使用含有弱化的aspA基因的肠细菌科 菌株制备L-氨基酸的方法 【发明领域】
本发明涉及使用肠细菌科菌株发酵制备L-氨基酸、尤其L-苏氨酸的方法，所用菌株中aspA基因被弱化。
现有技术
L-氨基酸、特别是L-苏氨酸用于人用药物和制药工业，食品工业，特别是动物营养。
已知氨基酸可通过肠细菌科、尤其大肠杆菌和粘质沙雷氏菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或例如通过离子交换层析对产物形式的加工方法，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物例如苏氨酸类似物α-氨基-β一羟戊酸(AHV)有抗性或对调节重要的代谢物是营养缺陷的并产生L-氨基酸例如L-苏氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于改良肠细菌科菌株生产L-氨基酸的能力，通过扩增各个氨基酸生物合成基因并研究对生产的作用而进行。
发明目的
本发明的目的是为改良发酵生产L-氨基酸、尤其L-苏氨酸提供新措施。
发明概述
本发明提供了一种使用肠细菌科微生物发酵生产L-氨基酸、尤其L-苏氨酸的方法，所用微生物是尤其已经生产L-氨基酸而且其中编码aspA基因的核苷酸序列被弱化的微生物。
发明的详细描述
当下文提及L-氨基酸时，应理解其意味着选自以下的一或多种氨基酸，包括包括它们的盐：L-天冬氨酸，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，和L-精氨酸。优选是L-苏氨酸。
文中术语“弱化”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性的降低或消除，例如通过使用弱启动子或编码低活性相应酶的基因或等位基因，或失活相应基因或酶(蛋白质)，及组合使用这些方法。
通过弱化措施，相应蛋白质的活性或浓度一般降低至野生型蛋白质活性或浓度或者起始微生物中所述蛋白质活性或浓度的0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或0-5％。
所述方法包括进行以下步骤：
a)发酵肠细菌科微生物，所述微生物中aspA基因被弱化，
b)浓缩培养基或肠细菌科微生物细胞中的相应L-氨基酸；
c)分离所需L-氨基酸，任选地终产物中保留发酵液组分和/
或全部或部分生物量(＞0至100％)。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、任选地淀粉、任选地纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸。所述微生物是肠细菌科的代表菌，选自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏杆菌属(Erwinia)，普罗威登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属(Serratia)。优选埃希氏菌属和沙雷氏菌属。尤为提及的是埃希氏菌属中的大肠杆菌和沙雷氏菌属中的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。
埃希氏菌属尤其是大肠杆菌菌种中生产L-苏氨酸的合适菌株例如是：
大肠杆菌TF427
大肠杆菌H4578
大肠杆菌KY10935
大肠杆菌VNIIgenetika MG442
大肠杆菌VNIIgenetika M1
大肠杆菌VNIIgenetika 472T23
大肠杆菌BKIIM B-3996
大肠杆菌kat 13
大肠杆菌KCCM-10132
沙雷氏菌属尤其是粘质沙雷氏菌菌种中生产L-苏氨酸的合适菌株例如是：
粘质沙雷氏菌HNr21
粘质沙雷氏菌TLr156
粘质沙雷氏菌T2000。
肠细菌科生产L-苏氨酸的菌株优选具有选自以下的一或多种遗传学或表型特征：α-氨基-β-羟戊酸抗性，thialysine抗性，乙硫氨酸抗性，α-甲基丝氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，α-氨基丁酸抗性，疏螺旋体素抗性，利福平抗性，缬氨酸类似物如缬氨酸异羟肟酸(valinehydroxamate)抗性，嘌呤类似物如6-二甲基氨基嘌呤抗性，需要L-甲硫氨酸，任选地部分及可补偿地需要L-异亮氨酸，需要内消旋二氨基庚二酸(meso-diaminopimelic acid)，含苏氨酸的二肽的营养缺陷，L-苏氨酸抗性，L-高丝氨酸抗性，L-赖氨酸抗性，L-甲硫氨酸抗性，L-谷氨酸抗性，L-天冬氨酸抗性，L-亮氨酸抗性，L-苯丙氨酸抗性，L-丝氨酸抗性，L-半胱氨酸抗性，L-缬氨酸抗性，对氟丙酮酸的敏感性，缺陷的苏氨酸脱氢酶，任选地利用蔗糖的能力，苏氨酸操纵子增强，优选为反馈抗性形式的高丝氨酸脱氢酶I-天冬氨酸激酶I增强，高丝氨酸激酶增强，苏氨酸合酶增强，任选地为反馈抗性形式的天冬氨酸激酶增强，天冬氨酸半醛脱氢增强酶，任选地为反馈抗性形式的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶增强，磷酸烯醇丙酮酸合酶增强，转氢酶增强，RhtB基因产物增强，RhtC基因产物增强，YfiK基因产物增强，丙酮酸羧化酶增强，及乙酸形成弱化。
已经发现在弱化尤其消除aspA基因后，肠细菌科的微生物以改良方式生产L-氨基酸，尤其L-苏氨酸。
大肠杆菌基因的核苷酸序列属于现有技术，也可以在Blamer等公布的大肠杆菌基因组序列中发现(科学277：1453-1462(1997))。
aspA基因通过以下数据详细描述：
描述：天冬氨酸铵裂合酶(天冬氨酸酶)
EC No.4.3.1.1
参考文献：Takagi等，核酸研究13(6)：2063-2074(1985)；
Woods等，生物化学杂志237(2)：547-557(1986)；
Falzone等，生物化学27(26)：9089-9093(1988)；
Jayasekera等，生物化学36(30)：9145-9150(1997)；
登录号：AE000486。
所述核酸序列可见于国立医学图书馆的国立生物技术信息中心(NCBI)(Bethesda，MD，美国)，欧洲分子生物学实验室的核苷酸序列数据库(EMBL，Heidelberg，德国或Cambridge，UK)，或者日本DNA数据库(DDBJ，Mishima，日本)。
根据本发明，可以使用所提及的参考文献中描述的基因。得自遗传密码简并或由于中性功能“有义突变”所致的所述基因的等位基因也可以使用。
为实现弱化，例如可降低或消除基因的表达或酶蛋白的催化活性。两种措施可任选地组合。
