通过对四氢叶酸酯盐分级结晶来制备 四氢叶酸酯盐和四氢叶酸的纯立体异构体的方法 本发明涉及一种制备和浓缩(6S，αS)或(6S，αR)四氢叶酸酯盐和(6S，αS)或(6S，αR)四氢叶酸的方法，该方法是这样实现的：在有机溶剂中制备或溶解由四氢叶酸酯与芳族磺酸的加成盐的非对映体组成的等摩尔的或浓缩的混合物，随后将其结晶至少一次，如果合适，再将其水解以产生(6S，αS)或(6S，αR)四氢叶酸，并将它们作为游离酸结晶出来或以其盐的形式将其分离出来。(6R，αS)或(6R，αR)四氢叶酸酯的加成盐可以用相应的磺酸从母液中分离出来，并通过水解获得相应的四氢叶酸或其盐。叶酸满足化学式I，
其中不对称的α-C原子可以以S构型(αS)或以R构型(αR)存在于谷氨酸残基中。下文中，叶酸的对映体将被称为(αS)叶酸和(αR)叶酸。也以同样的方式称呼叶酸酯及其衍生物。它们将被称为(αS)叶酸酯和(αR)叶酸酯。天然形成的叶酸相当于(αS)叶酸。四氢叶酸满足化学式II，
其中不对称的α-C原子可以以S构型(αS)或以R构型(αR)存在于谷氨酸残基中，而不对称的C原子6可以以S构型(6S)或以R构型(6R)存在于四氢蝶呤基中。下文中，四氢叶酸的非对映体将被称为(6S，αS)、(6S，αR)、(6R，αS)和(6R，αR)四氢叶酸。也以同样的方式称呼四氢叶酸酯及其衍生物。它们将被称为(6S，αS)、(6S，αR)、(6R，αS)和(6R，αR)四氢叶酸酯。天然形成的四氢叶酸相当于(6S，αS)四氢叶酸。
下文中，除了另外指明的以外，术语叶酸、叶酸酯和叶酸酯盐均包含两种对映体(αS)和(αR)，而术语四氢叶酸、四氢叶酸酯和四氢叶酸酯盐包含所有可能的非对映体。
已经发现呈5-甲酰或5-甲基衍生物形式地四氢叶酸及其生理适应性盐具有广泛的治疗用途。我们早已得知，天然存在的还原叶酸酯(folate)的非对映体(例如(6S，αS)四氢叶酸)的生物活性是最强的。因此，提供仅含最具活性形式的、或至少含有高浓度的后一种形式的治疗用制剂是有道理的。
工业规模的四氢叶酸通常由(αS)叶酸的蝶呤骨架中的两个亚氨基多相氢化而成，通常获得一种由(6S，αS)四氢叶酸和(6R，αS)四氢叶酸构成的等摩尔混合物。该等摩尔混合物可以用作药物制剂。但是，也可以预先通过分级结晶法将所需的四氢叶酸的(6S，αS)非对映体浓缩或以单纯形式将其回收，用于此目的的各种方法都是已知的，例如见EP-0495204。
EP-0495204中阐述的方法使用了四氢叶酸磺酸盐的(6S，αS)和(6R，αS)非对映体的等摩尔混合物，该混合物被溶解在水中，然后被结晶。该方法获得了所需的(6S，αS)非对映体的浓缩物，它在第一结晶步骤中已经可以达到非常高的浓度(高达约95％)，并可以通过进一步分级结晶而获得纯(6S，αS)四氢叶酸。从经济的角度看，这种方法不是非常可取的，因为用于成盐的磺酸只能非常费力地从含水母液中分离出来，而且必须处理大量的含有磺酸的母液，这是不经济的。
EP0682026阐述了从某一pH值的含水介质中通过结晶制备稳定的晶状(6S，αS)和(6R，αS)四氢叶酸的方法。但是，分级结晶时的浓度太低，以致于必须经多步才能将所需的非对映体浓缩至99.5％以上。这会引起主要物质的损失并带来形成化学分解产物的危险。用这种方法来浓缩合成的异构体尤其艰巨。
出乎意料地发现，四氢叶酸酯的芳族磺酸盐(加成盐)特别适合于制备旋光纯的四氢叶酸非对映体，因为只有(6S，αS)或(6S，αR)非对映体的加成盐从有机溶剂中结晶出来。由70∶30的异构体混合物开始，即便是第一次结晶也在结晶体中产生了非常高浓度(也许甚至在99％以上)的(6S，αS)或(6S，αR)非对映体或它们的混合物，并在母液中产生了(6R，αS)或(6R，αR)非对映体或它们的混合物。通过进一步结晶，一般可以获得旋光纯的非对映体。
本发明的主题是制备和浓缩(6S，αS)或(6S，αR)四氢叶酸酯盐和(6S，αS)或(6S，αR)四氢叶酸的方法，其特征在于在有机溶剂中制备或溶解由四氢叶酸酯与芳族磺酸的加成盐的非对映体组成的等摩尔的或浓缩的混合物，随后将其结晶至少一次，然后，如果合适，将结晶体水解以产生(6S，αS)或(6S，αR)四氢叶酸，将它们作为游离酸结晶出来或以其盐的形式将其分离出来。
