987，Cell，49：729-739;Lee等人，1987，Cell，49：741-752）。该AP-1位点及其周围序列在人MDR1基因和其啮齿类同系物中是保守的。（Hsu等人，1990，Mol.Cell.Biol.10：3596-3606;Teeter等人，1991，Cell Groth Diff.2：429-437）。仓鼠pgp1基因的AP-1序列表明基本上是其启动子的正性调节子（Teeter等人，1991，Cell Growth Diff.2：429-437），但该同系物小鼠mdrla（mdr3）基因的相应成分则具负性调节作用（Ikeguchi等人，1991，DNA Cell Biol.10：639-649）。因此，本文介绍人MDR1启动子的AP-1成分可能对由PKC激动剂刺激的MDR1表达起直接作用。
通过PKC-介导途径对MDR1基因表达的诱导作用可以解释以前的发现，即选择性地增加P-糖蛋白表达的多药物抗性细胞系常常会有高水平PKC（Aquino等人，1990，Cancer Commun.2：243-247;Fine等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：582-586;O′Brian等人，1989，FEBS Lett.246：78-82;Posada等人，1989，Cancer Commun.1：285-292）。据推测，PKC活性增加，可以代表在该细胞系的选择期间，对MDR1基因表达增加负责的早期结果。然而，该解释不能排除由PKC诱导的磷酸化作用可以更进一步提高P-糖蛋白的活性。该后一假设以Yu等人（Cancer Commun.3：181-189）的研究中找到证据，他们发现，MCF-7细胞（以异源启动子转录的MDR1 cDNA转染后获得）的多药物抗性亚系中，药物抗性的水平可以因引入表达高水平PKC2载体而增加。在该PKC2转染体中抗性增加伴随着P-糖蛋白磷酸化作用增加，而不明显改变其表达水平。
PKC在与不同适应、增殖及分化过程相关的各种信号转导途径中起中心作用。即使已发现PKC激动素诱导MDR1在正常和肿瘤造血细胞中的表达，但也可使用通过PKC介导途径起作用的造血生长因子，却没得到同样结果。而且，PKC激动剂不仅诱导MDR1在造血源细胞系中的表达，也诱导在上皮源细胞系中的表达，这表明MDR1表达的PKC介导调节作用可以起一般的生理作用。
PKC介导机理已连系到受UV射线或烷基化试剂损害的DNA的转录应答（Kaina等人，1989，In M.W.Lambert and J.Laval（Ed.），DNA Repair Mechanism and Their Bialogical Implication in Mammalian Cells，Plenum Press，New York;Papathanasiou and Fornace，1991，PP.13-36 In R.F.Ozols（Ed.），Molecular and Clinical Advances in Anticancer Drug Resistance，Kluwer Academic Pullishers，Boston，MA）。PKC激活也关联到对其它细胞毒性药物例如胞嘧啶阿糖苷（Kharbanda等人，1991，Biochemistry 30：7947-7952）或阿霉素（Posada等人，1989，Cuncer Res.49：6634-6639）的细胞反应。因此，PKC介导的MDR1表达的诱导作用，可能是对不同类型的细胞损害（包括由细胞毒性化疗药物引起的损害）产生的一般应激反应的一部分。
事实上，本发明公开了MDR1在人白血病和实体肿瘤衍生细胞系中的表达，可由短期暴露于癌症化疗使用的各种细胞毒性药物而诱导（见下面实施例2）。MDR1在RNA水平及蛋白质水平的诱导，可在以P-糖蛋白输送剂（阿霉素、柔红霉素、长春碱、鬼臼乙叉甙）治疗的或不由P-糖蛋白输送的化疗药物（Ara-C，氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、苯丁酸氮芥、顺铂、羟基脲）治疗的细胞亚群体中观察到。因为MDR1表达不提供对第二组药物的抗性，并且因为MDR1诱导可在短时间暴露于药物后产生（在许多病例中短于一代细胞繁殖时间），这些发现表明表达MDR1细胞的细胞毒性选择可能并未造成观察到的MDR1表达的增加。在可见的细胞损伤同时，MDR1诱导即变得可检查，这表明它很可能是该损伤的间接结果，而不是对特异试剂的直接反应。