可通过适当控制培养或通过遗传修饰(突变)用于基因表达的信号结构或者通过反义RNA技术而实现降低基因表达。用于基因表达的信号结构例如是阻遏基因、激活基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。本领域技术人员可在如下文献中发现此方面的信息，例如Jensen和Hammer(生物技术和生物工程58：191(1998))，Carrier和Keasling(生物技术进展15：58-64(1999))，Franch和Gerdes(微生物学通用观点3：159-164(2000)，及在已知的遗传学和分子生物学教科书如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，Georg Thieme Verlag，德国斯图加特，1995)，或Winnacker的教科书(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)。
导致酶蛋白催化活性的变化或降低的突变是现有技术中已知的，可提及的例如Qiu和Goodman的工作(生物化学杂志272：8611-8617(1997))，Yano等(美国科学院院报95：5511-5515(1998))，Wente和Schachmann(生物化学杂志266：20833-20839(1991))。综述可参见遗传学和分子生物学的已知教科书，如Hagemann的教科书(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
可能的突变是转换、颠换、插入和缺失。根据氨基酸置换对酶活性的影响，分别为“错义突变”或“无义突变”。在基因中插入或缺失至少一个碱基对导致“移码突变”，其结果是插入不正确的氨基酸或者翻译过早终止。如果由于突变的结果导致终止密码子在编码区形成，这也导致翻译过早终止。缺失几个密码子典型地导致酶活性的完全丧失。产生此类突变的指导属于现有技术并可在遗传学和分子生物学的已知教科书中找到，如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，Georg Thieme Verlag，德国斯图加特，1995)，Winnacker的教科书(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)或Hagemann的教科书(″普通遗传学″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
通过基因或等位基因置换可以在合适的菌株中掺入合适的突变，例如缺失突变。
一种常规方法是Hamilton等描述的方法(细菌学杂志171：4617-4622(1989))，借助于条件复制型pSC101衍生物pMAK705进行基因置换。也可以使用本领域所述其它方法，例如Martinez-Morales等(细菌学杂志181：1999，7143-7148)，或者Boyd等(细菌学杂志182：842-847(2000))。
也可以将特定基因中的突变或影响特定基因表达的突变通过接合或转导转移至各种菌株中。
除了aspA基因的弱化之外，增强已知苏氨酸生物合成途径一或多种酶、回补代谢的酶、或用于产生还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶或糖酵解的酶或PTS酶或硫代谢的酶，对于用肠细菌科菌种生产L一氨基酸尤其L-苏氨酸也可以是有益的。
术语“增强”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或用强启动子或编码高活性相应酶或蛋白质的基因，及任选地组合使用这些方法。
通过增强措施，尤其是过表达，相应蛋白质的活性或浓度基于野生型蛋白质或起始微生物中蛋白质的活性或浓度一般提高至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，最大1000％或2000％。
因此，例如选自以下的一或多种基因可以同时增强、尤其是过表达：
·编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子(US-A-4,278,765)
·谷氨酸棒杆菌的编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，
·编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(分子和普通遗传学231(2)：332-336(1992))，
·编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(基因31：279-283(1984))，
·编码转氢酶的pntA和pntB基因(欧洲生物化学杂志158：647-653(1986))，
·编码赋予高丝氨酸抗性的rhtB基因(EP-A-0994190)，
·编码苹果酸∶醌氧化还原酶的mqo基因(WO 02/06459)，
·赋予苏氨酸抗性的rhtC基因(EP-A-1013765)，
·谷氨酸棒杆菌的编码苏氨酸输出蛋白的thrE基因(WO01/92545)，
·编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因(核酸研究11∶5257-5266(1983)；基因23：199-209(1983))，
·编码DNA结合蛋白HLP-II的hns基因(分子和普通遗传学212：199-202(1988))，
·编码葡糖磷酸变位酶的pgm基因(细菌学杂志176：5847-5851(1994))，
·编码果糖二磷酸醛缩酶的fba基因(生物化学杂志257：529-534(1989))，
·编码磷酸转移酶系统PTS的磷酸组氨酸蛋白己糖磷酸转移酶的ptsHIcrr操纵子的ptsH基因，
·编码磷酸转移酶系统酶PTS的酶I的ptsHIcrr操纵子的ptsI基因，
·编码磷酸转移酶系统PTS的葡萄糖特异性IIA成分的ptsHIcrr操纵子的crr基因，
·编码葡萄糖特异性IIBC成分的ptsG基因(生物化学杂志261：16398-16403(1986))，
·编码亮氨酸调节子的调控物的lrp基因(生物化学杂志266：10768-10774(1991))，
·编码10Kd陪伴分子的mopB基因(生物化学杂志261：12414-12419(1986))，也称为groES，
·编码烷基氢过氧化物还原酶的小亚基的ahpCF操纵子的ahpC基因(美国科学院院报92：7617-7621(1995))，
·编码烷基氢过氧化物还原酶的大亚基的ahpCF操纵子的ahpF基因(美国科学院院报92：7617-7621(1995))，
·编码半胱氨酸合酶A的cysK基因(细菌学杂志170：3150-3157(1988))，
·编码cys调节子的调节物的cysB基因(生物化学杂志262：5999-6005(1987))，
·编码NADPH亚硫酸盐还原酶的黄素蛋白的cysJH操纵子的cysJ基因(生物化学杂志264：15796-15808(1989)，生物化学杂志264：15726-15737(1989))，
·编码NADPH亚硫酸盐还原酶的血蛋白的cysJH操纵子的cysI基因(生物化学杂志264：15796-15808(1989)，生物化学杂志264：15726-15737(1989))，
·编码腺苷酰硫酸盐还原酶的cysJH操纵子的cysH基因(生物化学杂志264：15796-15808(1989)，生物化学杂志264：15726-15737(1989))。
一般优选使用内源性基因。应理解“内源性基因”或“内源性核苷酸序列”意味着一个物种群中存在的基因或核苷酸序列。