在本发明的框架内，结晶至少一次是指分级结晶至所需的纯度。结晶步骤的次数主要由原料产物中需要含有多少非对映体来确定。
四氢叶酸酯的加成盐可以满足化学式III，并包含(6S，αS)、(6S，αR)、(6R，αS)和(6R，αR)非对映体，
其中R1或R2代表H，R1或R2之一或R1和R2两者相互独立地代表一价烃基或通过一个碳原子与选自-O-、-S-和-N-的杂原子连接的杂烃基，HA代表芳族磺酸，x代表1-6的整数或0-6之间的小数。
R1和R2可以相互独立地选择，但它们最好是相同的。优选的是R1和R2代表烃基。当R1和R2是烃基时，它们可以是具有1-20个碳原子、优选1-12个碳原子、更优选1-8个碳原子、最优选1-4个碳原子的脂族基；具有3-8个环烃原子的环脂族基或具有3-8个环烃原子和1-6个脂族基碳原子的环脂族-脂族基；具有6-14个碳原子、优选6-10个碳原子的芳族烃基；或具有7-15个碳原子、更优选7-10个碳原子的芳族-脂族基。
杂烃基可以是具有2-16个碳原子、优选2-10个碳原子、最优选2-6个碳原子的杂烷基；具有3-8个、优选5或6个环节的杂环脂族基；具有3-8个、优选5或6个环节和1-6个、优选1-4个脂族基碳原子的杂环脂族-脂族基；优选具有4-13个碳原子、尤其是4-9个碳原子并具有至少一个杂原子的杂芳基；以及优选具有4-13个碳原子、尤其是4-9个碳原子并具有至少一个杂原子且具有1-6个、优选1-4个脂族基碳原子的杂芳族-脂族基；这些杂基含有至少一个选自-O-、-S-和-N-的，优选选自-O-和-N-的杂原子。
烃基例如可以选自线型和支化的C1-20烷基；C3-8环烷基，优选C4-7环烷基；C3-8环烷基-C1-6烷基，优选C4-7环烷基-C1-4烷基；C6-10芳基或C7-12芳烷基。
杂烃基例如可以选自C2-16-杂烷基；C2-7-杂环烷基，优选C4-5-杂环烷基；C4-7-杂环烷基-C1-6烷基，优选C4-5-杂环烷基-C1-6烷基；C4-9-杂芳基，优选C4-5-杂芳基；和C5-12-杂芳烷基，优选C5-10-杂芳烷基；这些杂基含有1-3个、优选1或2个选自-O-和-N-的杂原子。
R1和R2可以是线型或支化的烷基，该烷基优选具有1-12个、更优选1-8个、最优选1-4个碳原子。其实例包括甲基、乙基、以及丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基和二十烷基的异构体。烷基最好是线型的，且优选为甲基、乙基、正丙基和正丁基。最优选的是烷基代表甲基。
作为环烷基，R1和R2优选含有4-7个、最优选5或6个环烃原子。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。尤其优选的是环己基。
作为环烷基烷基，R1和R2优选含有4-7个、最优选5或6个环碳原子，并优选含有1-4个、最优选1或2个脂族基碳原子。环烷基烷基的实例包括环丙基甲基或环丙基乙基、环丁基甲基或环丁基丙基、环戊基甲基或环戊基乙基、环己基甲基或环己基乙基、环庚基甲基和环辛基甲基。尤其优选的是环己基甲基或环己基乙基。
作为芳基，R1和R2可以代表萘基，优选代表苯基。作为芳烷基，R1和R2优选为具有1-4个烷基碳原子的苯基烷基。其实例包括苄基和β-苯基乙基。
作为杂烷基，R1和R2例如可为C1-4烷基-X1-C2-4烷基，其中X1代表O或NC1-4烷基。其实例是甲氧基乙基和乙氧基乙基。
作为杂环烷基，R1和R2例如可为吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、四氢吡喃基或哌嗪基。
作为杂环烷基烷基，R1和R2例如可为吡咯烷基甲基或吡咯烷基乙基、哌啶基甲基或哌啶基乙基、吗啉基甲基或吗啉基乙基、四氢吡喃基甲基或四氢吡喃基乙基、或哌嗪基甲基或哌嗪基乙基。
作为杂芳基，R1和R2例如可为苯硫基、呋喃基、吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚基、喹啉基、噁唑基或异噁唑基。