更为重要的是，以细胞毒性药物治疗诱导的MDR1表达在撤去药物之后并不消失，而在无药物培养基中培养的细胞内可维持至少几个星期。在无药物条件下生长的P-糖蛋白阳性细胞表明在其分化方面无明显变化。因此，药物诱导的MDR1表达是一种稳定现象，它并不限于死亡或终止分化的细胞。除了增加MDR1表达外，药物处理的细胞也表现出对长春碱（一种P-糖蛋白输送药物）的抗性提高2-3倍，该抗性特别与表达MDR1的细胞相关。此外，药物处理细胞也表现出对苯丁酸氮芥（一种不由P-糖蛋白输送的化疗药物）的抗性有所增加。后一发现表明，在以细胞毒性药物治疗之后，某些其它临床相关的药物抗性机理可与MDR1表达共同被诱导出来。
综上述，这些发现表明以癌症化疗使用的各种药物治疗人肿瘤细胞，可以直接诱导MDR1表达，而并不通过选择予先存在的遗传变种来实现（正如以前人们所误信的）。在多药物抗性方面产生的增加是稳定的，并足以降低体外及体内对化疗药物的反应。药物介导的MDR1表达的诱导作用似乎是很可能出现在癌症化疗期间，并且至少部分可以解释在药物治疗人肿瘤中所观察到的MDR1表达增加的发生率。因此本发明提供了在临床相关条件下MDR1诱导作用的第一份材料，并指出PKC在该诱导作用中起中心作用。这后一假定提供了通过PKC抑制作用避免癌症化疗期间MDR1诱导的化疗法的基础。
使用蛋白激酶抑制剂避免MDR1诱导
本发明证明蛋白激酶抑制剂，特别是有抗PKC活性的抑制剂，能阻止诱导MDR1基因在肿瘤细胞中表达。例如，Staurosporine，一种有效的但非选择性的PKC抑制剂（Rüegg and Burgess，1989，Trends Pharmac.Sci.10：218-220），能阻止以TPA，二酰基甘油及许多化疗细胞毒性药物，包括Ara-C，长春碱，氨甲蝶呤和阿霉素治疗的P-糖蛋白阴性细胞中的MDR1诱导。另一种蛋白激酶抑制剂，H7也能阻止由化疗药品产生的MDR1诱导。这些发现提供了PKC可与参与该诱导作用的证据，并提供使用蛋白激酶抑制剂抑制MDR1基因表达的可能性。而且，观察到化疗药品诱导肿瘤细胞中对不由P-糖蛋白输送的至少一种药物的抗性，暗示通过化疗药物治疗，其它产生药物抗性的途径可与MDR1表达被共诱导，并且产生在肿瘤细胞中使用蛋白激酶抑制剂抑制出现药物抗性的种种机制，而不只是MDR1的诱导。
然而在某些P-糖蛋白阳性细胞系中，当单独使用Staurosporine时，显著地增加P-糖蛋白的表达，应当注意到，Staurosporine是P-糖蛋白抑制剂，可以直接与P-糖蛋白结合（Sato等人，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.173：1252-1257）。此外，两种其它的P-糖蛋白结合化合物、环链菌素A和异博停（也称作PKC抑制剂），在某些P-糖蛋白阳性细胞系中也增加P-糖蛋白的表达。因此可以相信，这些药剂及Staurosporine是通过一个共同的，现在还未知的机理来起作用。这些结果说明，将蛋白激酶抑制剂用于P-糖蛋白阴性或接近阴性肿瘤中来避免增加MDR1，比用于大部分肿瘤细胞中已表达P-糖蛋白的肿瘤中可能更为有效。然而，应当注意到，Staurosporine只在少数造血细胞系中增加P-糖蛋白表达这一发现，不表示由PKC抑制剂产生的P-糖蛋白表达增加是P-糖蛋白阳性肿瘤细胞的一般性质，并且也不表明患P-糖蛋白阳性肿瘤的病人，不可能从使用蛋白激酶抑制剂避免肿瘤细胞中进一步由药物诱导的多药物抗性而受益。