为生产L-氨基酸、尤其是L-苏氨酸，除了弱化aspA基因之外，同时弱化、尤其是消除或降低选自以下的一或多种基因的表达也是有益的：
·编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因(细菌学杂志169：4716-4721(1987))，
·编码苹果酸脱氢酶的mdh基因(E.C.1.1.1.37)(微生物学案卷149：36-42(1987))，
·开放读框(orf)ytfA的基因产物(国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，美国，登录号AAC77179)，
·开放读框(orf)ytfP的基因产物(国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，美国，登录号AAC77180)，
·编码烯醇磷酸丙酮酸羧激酶的pckA基因(细菌学杂志172：7151-7156(1990))，
·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(核酸研究14(13)：5449-5460(1986))，
·编码异柠檬酸裂合酶的aceA基因(细菌学杂志170：4528-4536(1988))，
·编码磷酸转移酶系统的DgsA调节物的dgsA基因(生物科学，生物技术和生物化学59：256-261(1995))，也称为mlc基因，
·编码果糖阻抑物的fruR基因(分子和普通遗传学226：332-336(1991))，也称为cra基因，
·编码sigma3a因子的rpoS基因(WO 01/05939)，也称为katF基因，
·编码苹果酸合酶A的aceB基因(核酸研究16(19)：9342(1988))，
·编码异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的aceK基因(细菌学杂志，170(1)：89-97(1988))，
·编码sn-甘油-3-磷酸转运系统的周质结合蛋白的ugpB基因(分子生物学2(6)：767-775(1988))。
除aspA基因的弱化之外，消除非所需的二级反应对L-氨基酸尤其L-苏氨酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
根据本发明制备的微生物可在分批方法(分批培养)、或在补料分批法(补料法)或重复补料分批法(重复补料法)中培养。已知的培养法由Chmiel(生物方法技术学1，生物工程入门，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培养基必须以适当方式符合特定菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.，USA，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和任选地纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可单独或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。另外培养基还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中。上述起始物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在25℃～45℃，优选30℃～40℃，持续培养直至所需产物形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
L一氨基酸的分析方法可以通过如Speckman等(分析化学，30，(1958)，1190)所述阴离子交换层析，随后经茚三酮衍生化作用进行，或通过反相HPLC，如Lindroth等(分析化学51：1167-1174(1979))进行。
本发明的方法用于发酵生产L-氨基酸，例如L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-高丝氨酸和L-赖氨酸，尤其L-苏氨酸。
大肠杆菌K-12菌株DH5a/pMAK705的纯培养物于2000年9月8日，根据布达佩斯条约，保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)，保藏号DSM 13720。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。
从大肠杆菌中分离质粒DNA及所有的限制、Klenow处理和碱性磷酸酶处理方法，均如Sambrook等所述进行(分子克隆实验手册，1989，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.美国)。除非特别说明，大肠杆菌的转化方法根据Chung等所述方法进行(美国科学院院报86：2172-2175(1989))。
制备菌株和转化体的温育温度是37℃。在Hamilton等的基因置换方法中使用的温度是30℃和44℃。
实施例1：构建aspA基因的缺失突变体
使用聚合酶链反应(PCR)和合成寡核苷酸从大肠杆菌K12扩增位于aspA基因上游和下游的基因区域部分和aspA基因的5’和3’区域部分。根据aspA基因的核苷酸序列以及位于大肠杆菌K12MG1655上游和下游的序列(SEQ ID No.1，登录号AE000486和AE000487)，合成下述PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)：
aspA5’-1：5’-GCTGCATCAGCACGAAATTC-3’(SEQ ID No.3)
aspA5’-2：5’-CCATTACCATACCGCGAACA-3’(SEQ ID No.4)
aspA3’-1：5’-TGGCAGCAGAAGCAGGTCAG-3’(SEQ ID No.5)
aspA3’-2：5’-TAGTCCAGACCGCCAGCAAC-3’(SEQ ID No.6)