作为杂芳烷基，R1和R2例如可为呋喃基甲基或呋喃基乙基、吡喃基甲基或吡喃基乙基、吡咯基甲基或吡咯基乙基、咪唑基甲基或咪唑基乙基、吡啶基甲基或吡啶基乙基、嘧啶基甲基或嘧啶基乙基、吡嗪基甲基或吡嗪基乙基、吲哚基甲基或吲哚基乙基、喹啉基甲基或喹啉基乙基。
优选的一组式III化合物是以下这些：其R1和R2相互独立地代表C1-4烷基、C5环烷基或C6环烷基、苯基、C1-4烷基苯基、苄基或C1-4烷基苄基。优选的是R1和R2是相同基团。最优选的是R1和R2代表C1-4烷基，例如甲基或乙基。
式III中，x优选代表0.5-4之间的整数或小数，尤其是0.5-3之间的整数或小数，最优选是0.5-2之间的整数或小数。
芳族磺酸可以含有1至3个、优选1或2个、更优选1个磺酸基。芳烃的磺酸是优选的。芳族磺酸可以是未被取代的或是被氢、线型或支化的C1-8烷基、优选C1-4烷基、线型或支化的C1-8烷氧基、优选C1-4烷氧基、以及线型或支化的C1-8卤烷基、优选C1-4卤烷基取代的。取代基的一些实例是甲基、乙基、丙基、丁基、甲氧基、乙氧基、三氟甲基或三氯甲基、氟和氯。芳基优选含有取代基。芳基中优选的是苯基和萘基。芳族磺酸最优选满足式IV，
R3-SO3H (IV)
其中R3代表未被取代的或被F、Cl、Br、C1-4烷基、C1-4卤烷基或C1-4烷氧基取代的苯基。R3的一些具体实例是苯基、甲基苯基、氟苯基、氯苯基、三氯甲基苯基和三氟甲基苯基。
特别优选的式III化合物是以下这些：其R1和R2各自代表甲基，x代表1或2或代表0.5-2之间的小数，HA代表苯磺酸、甲苯磺酸、氟磺酸、氯磺酸或三氟甲基苯磺酸。优选的被取代的基团是对甲苯基甲基苯基、对氟甲基苯基、对氯甲基苯基或对三氟甲基苯基。
最优选的式III化合物是以下这些：其R1和R2各自代表甲基，x代表1或2或代表0.5-2之间的小数，HA代表苯磺酸或对甲苯磺酸。
本发明所用的四氢叶酸酯的加成盐是新的，例如可以在磺酸的存在下将四氢叶酸酯化而制得，或在极性有机溶剂中将四氢叶酸盐酯化而制得。
也可以以叶酸为原料，用公知的方法使叶酸与氢在多相或均相氢化催化剂的存在下发生氢化。如果是在极性反应介质(例如含水反应介质或醇反应介质)中、在可溶于该反应介质的手性氢化催化剂的存在下与氢发生氢化，则氢化也可以非对映选择地进行。合适的氢化催化剂是已知的。尤其是Rh、Ir或Ru与二叔二膦的金属络合物，例如H.Brunner and W.Zettlmeier，Handbook of EnantioselectiveCatalysis，vol.II：Ligand Reference，published by VCHVerlagsgesellschaft mbH，Weinheim(1993)中阐述的。所得的四氢叶酸可以随后用公知的方法酯化。如果在醇溶剂中、在磺酸的存在下、在导致叶酸酯化的条件下进行氢化，则直接由相应的四氢叶酸酯和磺酸产生了加成盐。
作为另一种方法，也可以以叶酸酯为原料，用公知的方法使叶酸酯与氢在多相或均相氢化催化剂的存在下发生氢化。如果是在极性反应介质(例如醇反应介质)中、在可溶于该反应介质的手性氢化催化剂的存在下与氢发生氢化，则氢化也可以非对映选择地进行。所得的四氢叶酸酯可以随后用磺酸转化成加成盐。氢化可以按照前面所述的进行，用Ir、Rh或Ru与二叔二膦的醇溶性金属络合物作为氢化催化剂。如果在醇溶剂中、在磺酸的存在下进行氢化，则直接由相应的四氢叶酸酯和磺酸产生了加成盐。如果将得自叶酸酯与磺酸的加成盐用于氢化，同样直接产生四氢叶酸酯与磺酸的加成盐。
在本发明的框架内，等摩尔的或浓缩的混合物是指含有相等量的具有(6S)和(6R)构型的非对映体的混合物，或是指含有(6S)或(6R)构型的非对映体的剩余物的混合物。也可以使用具有或是(αS)或是(αR)构型的(6S)和(6R)构型的非对映体的混合物，或使用具有(6S)和(6R)构型以及在α-C原子处具有不同构型的非对映体对的混合物。这些混合物可以相应地含有至少5％、优选至少20％、最优选至少30％、且至多约75％或更多的(6S，αS)或(6S，αR)非对映体。