P-糖蛋白阴性实体肿瘤或白血病可通过患者的肿瘤的活检材料，手术或血液学样品，使用本领域已知技术来分析，而加以鉴定（Roninson（Ed.），1991，Molewlar and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells，Plenum Press，New York）。这些技术包括（但不限于）以P-糖蛋白特异性抗体进行免疫细胞化学、免疫组织化学或免疫萤光检测，以P-糖蛋白输送萤光染料进行活力染色;Northern点印迹或以MDR1-特异性核酸探针进行狭线印迹杂交;或MDR1 mRNA的cDNA-PCR分析等。上面检测的某些操作例如在下面实施例1和2中加以介绍。应当指出某些以蛋白或功能检测为基础看似P-糖蛋白阴性的细胞系，仍然可显示出由cDNA-PCR检测出的MDR1 mRNA（见表1）。这表明以蛋白或功能为基础的检测，作为鉴定可能从使用蛋白酶抑制剂受益的肿瘤的主要标准是较好的。此外，cDNA-PCR或其它测定MDR1 mRNA的方法都可以使用，但同时要清楚MDR1在K562细胞的水平或稍高（例如2倍）水平表达仍可能是P-糖蛋白阴性肿瘤的表征。
因为本文中试验的蛋白酶抑制剂，在其抑制活性上是非选择性的，即它们的作用不是对PKC特异性的，本文所介绍的研究提供了证据：它们抑制PKC活性的能力可能是阻止MDR1诱导的关键因素。例如，两种有效的PKC抑制剂，Staurosporine和H9能抑制由细胞毒性药物产生的MDR1诱导作用。相反的，HA1004，一种无抗PKC活性的蛋白激酶抑制剂，表明对阻止MDR1诱导完全无效。因此，任何能抑制PKC的蛋白激酶抑制剂，不管其是否对PKC具特异性，都对避免肿瘤细胞中MDR1的诱导极有可能是有用的。
因此，任何能阻止化疗药物对MDR1产生诱导的蛋白激酶催化剂（正如由下述实施例1所介绍的任何方法所测定的，例如萤光染料沉积、MDR1 mRNA的cDNA-PCR或以P-糖蛋白特异性抗体染色）都可用在本发明方法的实践中。该抑制剂可在患实体肿瘤或白血病的癌症病人进行化疗药物治疗之前或同时给药。任何普通用于癌症化疗的抗癌药物都包括在本发明范围内，包括（但不限于）Ara-C、阿霉素、柔红霉素、长春碱、鬼臼乙叉甙、氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶苯丁酸氮芥、顺铂及羟基脲。
对很多能抑制PKC的化合物进行过体内体外的癌症化疗中可能的应用研究。然而，应当注意到，当发现这样的化合物对于与正常细胞有关的肿瘤表现出选择性生长抑制作用时（Powis and Kozikowski，1991，Clin Biochem.24：385-397;Grunicke等，1989，Adv.Enzyme Regul.28：201-216），它们并不见得显示或意味着能避免MDR1在癌细胞中的表达。体外研究表明，与其PKC抑制活性剂量大约相同的剂量可出现PKC抑制剂的抗增殖效果（Grunicke等人，1989，Adv.Enzyme Regul.28：201-216）。体内实验的化合物包括Staurosporine及其苯甲酰基衍生物CGP41 251，发现它们在裸鼠中以其最大耐受剂量（MTD）的1/10处表现出抗肿瘤效果（MTD Staurosporine是1mg/Kg，而CGP41 251是250mg/Kg）（Meyer等人，1989，Int.J.Cancer 43：851-856），在体内表现出有抗肿瘤活性的其它Staurosporine类似物包括UCN-01（Takahashi等人，1987，J.Antibiot.40：1782-1784）和8-N-（二乙基氨基乙基）rebeccamycin.（BMY 27557）（Schurig等人，1990，Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.31：Abs 2469）。后一化合物腹腔内给药的优选剂量在12mg/Kg/注射每日×9至64mg/Kg单剂量范围内。另一组经研究的PKC有效抑制剂作为抗癌剂用包括醚脂类似物，包括十六烷基磷酸胆碱，ET-18-OCH3，ilmfosine，SRI62-834及BM41440（Powis和Kozikowski，1991，Clin Biochem.24：385-397;Grunicke等人，1989，Adv.Enzyme Regul.28：201-216）。这些药剂中的某些已用于临床试验中。在这些试验中口服的MTD值ilmofosine是200mg/每天（Berdel等人，1988，Proc.Amer.Cancer Res 29：Abs.2050），而BM41440是5mg/Kg体重（Herrmann等人，1987，Lipids 22：962-966）。