用于PCR的大肠杆菌染色体K12MG1655DNA根据厂商指导用“Qiagen Genomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，Germany)进行分离。在标准PCR条件下(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press)用Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL，Eggenstein，Germany)和所述特异性引物可以从aspA基因区域的5’区扩增出大小约650bp的DNA片段(称为aspA5’)，从aspA基因区域的3’区域扩增出大小约700bp的DNA片段(称为aspA3’)。将每一所述PCR产物根据厂商指导与载体pCR2.1-TOPO(TOPO TA克隆试剂盒，Invitrogen，Groningen，荷兰)连接，并转化进大肠杆菌菌株TOP10F’。在添加50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上进行携带质粒细胞的选择。在分离质粒DNA后，用限制酶XbaI和Ec1136II裂解载体pCR2.1-TOPOaspA3’。用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)在0.8％琼脂糖凝胶中分离aspA3’片段。分离质粒DNA后，用酶EcoRV和XbaI裂解载体pCR2.1-TOPOaspA5’，并与所分离的aspA3’片段连接。用连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5α，并在添加50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA后，通过用酶EcoRI，XbaI和HindIII对照裂解检测那些克隆有SEQ ID No.7所示突变DNA序列的质粒。其中的一个质粒命名为pCR2.1-TOPOΔaspA(＝pCR2.1-TOPOdeltaaspaA)。
实施例2置换载体pMAK705ΔaspA的构建
在用酶HindIII和XbaI裂解载体pCR2.1-TOPOΔaspA并在0.8％琼脂糖凝胶中分离后从中分离实施例所述的ΔaspA等位基因，并与用酶HindIII和XbaI消化的质粒pMAK705(Hamilton等，细菌学杂志171：4617-4622(1989))连接。将连接混合物转化进DH5α，在添加20μg/ml氯霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA并用酶HindIII和XbaI裂解后证实成功的克隆。由此形成的置换载体pMAK705ΔaspA(＝pMAK705deltaaspA)如图1所示。
实施例3大肠杆菌菌株MG442中aspA基因的位置特异性诱变
在美国专利4,278,765中描述了生产L一苏氨酸的大肠杆菌菌株MG442，该菌株保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，俄罗斯莫斯科)，保藏号CMIM B-1628。
为了用所述的质粒编码的缺失构建体置换染色体aspA基因，用质粒pMAK705ΔaspA转化MG442。用Hamilton等(细菌学杂志171：4617-4622(1989))所述方法进行基因置换，并使用如下寡核苷酸引物通过标准PCR方法验证(Innis et al.(1990)PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，Academic Press)：
aspA5’-1：5’-GCTGCATCAGCACGAAATTC-3’(SEQ ID No.3)
aspA3’-2：5’-TAGTCCAGACCGCCAGCAAC-3’(SEQ ID No.6)
在发生置换后，MG442含有如SEQ ID No.8所示的ΔaspA等位基因形式。所获得的菌株称为MG442ΔaspA。
实施例4用菌株MG442ΔaspA生产L一苏氨酸
在具有下列组成的基本培养基上培养MG442ΔaspA：3.5g/lNa
2HPO
4·2H
2O、1.5g/l KH
2PO
4、1g/l NH
4C1、0.1g/l MgSO
4·7H
2O、2g/l葡萄糖、20g/l琼脂。在100ml锥形瓶中所含的10ml分批培养物中检查L-苏氨酸的形成。为此，接种10ml具有如下组成的预培养培养基：2g/l酵母膏、10g/l(NH4)
2SO
4、1g/l KH
2PO
4、0.5g/lMgSO
4·7H
2O、15g/l CaCO
3、20g/l葡萄糖，在一购自Kuhner AG(Birsfelden，瑞士)的ESR温箱上在37℃和180rpm培养16小时。将250微升这一预培养物转接进10mi生产培养基(25g/l(NH4)
2SO
4、2g/l KH
2PO
4、1g/l MgSO
4·7H
2O、0.03g/l FeSO
4·7H
2O、0.018g/lMnSO
4·1H
2O、30g/l CaCO
3、20g/l葡萄糖)中，在37℃培养48小时。培养后用购自Dr.Lange(Dusseldorf，德国)的LP2W光度计在660nm测量波长测定培养悬液的光密度(OD)。
然后用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)，经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定无菌过滤的培养物上清中形成的L-苏氨酸的浓度。
实验结果示于表1。
表1
菌株 OD (660nm) L-苏氨酸 g/L
MG442 6.0 1.5
MG442ΔaspA 5.5 1.9
附图简述
图1：pMAK705ΔaspA(＝pMAK705deltaaspA)。
应理解长度数据是大约的数据，图中所采用的缩写和符号有如下含义：
cat：氯霉素抗性基因
rep-ts：质粒pSC101的温度敏感性复制起点
aspA5’：aspA基因的5’区域和上游区域的部分
aspA3’：aspA基因的3’区域和下游区域的部分
限制酶缩写具有如下含义：
EcoRI：来自大肠杆菌的限制性内切酶
HindIII：来自Haemophilus influenza的限制性内切酶
XbaI：来自Xanthomonas badrii的限制性内切酶
【序列表】
<110>德古萨股份公司
<120>使用含有弱化的aspA基因的肠细菌科菌株制备L-氨基酸的方法
<130>DEDEG0211
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2280
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<220>
<221>CDS
<222>(470)..(1951)
<223>aspA基因
<400>1
gctgcatcag cacgaaattc ttaaagccct ggttacgtac cagtgacata ccgataactg 60
acgtgaatat aaccagcacg agggtcagca atacccccaa tacatgggca acctgaataa 120
agaccgaaat cccaatatag acataaagga aaatggcaat aaaaggtaac cagcgcaaag 180
gtttctcctg taatagcagc cggttaaccc cggctacctg aatgggttgc gaatcgcgtt 240
tagcttatat tgtggtcatt agcaaaattt caagatgttt gcgcaactat ttttggtagt 300
aatcccaaag cggtgatcta tttcacaaat taataattaa ggggtaaaaa ccgacactta 360
aagtgatcca gattacggta gaaatcctca agcagcatat gatctcgggt attcggtcga 420
tgcaggggat aatcgtcggt cgaaaaacat tcgaaaccac atatattct gtg tgt tta 478