合适的有机溶剂是极性有机溶剂，每升沸腾温度下的溶剂最好能够溶解至少1g四氢叶酸酯的加成盐。溶剂的实例是卤代烃(二氯甲烷、氯仿、四氯乙烷、氯苯)；醚(二乙醚、二丁醚、四氢呋喃、二噁烷、乙二醇二甲醚或乙二醇二乙醚)；羧酸酯和内酯(乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酸甲酯、戊内酯)；N，N-取代的羧酸酰胺和内酰胺(二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮)；酮(丙酮、甲基异丁基酮、环己酮)；亚砜和砜(二甲亚砜、二甲基砜、四亚甲基砜)；和醇(甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇、正丁醇、异丁醇或叔丁醇、戊醇、己醇、环己醇、环己二醇、羟甲基环己烷或二羟甲基环己烷、苄醇、1，2-亚乙基二醇、二甘醇、丙二醇、丁二醇、乙二醇单甲醚或乙二醇单乙醚、以及二甘醇单甲醚或二甘醇单乙醚)。优选的是乙醇，尤其是甲醇。也可以使用至少两种溶剂的混合物。
特别优选的是使用醇或醇与至少一种其他溶剂的混合物。醇的比例优选至少为30％(体积)，尤其是至少为50％(体积)，最优选至少为70％(体积)。最优选的是仅使用醇，例如甲醇，或是使用醇与醇-混溶性溶剂的混合物，如甲醇与醚的混合物。
具体地说，该方法例如可以这样进行：将四氢叶酸酯与芳族磺酸的加成盐的非对映体的等摩尔的或浓缩的混合物与溶剂混合，随后加热该混合物以便溶解四氢叶酸酯与芳族磺酸的加成盐。可以加热到高达溶剂的沸点温度。此后将溶液冷却至不低于溶剂的凝固点，于是(6S，αS)或(6S，αR)非对映体或这两种非对映体自发地或通过放入所需非对映体的晶种而结晶出来，或者，通过蒸发将溶液浓缩，然后可以通过过滤用常规方法分离出来。
已被证实特别有益的是，对于制备或浓缩四氢叶酸酯与芳族磺酸的加成盐来说，也可以直接使用叶酸酯氢化时的、或叶酸酯与芳族磺酸的加成盐氢化时的反应溶液。
以70∶30的异构体混合物为原料，在第一次结晶中已经观察到极高的浓度，这是完全出乎意料的，例如可超过99％。因此，现在只需要很少的结晶步骤来制备纯(6S，αS)或(6S，αR)非对映体，例如至多三个结晶步骤，同样出乎意料的是经常仅需一个结晶步骤。
结晶体中观察到的(6S，αS)或(6S，αR)非对映体的浓缩程度非常高，而且这些异构体的结晶能力非常优异，因此本发明的方法甚至可以用于从主要含有(6R，αS)或(6R，αR)非对映体的母液中分离出(6S，αS)或(6S，αR)非对映体。本发明的方法特别适合于工业规模的分离处理。
分离后所得到的(6S，αS)或(6S，αR)四氢叶酸酯与磺酸的加成盐可以随后用公知的方法水解，例如使用诸如NaOH或KOH的碱。因此获得了相应的(6S，αS)或(6S，αR)四氢叶酸。可以通过结晶将这些四氢叶酸以稳定的形式分离出来作为游离酸，例如EP-A-0682026中所述的。通过加入酸，例如磺酸，四氢叶酸的盐同样可以被结晶并根据需要而被进一步浓缩(EP 0495204)。
用以下实施例中列出的反应物和/或操作条件代替概括地或具体地拟定的本发明反应物和/或操作条件，同样可以成功地实施以下的实施例。同样，以下的具体实施方案应当看作仅是为了举例说明，而决不会限制所公开内容的其余部分。
全部公开内容包括本文中列出的供参考用的所有申请、专利和出版物。
根据前面的说明，任何一个本领域的普通技术人员都可以容易地推导出本发明的决定性要素而不背离本发明的基本原理和范围，以便对本发明进行替换和补充，从而使本发明适应不同的需求和条件。
使用以下缩写：COD代表环辛二烯。
旋光体产量、或(6S，αS)非对映体与(6R，αS)非对映体的比例、或(6S，αR)非对映体与(6R，αR)非对映体的比例是按以下方式将高压液相色谱法(HPLC)直接用于结晶体或母液来确定的：
将0.5mg结晶体或15mg母液溶解在1ml溶剂中，该溶剂是通过将6.8g β-环糊精和270ml 37％的甲醛加入到1000ml水中制成的。用一个Macherey-Nagel公司生产的5mm、240×4mm的NucleosilC-8柱和一种流动溶剂进行分离，所述流动溶剂用以下方法制备：将6.8g β-环糊精溶解在由8.5ml三乙胺、850ml水和150ml乙腈组成的混合物中。通过添加乙酸将溶液的pH值调节至7.5，再加入270ml37％的甲醛。在300nm波长检测这些非对映体。