十六烷基磷酸胆碱也局部用于乳房癌的皮肤转移治疗上，剂量范围0.2-38.5g/每个病人，施用3-128周（Unger等人，1990，Cancer Treat Rev.17：243-246）。这组化合物也被试验用作自体骨髓移植的泻剂（Vogler等人，1991，Exp.Hematol，99：557Abs.）。另一种PKC抑制剂、苏拉明，已用于寄生虫病，并正对其用作抗肿瘤剂的临床试验作出评估。将苏拉明连续输注，其速度为14天，结束时达到峰值300μg/ml，表明对激素不应的前列腺癌有活性（Meyer等人，1992，J.Clin.Oncol.10：875-877）。另一类PKC抑制剂之一，类黄酮栎皮酮、当按20mg/Kg剂量经腹腔内给裸鼠施用时，表明能提高顺铂的抗肿瘤效力，是一种不由P-糖蛋白输送的药物，（Grunicke等人，1989，Adv.Enzyme Regul.28：201-216）。
虽然除了下面实例1和2所述Staurosporine外，上面的化合物还没有一种被试验过避免由细胞毒性药物引起的MDR1诱导的能力，但从本发明公开的结果很有力地表明它们很可能具有这样的作用，因为它们所有的均能抑制PKC。有关这些以及其它PKC抑制剂的动物体内及临床试验数据的可用性使本领域专业人员可将这些化合物与常规的抗癌药物结合使用，从而避免化疗期间出现多药物抗性。这些化合物可在化疗药物治疗之前和/或同时施与癌症患者，其剂量范围为约1-250mg/Kg体重，采用反复注射/连续输注或局部治疗。
此外，可以研制体外检测技术，以便快速鉴别能阻止由化疗药物引起的诱导MDR1基因表达的任何化合物。例如，可将H-9或K562白血病细胞系，在暴露于调节组织培养条件下的10μM Ara-C，200ng/ml阿霉素，200ng/ml氨甲蝶呤或40ng/ml长春碱10-36小时（虽然超过1小时的任何培养时间均可，见图2B）之前，用试验化合物处理约30分钟，然后与对照样比较，评价该化合物阻止由药物产生的MDR1诱导的能力。由此种检测法鉴定出能阻止化疗药物诱导MDR1的化合物，不一定是蛋白激酶抑制剂，但可以按与蛋白激酶抑制剂相同的方式用于患者治疗中。
实施例1
蛋白激酶抑制剂阻止正常细胞和肿瘤细胞中蛋白激酶C
激动剂介导的MDR1诱导
1.1材料与方法
1.1.1细胞系及药物处理
正常人PBL是在征得同意后通过静脉穿刺从健康自愿受试者获得、然后在Histopaque-1077（Sigma，St.Louis，MO）上经密度梯度离心将低密度单核细胞分离。KG1细胞系保持在加有20%胎牛血清（FCS）和2mM L-谷氨酰胺，100单位/ml青霉素及100μg/ml链霉素的Iscove′s modifaed Dulbecco培养基中（GIBCO Lab.，Grand Island，NY）。MCF-7，EJ，KB-3-1，Hela及HT-1080细胞系保持在加有10%FCS和2mM L-谷氨酰胺，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMTM中。所有其它细胞系保持在加有10%FCS和2mM L-谷氨酰胺，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI培养基中。
在二甲基亚砜（DMSO）中配制含100μg/ml TPA（Sigma，St.Louis，MO）和30mM 1，2-二辛基酰基甘油（DOG或DiCg）（Molecular Probes，Eugene，OR）的原液，贮存于-30℃。以DMSO溶液作对照实验证明DMSO对P-糖蛋白的功能及表达均无影响。用不同浓度的TPA处理不同细胞系，取决于所观察到的细胞毒性。PBL用1ng/ml TPA处理，H9和K562细胞用10ng/ml处理，KG1a和KG1细胞以100ng/ml处理而其它的细胞用10μg/ml处理。同样不同浓度的DOG用于处理不同的细胞系。这样PBL用75μM DOG处理，而H9和K562细胞用二份75μM剂量DOG（间隔2小时）处理。流式细胞计数分析或RNA提取以前将细胞暴露于TPA或DOG8-12小时。Staurosporine（Sigma，St.Louis，MO）以100mM浓度用于KG1a细胞，而以30mM浓度处理其它细胞;在加入TPA或DOG以前30分钟将其加入。
1.1.2流式细胞计数检测