Met Cys Leu
1
aag caa atc att ggc agc ttg aaa aag aag gtt cac atg tca aac aac 526
Lys Gln Ile Ile Gly Ser Leu Lys Lys Lys Val His Met Ser Asn Asn
5 10 15
att cgt atc gaa gaa gat ctg ttg ggt acc agg gaa gtt cca gct gat 574
Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu Val Pro Ala Asp
20 25 30 35
gcc tac tat ggt gtt cac act ctg aga gcg att gaa aac ttc tat atc 622
Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg AIa Ile Glu Asn Phe Tyr Ile
40 45 50
agc aac aac aaa atc agt gat att cct gaa ttt gtt cgc ggt atg gta 670
Ser Asn Asn Lys Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val Arg Gly Met Val
55 60 65
atg gtt aaa aaa gcc gca gct atg gca aac aaa gag ctg caa acc att 718
Met Val Lys Lys AIa Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu Leu Gln Thr Ile
70 75 80
cct aaa agt gta gcg aat gcc atc att gcc gca tgt gat gaa gtc ctg 766
Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys Asp Glu Val Leu
85 90 95
aac aac gga aaa tgc atg gat cag ttc ccg gta gac gtc tac cag ggc 814
Asn Asn Gly Lys Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp Val Tyr Gln Gly
100 105 110 115
ggc gca ggt act tcc gta aac atg aac acc aac gaa gtg ctg gcc aat 862
Gly Ala Gly Thr Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu Val Leu Ala Asn
120 125 130
atc ggt ctg gaa ctg atg ggt cac caa aaa ggt gaa tat cag tac ctg 910
Ile Gly Leu Glu Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Leu
135 140 145
aac ccg aac gac cat gtt aac aaa tgt cag tcc act aac gac gcc tac 958
Asn Pro Asn Asp His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr Asn Asp Ala Tyr
150 155 160
ccg acc ggt ttc cgt atc gca gtt tac tct tcc ctg att aag ctg gta 1006
Pro Thr Gly Phe Arg Ile Ala Val Tyr Ser Ser Leu Ile Lys Leu Val
165 170 175
gat gcg att aac caa ctg cgt gaa ggc ttt gaa cgt aaa gct gtc gaa 1054
Asp Ala Ile Asn Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg Lys Ala Val Glu
180 185 190 195
ttc cag gac atc ctg aaa atg ggt cgt acc cag ctg cag gac gca gta 1102
Phe Gln Asp Ile Leu Lys Met Gly Arg Thr Gln Leu Gln Asp Ala Val
200 205 210
ccg atg acc ctc ggt cag gaa ttc cgc gct ttc agc atc ctg ctg aaa 1150
Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ile Leu Leu Lys
215 220 225
gaa gaa gtg aaa aac atc caa cgt acc gct gaa ctg ctg ctg gaa gtt 1198
Glu Glu Val Lys Asn Ile Gln Arg Thr Ala Glu Leu Leu Leu Glu Val
230 235 240
aac ctt ggt gca aca gca atc ggt act ggt ctg aac acg ccg aaa gag 1246
Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn Thr Pro Lys Glu
245 250 255
tac tct ccg ctg gca gtg aaa aaa ctg gct gaa gtt act ggc ttc cca 1294
Tyr Ser Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val Thr Gly Phe pro
260 265 270 275
tgc gta ccg gct gaa gac ctg atc gaa gcg acc tct gac tgc ggc gct 1342
Cys Val Pro Ala Glu Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ser Asp Cys Gly Ala
280 285 290
tat tgg atg gtt cac ggc gcg ctg aaa cgc ctg gct gtg aag atg tcc 1390
Tyr Val Met Val His Fly Ala Leu Lys Arg Leu Ala Val Lys Met Ser
295 300 305
aaa atc tgt aac gac ctg cgc ttg ctc tct tca ggc cca cgt gcc ggc 1438
Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly Pro Arg Ala Gly
310 315 320
ctg aac gag atc aac ctg ccg gaa ctg cag gcg ggc tct tcc atc atg 1486
Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly Ser Ser Ile Met
325 330 335
cca gct aaa gta aac ccg gtt gtt ccg gaa gtg gtt aac cag gta tgc 1534
Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Val Pro Glu Val Val Asn Gln Val Cys
340 345 350 355
ttc aaa gtc atc ggt aac gac acc act gtt acc atg gca gca gaa gca 1582
Phe Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met Ala Ala Glu Ala
360 365 370
ggt cag ctg cag ttg aac gtt atg gag ccg gtc att ggc cag gcc atg 1630
Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile Gly Gln Ala Met
375 380 385
ttc gaa tcc gtt cac att ctg acc aac gct tgc tac aac ctg ctg gaa 1678
Phe Glu Ser Val His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr Asn Leu Leu Glu
390 395 400
aaa tgc att aac ggc atc act gct aac aaa gaa gtg tgc gaa ggt tac 1726
Lys Cys Ile Asn Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val Cys Glu Gly Tyr
405 410 415
gtt tac aac tct atc ggt atc gtt act tac ctg aac ccg ttc atc ggt 1774
Val Tyr Asn Ser rle Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn Pro Phe Ile Gly
420 425 430 435
cac cac aac ggt gac arc gtg ggt aaa arc tgt gcc gaa acc ggt aag 1822
His His Asn Gly Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala Glu Thr Gly Lys
440 445 450
agt gta cgt gaa gtc gtt ctg gaa cgc ggt ctg ttg act gaa gcg gaa 1870
Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Thr Glu Ala Glu
455 460 465
ctt gac gat att ttc tcc gta cag aat ctg atg cac ccg gct tac aaa 1918
Leu Asp Asp Ile Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His Pro Ala Tyr Lys
470 475 480
gca aaa cgc tat act gat gaa agc gaa cag taa tcgtacaggg tagtacaaat 1971
Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln
485 490
aaaaaaggca cgtcagatga cgtgcctttt ttcttgtgag cagtaactta aaaataacaa 2031
tctaatatca acttgttaaa aaacaaggaa ggctaatatg ctagttgtag aactcatcat 2091
agttttgctg gcgatcttct tgggcgccag attgggggga ataggtattg gttttgcagg 2151
cggattgggg gtgctggttc ttgccgctat tggcgttaaa cccggtaaca tcccgttcga 2211
tgtcatctcc attatcatgg cggttatcgc cgctatttct gccatgcagg ttgctggcgg 2271
tctggacta 2280
<210>2
<211>493
<212>PRT
<213>Escherichia coli
<400>2
Met Cys Leu Lys Gln Ile Ile Gly Ser Leu Lys Lys Lys Val His Met
1 5 10 15
Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu Val
20 25 30
Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala Ile Glu Asn
35 40 45
Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val Arg
50 55 60
Gly Met Val Met Val Lys Lys Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu Leu
65 70 75 80
Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys Asp
85 90 95
Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp Val
100 105 110
Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu Val
115 120 125
Leu Ala Asn Ile Gly Leu Glu Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu Tyr
130 135 140
Gln Tyr Leu Asn Pro Asn Asp His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr Asn
145 150 155 160