溶液和悬浮液的制备和浓缩以及它们的转移在隔绝氧的状态下进行，并使用保护气如氮气或惰性气体。
实施例
A制备四氢叶酸酯与磺酸的加成盐溶液
实施例A1
a制备(αS)叶酸二甲酯苯磺酸盐
在40℃将800g(1.68mmol)的(αS)叶酸二水合物加入到处在氮气气氛中的由530g(3.35mmol)苯磺酸和20升无水甲醇组成的溶液中。将该混合物回流加热半小时，冷却，并通过蒸发将其体积浓缩至5升。通过抽吸将沉淀物滤出，用1升甲醇洗涤，并在40℃和20毫巴的干燥室中干燥。得到了966g(1.45mmol，理论产量的86％)(αS)叶酸二甲酯苯磺酸盐。该产物含有26.2％苯磺酸，1.67％水，和2.26％甲醇。
该物质在150℃以上发生分解。DMSO-d6中的1H-NMR：8.78(1H，s)，8.46(2H，bs)，8.32(1H，d)，7.64-7.68(m)，7.35-7.40(m)，6.66(2H，d)，0.8(2H，s)，4.39(1H，m)，3.62(3H，s)，3.57(3H，s)，2.42(2H，m)，1.98-2.11(2H，m)。b通过将(αS)叶酸二甲酯苯磺酸盐氢化来制备四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐的(6S，αS)/(6R，αS)非对映体混合物溶液
称取6.72mg(10μmol)[Ir(COD)Cl]2和15.57mg(25μmol)R-BINAP，脱气并溶解在二氯甲烷中。在高真空状态下冷凝出二氯甲烷，并将剩余物溶解在5ml甲醇中。将1.25g(2mmol)实施例Ala中的(αS)叶酸二甲酯苯磺酸盐悬浮在25ml甲醇中并加入到催化剂中。在氮气逆流中将该悬浮液加入到一个100ml的压热器中并氢化，直至不再摄取任何氢。COD代表环辛二烯。得到了四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐。(6S，αS)∶(6R，αS)非对映体的比例为74∶26。c通过将(αS)叶酸二甲酯苯磺酸盐氢化来制备含有(6R，αS)非对映体剩余物的四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐的(6S，αS)/(6R，αS)非对映体混合物溶液
称取6.72mg(10μmol)[Ir(COD)Cl]2和13.84mg(25μmol)(2S，4S)-BPPM，脱气并溶解在二氯甲烷中。在高真空状态下冷凝出二氯甲烷，并将剩余物溶解在5ml甲醇中。将1.25g(2mmol)实施例A1a中的(αS)叶酸二甲酯苯磺酸盐悬浮在25ml甲醇中并加入到催化剂中。在氮气逆流中将该悬浮液加入到一个100ml的压热器中并氢化17小时。得到了四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐。(6S，αS)∶(6R，αS)非对映体的比例为34∶66。
实施例A2
通过将四氢叶酸酯化来制备四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐的等摩尔的(6S，αS)/(6R，αS)非对映体混合物溶液
将20g(44.9mmol)(6S，αS)和(6R，αS)四氢叶酸的等摩尔混合物加入到溶在900ml甲醇中的10.65g(67.35mmol)苯磺酸中，并回流加热7小时。得到了(6S，αS)和(6R，αS)四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐。
实施例A3
通过将(6S，αS)/(6 R，αS)非对映体比例为70∶30的四氢叶酸酯化来制备(6S，αS)/(6R，αS)非对映体比例为70∶30的四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐混合物溶液
将5.31g(11.92mmol)(6S，αS)/(6R，αS)非对映体比例为70∶30的四氢叶酸(按照EP0495204N1制备)在含有2.83g(17.88mmol)苯磺酸的230ml甲醇中回流加热7小时。得到了(6S，αS)∶(6R，αS)非对映体比例为70∶30的四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐溶液。