以若丹明123（Rh123）积累试验来检测P-糖蛋白活性。在该检测中，将经药物处理或未经处理的细胞洗涤三次，在含100ng/ml Rh123（Sigma，St.Louis，MO）的培养基中将其于37℃保温1.5-2小时。然后洗涤细胞，以Propidium iodide（PI）染色并置于冰中直至分析中。将单层生长的细胞以磷酸盐缓冲盐水（PBS）（PH7.4）中的20mM亚乙基-二氧基四乙酸（Sigma）悬浮，并于Rh123染色前洗涤3次。在某些实验中使用Rh123流出物检测（Chaudhary and Roninson，1991，Cell 66：85-94）而不是Rh123积累。
利用P-糖蛋白特异性的小鼠IgG2a单克隆抗体（mAB）UIC2来分析P-糖蛋白在细胞表面的表达（Mechetner and Roninson，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5824-5828）与鼠IgG2a同型对照抗体从Sigma公司得到。在以UIC2mAB或同型对照物染色PBL时，于4℃，以10μg抗体染色106个细胞30分钟，并且洗涤二次以后以10μg FITC结合的山羊抗小鼠IgG2a抗体（Fisher Scientific，Fairlann，NJ）染色30分钟，用PBS加2%FCS按1∶2加以稀释。用冰冷却的PBS加2%FCS将细胞洗涤2次，以PI染色并于冰上保温至直分析用。染色其它类型的细胞基本上使用同样方法，除了每106个细胞使用2μg第二种抗体这点不用。在某些实验中，使用藻赤藓素（PE）结合的山羊抗鼠IgG2a作为第二种抗体，这种情况下不加入PI。流式细胞计数分析在Coulter Epics 753流式细胞计数器上进行。
1.1.3 RNA提取和cDNA-PCR分析
采用小规模十二烷基磺酸钠提取法（Peppel and Baglioni，1990，Bio Techniques 9：711-713）从约106个细胞中提取RNA。MDR1和β2-微球蛋白cDNA序列的cDNA合成聚合酶链反应（PCR）扩增基本上按文献记载进行（Noonan等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：7160-7164;Noonan和Roninson，1991，PP.319-333 In Roninson（Ed.），Melecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells，Plenum Press，New York），同时进行如下改进：（ⅰ）在最初加热样品到94℃之后将Taq DNA聚合酶加入到PCR混合物中。（ⅱ）为计算出在经过不同类型处理的细胞中，不同RNA的退化，将28个PCR循环之后获得的β2-微球蛋白带产率作为使不同制剂中cDNA模板起始量均衡的主要标准。用放射自显影照相法检测32P标记的PCR产物。
1.2实施例详述
使用功能性检测法来检测以能诱导淋巴样分化或激活的不同药剂处理人PBL时，P-糖蛋白活性的改变，该法基于流式细胞计数分析Rh123（一种P-糖蛋白输送的萤光线粒体染料）的细胞积累量。在该检测中，表达很少或无P-糖蛋白表达的细胞被Rh123染成很鲜亮的颜色，而具较高水平P-糖蛋白活性的细胞呈现Rh123暗淡色。以钙离子载体A23187、IL-12或IL-2处理的细胞没观察到对P-糖蛋白有明显影响。相反，用佛波醇酯TPA处理PBL则引起Rh123暗淡细胞数显著增加。加入30μM异博停（一种P-糖蛋白抑制剂）即可阻止Rh123暗淡色群体的增加。因为已清楚了解TPA的细胞作用是刺激PKC，由此也试验是否DOG（一种细胞通透性二酰基甘油及PKC的生理刺激剂）对PBL中Rh123沉积也有影响。用DOG处理PBL也能降低由PBL产生的Rh123积累。
为确定是否所观察到的PKC刺激剂对P-糖蛋白活性的影响是由于P-糖蛋白表达增加的结果，以单克隆抗体UIC2（识别由人MDR1基因编码的P-糖蛋白细胞外抗原基）间接标记免疫萤光法染色未经处理的PBL及以TPA处理的PBL。以TPA处理过的明显地增加细胞表面的P-糖蛋白水平。如用聚合酶链反应（PCR）扩增MDR1 cDNA序列来对检测的那样，该P-糖蛋白的增加伴随着TPA处理的PBL总群体中MDR1 mRNA水平相应增加。因此TPA诱导的P-糖蛋白活性的增加，至少部分是由于在RNA水平及蛋白水平MDR1基因表达被激活的缘故。