Asp Ala Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Ile Ala Val Tyr Ser Ser Leu Ile
165 170 175
Lys Leu Val Asp Ala Ile Asn Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg Lys
180 185 190
Ala Val Glu Phe Gln Asp Ile Leu Lys Met Gly Arg Thr Gln Leu Gln
195 200 205
Asp Ala Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ile
210 215 220
Leu Leu Lys Glu Glu Val Lys Asn Ile Gln Arg Thr Ala Glu Leu Leu
225 230 235 240
Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn Thr
245 250 255
Pro Lys Glu Tyr Ser Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val Thr
260 265 270
Gly Phe Pro Cys Val Pro Ala Glu Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ser Asp
275 280 285
Cys Gly Ala Tyr Val Met Val His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala Val
290 295 300
Lys Met Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly Pro
305 310 315 320
Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly Ser
325 330 335
Ser Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Val Pro Glu Val Val Asn
340 345 350
Gln Val Cys Phe Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met Ala
355 360 365
Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile Gly
370 375 380
Gln Ala Met Phe Glu Ser Val His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr Asn
385 390 395 400
Leu Leu Glu Lys Cys Ile Asn Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val Cys
405 410 415
Glu Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ile Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn Pro
420 425 430
Phe Ile Gly His His Asn Gly Asp rle Val Gly Lys Ile Cys Ala Glu
435 440 445
Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Thr
450 455 460
Glu Ala Glu Leu Asp Asp Ile Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His Pro
465 470 475 480
Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln
485 490
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<221>Primer
<222>(1)..(20)
<223>aspA5′-1
<400>3
gctgcatcag cacgaaattc 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<221>Primer
<222>(1)..(20)
<223>aspA5′-2
<400>4
ccattaccat accgcgaaca 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<221>Primer
<222>(1)..(20)
<223>aspA3′-1
<400>5
tggcagcaga agcaggtcag 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<221>Primer
<222>(1)..(20)
<223>aspA3′-2
<400>6
tagtccagac cgccagcaac 20
<210>7
<211>1563
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1563)
<223>mutagenic DNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(60)
<223>technical DNA/residues of polylinker sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(61)..(734)
<223>parts of the 5′region of the aspA gene and regions lying upstream
<220>
<221>misc_feature
<222>(735)..(799)
<223>technical DNA/residues of polylinker sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(800)..(1511)
<223>parts of the 3′region of the aspA gene and regions lying downstream
<220>
<221>misc_feature
<222>(1512)..(1563)
<223>technical DNA/residues of polylinker sequence
<400>7
agcttggtac cgagctcgga tccactagta acggccgcca gtgtgctgga attcgccctt 60