实施例A4
制备四氢叶酸二甲酯甲苯磺酸盐的(6S，αS)和(6R，αS)非对映体的等摩尔溶液
将10g(22.45mmol)(6S，αS)和(6R，αS)四氢叶酸的等摩尔混合物加入到溶在450ml甲醇中的6.41g(33.67mmol)甲苯磺酸一水合物中，并回流加热7小时。得到了(6S，αS)∶(6R，αS)非对映体比例为1∶1的四氢叶酸二甲酯甲苯磺酸盐溶液。
实施例A5
制备四氢叶酸二甲酯萘-1-磺酸盐的(6S，αS)和(6R，αS)非对映体的等摩尔溶液
将3g(6.73mmol)(6S，αS)和(6R，αS)四氢叶酸的等摩尔混合物加入到溶在130ml甲醇中的2.33g(10.1mmol)萘-1-磺酸钠盐和4.7ml 2M的HCl中，并回流加热7小时。得到了(6S，αS)∶(6R，αS)非对映体比例为1∶1的四氢叶酸二甲酯萘-1-磺酸盐溶液。
B分离和浓缩处理
实施例B1
(6S，αS)四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐的分离和浓缩a在隔绝氧的状态下，通过蒸发而将实施例A1b中得到的含有74％的(6S，αS)非对映体的四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐溶液浓缩至其体积的1/6。将所得的悬浮液在氮气气氛中在4℃储存2小时，将沉淀物抽出，用少量冷甲醇洗涤，并在40℃和20毫巴的条件下干燥。得到了0.55g(0.87mmol，理论产量的44％)四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐。四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐的非对映体比例(6S，αS)∶(6R，αS)为99∶1。[a]589＝-69.8°(在二甲亚砜中c＝1)。
该物质在150℃以上发生分解。DMSO-d6中的1H-NMR：10.61(1H，bs)，8.35(1H，d)，7.6-7.74(m)，7.51(1H，bs)，7.30-7.37(m)，6.70(2H，d，2H，bs)，4.42(2H，m)，3.63(3H，s)，3.58(3H，s)，3.50(1H，m)，3.38(1H，m)，3.28(1H，m)，2.44(2H，m)，2.01-2.13(2H，m)。b从实施例A1c的溶液中分离和浓缩(6S，αS)四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐
在隔绝氧的状态下，将实施例A1c中得到的含有34％的(6S，αS)非对映体的四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐溶液在氮气气氛中在4℃储存2小时。此后将沉淀物抽出，用少量冷甲醇洗涤，并在40℃和20毫巴的条件下干燥。得到了0.2g含有96.6％(6S，αS)非对映体的四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐。c从实施例A2的溶液中分离和浓缩(6S，αS)四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐
将来自实施例A2的透明溶液冷却至室温并搅拌过夜。将固体沉淀物抽出，用甲醇和叔丁基甲基醚洗涤，并在30℃和10毫巴的条件下干燥。得到了9.62g(15.24mmol)含有99.1％(6S，αS)非对映体的无色的结晶四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐((6R，αS)四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐可以由实施例B5中概述的母液B1c制备)。