因为PBL包含许多不同亚型的异源导体，因此将一系列白血病衍生克隆细胞系进行试验，测定其以TPA处理后的P-糖蛋白表达的变化。如表1中所归纳的，在以TPA处理以前所有P-糖蛋白阳性的细胞系表现出在暴露于TPA之任其P-糖蛋白表达大大增加。该类细胞包括人KG1及KG1a干细胞，像白血病细胞系，其相对高水平的P-糖蛋白很可能反映出该蛋白在正常造血干细胞中的表达（Chaudhary and Roninson，1991，Cell，66：85-94），这类细胞还包括鼠EL4胸腺瘤和LBRM33胸腺瘤细胞系。
表1.TPA对MDR1表达的影响
细胞系 未处理的 TPA 检测
处理的
正常细胞
PBL + ++ F,A,R
人造血细胞系
KG1(急性骨髓性白血病) ++ +++ F,A
KG1a(急性骨髓性白血病) ++ +++ F,A
K562(慢性骨髓性白血病) - ++ F,A,R
H9(T细胞白血病) - ++ F,A,R
HL-60(早幼粒细胞白血病) - - F
THP-1(早幼粒细胞白血病) - - F
Jurkat,克隆E6-1(T细胞白血病) - - F
Molt-4(T细胞白血病) - - F
U937(组织细胞淋巴瘤) - - F
表1(续).TPA对MDR1表达的影响
细胞系 未处理的 TPA 检测
处理的
鼠造血细胞系
KL4(胸腺瘤) ++ +++ F
LBRM 33,clone 4A2(淋巴瘤) + ++ F
人实体肿瘤细胞系
EJ(膀胱癌) + ++ F
MCF-7(乳癌) - - R
HeLa(宫颈癌) - - F,R
KB-3-1(Hela亚系) - - F,R
HT 1080(纤维肉瘤) - - F,R
在表1中，MDR1表达由Rh123积累的功能检测（F），UIC2抗体染色（A）或cDNA-PCR检测MDR1 mRNA（R）来评价，并且表示为相对值。由Rh123或UIC2染色检测如果没有可检测出的P-糖蛋白表达，并且其MDR1 mRNA水平不高于KB-3-1细胞的该值，那么认为该细胞为阴性。
在无可检测出的P-糖蛋白表达的细胞系中，H9和K562白血病细胞系已明显表现出由TPA或DOG诱导MDR1 mRNA及P-糖蛋白。流式细胞计数分析表明以TPA或DOG处理这些细胞系便出现表达P-糖蛋白的主要细胞群体（图1）。这些变化伴随着TPA或DOG处理的细胞中，稳定状态的MDR1 mRNA水平的提高（图2A，B）。正如图2B表明，MDR1 mRNA在加TPA后2小时于H9细胞中变得可检测，并，继续增加直至至少5小时点为止，这表明对TPA反应很快，与这些细胞中由TPA引起MDR1转录激活的可能性一致。
TPA处理后MDR1表达增加并不只限于造血细胞，在某些实体癌衍生的细胞系中也观察到，包括表达低水平P-糖蛋白的EJ膀胱癌细胞，以及无TPA处理时MDR1表达检测不出的MCF-7乳房癌细胞（图2C）。如表1中所归纳的，大部分试验的P-糖蛋白阴性细胞系在TPA处理后表现出不诱导MDR1表达。然而应当指示，这些细胞系代以TPA浓度的反应能力。
为试图抵消由PKC激动剂引起的MDR1基因表达的诱导作用，用一种有效的蛋白激酶抑制剂Staurosporine处理各细胞系。出乎意料的是，Staurosporine单独引起P-糖蛋白已呈阳性的细胞系（KG1，KG1a，鼠EL4和LBRM33细胞系）中P-糖蛋白表达明显增加。两种其它化合物环孢菌素A和异博停（是已知的P-糖蛋白抑制剂及PKC抑制剂）也发现增加P-糖蛋白表达和/或KG1和EL4细胞中染料流出物。PKC抑制剂在P-糖蛋白阳性细胞系中对P-糖蛋白表达的该作用，使得很能分析这样一些细胞系中Staurosporine和PKC激动剂之间的相互作用。但是Staurosporine不诱导MDR1在P-糖蛋白阴性的H9细胞中表达。用TPA或DOG处理前30分钟，加入Staurosporine到H9细胞中，则完全消除了由这些药剂引起的MDR1诱导，正如流式细胞计数（图1）和cDNA-PCR检测（图2A）所证明的。Staurosporine也抑制正常细胞中TPA和DOG的作用。
实施例2
蛋白激酶抑制剂阻止肿瘤细胞中细胞毒性
药物介导的MDR1诱导作用
2.1 材料和方法