gctgcatcag cacgaaattc ttaaagccct ggttacgtac cagtgacata ccgataactg 120
acgtgaatat aaccagcacg agggtcagca atacccccaa tacatgggca acctgaataa 180
agattgaaat ctcaatatag acataaagga aaatggcaat aaaaggtaac cagcgcaaag 240
gtttctcctg taatagcagc cggttaaccc cggctacctg aatgggttgc gaatcgcgtt 300
tagcttatat tgtggtcatt agcaaaattt caagatgttt gcgcaactat ttttggtagt 360
aatcccaaag cggtgatcta tttcacaaat taataattaa ggggtaaaaa ccgacactta 420
aagtgatcca gattacggta gaaatcctca agcagcatat gatctcgggt attcggtcga 480
tgcaggggat aatcgtcggt cgaaaaacat tcgaaaccac atatattctg tgtgtttaaa 540
gcaaatcatt ggcagcttga aaaagaaggt tcacatgtca aacaacattc gtatcgaaga 600
agatctgttg ggtaccaggg aagttccagc tgatgcctac tatggtgttc acactctgag 660
agcgattgaa aacttctata tcagcaacaa caaaatcagt gatattcctg aatttgttcg 720
cggtatggta atggaagggc gaattctgca gatctcggat ccactagtaa cggccgccag 780
tgtgctggaa ttcgcccttt ggcagcagaa gcaggtcagc tgcagttgaa cgttatggag 840
ccggtcattg gccaggccat gttcgaatcc gttcacattc tgaccaacgc ttgctacaac 900
ctgctggaaa aatgcattaa cggcatcact gctaacaaag aagtgtgcga aggttacgtt 960
tacaactcta tcggtatcgt tacttacctg aacccgttca tcggtcacca caacggtgac 1020
atcgtgggta aaatctgtgc cgaaaccggt aagagtgtac gtgaagtcgt tctggaacgc 1080
ggtctgttga ctgaagcgga acttgacgat attttctccg tacagaatct gatgcacccg 1140
gcttacaaag caaaacgcta tactgatgaa agcgaacagt aatcgtacag ggtagtacaa 1200
ataaaaaagg cacgtcagat gacgtgcctt ttttcttgtg agcagtaact taaaaataac 1260
aatctaatat caacttgtta aaaaacaagg aaggctaata tgctagttgt agaactcatc 1320
atagttttgc tggcgatctt cttgggcgcc agattggggg gaataggtat tggttttgca 1380
ggcggattgg gggtgctggt tcttgccgct attggcgtta aacccggtaa catcccgttc 1440
gatgtcatct ccattatcat ggcggttatc gccgctattt ctgccatgca ggttgctggc 1500
ggtctggact aaagggcgaa ttctgcagat atccatcaca ctggcggccg ctcgagcatg 1560
cat 1563
<210>8
<211>653
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(653)
<223>mutagenic DNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(3)
<223>start codon of the deltaaspA allele
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(205)
<223>5′region of the deltaaspA allele
<220>
<221>misc_feature
<222>(206)..(270)
<223>technical DNA/residues of the polylinker sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(271)..(653)
<223>3′region of the deltaaspA allele
<220>
<221>misc_feature
<222>(651)..(653)
<223>stop codon of the deltaaspA allele
<400>8
gtgtgtttaa agcaaatcat tggcagcttg aaaaagaagg ttcacatgtc aaacaacatt 60
cgtatcgaag aagatctgtt gggtaccagg gaagttccag ctgatgccta ctatggtgtt 120
cacactctga gagcgattga aaacttctat atcagcaaca acaaaatcag tgatattcct 180
gaatttgttc gcggtatggt aatggaaggg cgaattctgc agatctcgga tccactagta 240
acggccgcca gtgtgctgga attcgccctt tggcagcaga agcaggtcag ctgcagttga 300
acgttatgga gccggtcatt ggccaggcca tgttcgaatc cgttcacatt ctgaccaacg 360
cttgctacaa cctgctggaa aaatgcatta acggcatcac tgctaacaaa gaagtgtgcg 420
aaggttacgt ttacaactct atcggtatcg ttacttacct gaacccgttc atcggtcacc 480
acaacggtga catcgtgggt aaaatctgtg ccgaaaccgg taagagtgta cgtgaagtcg 540
ttctggaacg cggtctgttg actgaagcgg aacttgacga tattttctcc gtacagaatc 600
tgatgcaccc ggcttacaaa gcaaaacgct atactgatga aagcgaacag taa 653