将4g(6.34mmol)所得的含有99.1％(6S，αS)非对映体的四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐溶解在220ml沸腾甲醇中。将该溶液冷却至室温，放置过夜并将固体沉淀物抽出。用甲醇和叔丁基甲基醚洗涤，并在35℃和10毫巴的条件下干燥。得到了3.08g(4.88mmol)含有99.5％(6S，αS)非对映体的无色的结晶四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐。d从实施例A3的溶液中分离和浓缩(6S，αS)四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐
将得自实施例A3的溶液冷却至室温，并在60℃向该溶液放入非对映体-纯(6S，αS)四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐晶种。放置过夜后，将沉淀的固体抽出，用甲醇和叔丁基甲基醚洗涤，并在35℃和10毫巴的条件下于燥。得到了3.46g(5.48mmol)含有99.9％(6S，αS)非对映体的四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐。
实施例B2
分离和浓缩(6S，αS)四氢叶酸二甲酯甲苯磺酸盐
将得自实施例A4的四氢叶酸二甲酯甲苯磺酸盐等摩尔混合物冷却至室温并搅拌过夜。将固体沉淀物抽出，用甲醇和叔丁基甲基醚洗涤，并在30℃和10毫巴的条件下干燥。得到了5.53g(9.54mmol)含有99.1％(6S，αS)非对映体的无色的结晶四氢叶酸二甲酯甲苯磺酸盐。
将5.2g(8.97mmol)由该方法得到的含有99.1％(6S，αS)非对映体的四氢叶酸二甲酯甲苯磺酸盐溶解在182ml沸腾甲醇中。将该溶液冷却至室温，在室温下搅拌3小时，并将固体沉淀物抽出。用甲醇和叔丁基甲基醚洗涤，并在35℃和10毫巴的条件下干燥。得到了4.43g(7.64mmol)含有99.8％(6S，αS)非对映体的无色的结晶四氢叶酸二甲酯甲苯磺酸盐。
实施例B3
分离和浓缩(6S，αS)四氢叶酸二甲酯萘-1-磺酸盐
将得自实施例A5的溶液冷却至室温并搅拌过夜。将固体沉淀物抽出，并在30℃和10毫巴的条件下干燥。得到了0.34g(0.55mmol)含有62.7％(6S，αS)非对映体的无色的四氢叶酸二甲酯萘-1-磺酸盐。
实施例B4通过将四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐水解来制备(6S，αS)四氢叶酸苯磺酸盐
在与氧隔绝的状态下，将0.55g(0.95mmol)实施例B1a的四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐和0.32g(3.02mmol)碳酸钠溶解在4ml水中。将该溶液加热到85℃，并在30分钟后用37％的盐酸将pH值调节到7.5。在75℃加入溶解在0.6ml水中的0.2g苯磺酸，然后用37％的盐酸将pH值调节到8。将该溶液冷却到室温并再搅拌3小时。通过抽吸将产物滤出，并在一个30℃和20毫巴的干燥室中干燥4天。得到了8.4g(13.92mmol，理论产量的88％)四氢叶酸苯磺酸盐。
该四氢叶酸苯磺酸盐的非对映体比例(6S，αS)∶(6R，αS)为99∶1。四氢叶酸苯磺酸盐的性质与EP0495204N1中所述产物的性质相同。
实施例B5
分离浓缩的(6R，αS)四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐
通过蒸发将来自实施例B1c的母液浓缩至其体积的1/4。将其冷却至0℃，放入非对映体-纯(6S，αS)四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐晶种，并抽出1.5g(6S，αS)∶(6R，αS)非对映体比例为97∶3的四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐。通过蒸发将该母液浓缩至干燥。将200ml二乙醚加入到该油状剩余物中，并在0℃搅拌2小时。将固体沉淀物抽出，用二乙醚洗涤，并在30℃和20毫巴的条件下干燥。得到了14.8g(6R，αS)∶(6S，αS)非对映体比例为80∶20的四氢叶酸二甲酯苯磺酸盐。