2.1.1 流式细胞计数分析
用加有10%胎牛血清的5ml DMEM中的100ng/ml Rh123或10ng/ml DiOC2（3）于37℃将K562细胞染色10分钟。洗涤2次后，于37℃，在5ml无染料介质中使细胞流出染料3小时（对Rh123来说）或2小时（对DiOC2（3）来说），正如已有文献所记载的（Chaudhary and Roninson，1991，Cell，66：85-94）。在双标记实验中，用5ml介质中的3ng/ml DiOC2（3）染色。每种流出试验均分别在存在30μM异博停及不存在异博停的情况下进行。KG1细胞于37℃用5ml介质中的100ng/ml Rh123染色3小时，并于无流出物情况下分析。间接免疫萤光标记（Chaudhary and Roninson，1991，Cell，66：85-94），是每2×106个细胞使用2μg一级抗体（UIC2或鼠IgG2a同型对照物，购自Sigma公司）及10μg二级抗体（羊抗小鼠IgG PE-结合的F[ab′]z片断（Sigma））来完成的。对KG1细胞系来说每2×106个细胞使用1μg二级抗体。流式细胞计数分析及流式分类术按文献记载进行（Chaudhary and Roninson，1991，Cell，66：85-94）;非活力细胞根据其非正常体积或颗粒度，或者在不使用藻赤鲜素的实验中通过propidium iodide积累来从分析中排出。
2.1.2 生长抑制作用检测
按每孔3000细胞将细胞铺敷于96孔微滴平板上（同时制两份相同试样），并使其在提高浓度的各药物中生长。细胞生长7-10天后由MTT检测法加以分析（PauWels等人，1988，J.Virol.Meth.20：309-321）。
2.2 实施例详述
前述实施例1中研究证明PKC激动剂能诱导MDR1表达，表明PKC在激活肿瘤细胞中多药物抗性反应中起重要作用。PKC也影响对不同类型细胞应激的细胞反应（Papathanasiou and Fornace，1991，PP.13-36 In R.F.Ozols（Ed.），Molecular and Clinical Advances in Anticancer Drug Resistance，Kluwer Academic Publishers，Boston，MA）。尤其是PKC由以1-β-D-阿糖胞苷（Ara-C），一种有效的抗白血病药物治疗而激活（Kharbanda等人，1991，Biochemistry，30：7947-7952）。因此，进行实验以试验是否Ara-C（它不由P-糖蛋白输送）在K562白血病细胞中对P-糖蛋白功能具任何作用。正如图3a所示，K562细胞暴露于Ara-C12-72小时，导致3-17%活细胞亚群体出现（由若丹明-123（Rh123）流出表现出）。Rh123流出对P-糖蛋白制剂异博停是敏感的。Rh123暗淡色细胞的出现伴随Ara-C处理K562细胞中，关系到β2-微球蛋白的MDR1 mRNA表达的剂量依赖性增加，正如由cDNA序列的聚合酶链反应扩增所检测的结果所示（图4a）。
也试验其它许多化疗药物对诱导MDR1在K562细胞中的表达之能力。发现阿霉素、柔红霉素、长春碱、鬼臼乙叉甙、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、苯丁酸氮芥、顺铂及羟基脲所有均能诱导MDR1 mRNA表达（图4b），及Rh123或DiOC2（3）（另一种P-糖蛋白输送染料，Chaudhary and Roninson，1991，Cell，66：85-94）以3-10%经处理的细胞量流出（图3a）。而这些药物仅有前4种是由P-糖蛋白输送的（Roninson（Ed.），1991，Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells，Plenum Press，New York）。将以上结果与MDR1诱导仅需短时间药物暴露这一事实结合起来，表明表达MDR1细胞的细胞毒性选择作用并不对P-糖蛋白阳性亚群体的出现负主要责任。
细胞毒性药物诱导MDR1表达的能力并不只限于K562细胞。Ara-C提高P-糖蛋白在KG1白血病细胞（它在药物处理以前含相当多该蛋白）中的表达，正如由Rh123积累或单克隆抗体UIC2免疫活性所示（图3a）。Ara-C也激活MDR1 mRNA在H9 T细胞白血病（图5）KB-3-1表皮样癌（图4C），及EJ膀胱癌细胞（图4d）中的表达，尽管在这些癌细胞系中诱导的幅度较低些。此外，MDR1在以阿霉素、长春碱及氨甲蝶呤处理的H9细胞系中被诱导（图5），并在以阿霉素处理的KB-3-1细胞中被诱导（图4C）。但在以上述同样药剂处理的HL60白血病细胞中未检测出P-糖蛋白诱导作用。在所有情况下，在可见性细胞损伤的同时诱导作用便变得可检测出，所谓可见性细胞损伤表现为细胞肿大，颗粒性增加，细胞形状改变以及生长受到抑制（图4A）。此外，在不存在药物时，某些细胞系连续传代几个月，也能导致MDR1表达少量增加，这是因为未处理细胞中基本MDR1 mRNA水平的可变性所致。
接着，试验细胞毒性处理之后药物诱导的MDR1表达是否保持下来，为此，用细胞毒性浓性的Ara-C，阿霉素，苯丁酸氮芥或氨甲蝶呤处理K562细胞3-5天，然后使其在无药物条件下生长。通过染料流出及以UIC2标记的免疫萤光测试法（图3C）或通过cDNA-PCR扩增（图4e）法分析不同时间点时，存活细胞中MDR1的表达。在经处理的细胞亚群体中MDR1的表达在药物除去后至少保持几个星期（在Ara-C处理群体中高达11星期）。P-糖蛋白阳性的K562细胞在其大小，颗粒性及分化相关的抗原标记表达方面均无明显变化。以长春碱、P-糖蛋白底物进行的生长抑制检测，也证明除去Ara-C或阿霉素之后六星期仍存在多药物抗性细胞。以ID10值增加约2-3倍为特征的长春碱抗性，特别关联到细胞的Rh123暗淡色亚群体（图6）。因此，药物处理导致MDR1表达的持续诱导以及在经处理细胞的亚群体中引起其相关的药物抗性。并且也发现，对苯丁酸氮芥（一种不由P-糖蛋白输送的化疗烷基化药剂）的细胞毒性作用的抗性，经Ara-C和阿霉素处理的K562细胞比未处理过的细胞更高。该结果表明，以化疗药物治疗之后，临床相关药物抗性的其它途径或机理，可以与MDR1表达一起被共诱导出。
为测定PKC是否参与由细胞毒性药物引起的诱导作用，将两种KPC抑制剂，Staurosporine和H7用来阻滞H9细胞中的MDR1 mRNA诱导。该两化合物的加入阻滞了由Ara-C，阿霉素、氨甲蝶呤及长春碱引起的MDR1诱导，正如由cDNA-PCR（图5）及以Ara-C处理细胞进行的染料流出试验所检测出的。但使用ISO-H7，一种H7的结构类似物，对蛋白激酶的作用要弱10倍，未观察到明显的抑制作用（Pelosin等人，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.169：1040-1048）。用Ara-C处理K562细胞也观察到相似结果。为研究对PKC所起抑制作用的特异性，将提高剂量的H7（对PKC IC50＝40μM，对蛋白激酶A为2.3μM）和HA1004，一种非PKC特异性蛋白激酶抑制剂（对PKC IC50＝40μM，对蛋白激酶A为2.3μM）（Hidaka等人，1984，Biochemistry，23：5036-5041）二者的效果进行比较，正如图5a所示，H7抑制由Ara-C引起的MDR1诱导所用浓度为10μM或较高，但HA1004即使用60μM也显示无明显的抑制作用。这些结果与细胞毒性药物引起MDR1诱导时PKC所起作用是一致的。
本文所提供的数据证明，各种化疗药物，包括不由P-糖蛋白输送的那些药物，均可直接诱导MDR1表达，而并不是通过选择预存在的基因变种来实现的。药物诱导的MDR1表达局限于经处理的细胞亚群体，并伴随P-糖蛋白输送药物的抗性适度增加（K562的情况下约2-3倍）。这种增加足以降低体内对化疗的反应，并提高具较高水平药物抗性的基因突变体的选择。药物介导的MDR1表达诱导作用可出现于癌症化疗期间，并很可能计算出经治疗的肿瘤中增加MDR1表达的出现率。因此，PKC抑制剂可阻止MDR1诱导作用这一事实表明，在癌症化疗中将此类药剂与细胞毒性药物结合使用，以达到高水平治愈癌细胞的可能性。
本发明并不受例举的实施方案范围所限，这些方案只不过试图作为本发明各方面的详细说明用。实际上，从前面的描述及所附各图，除本文所表明以及新介绍之外的本发明的各种修改，对本领域技术人员来说都是显而易见的。这类修改都势必落入所附权利要求范围之中。
本文所摘引的所有文献均全文引入本文作为参考。