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1、10申请公布号CN104173397A43申请公布日20141203CN104173397A21申请号201410445536422申请日20140904A61K36/23200601A61P35/0020060171申请人南京标科生物科技有限公司地址210046江苏省南京市栖霞区尧化街道甘家边东108号1幢701室72发明人张金芳杨存54发明名称一种芹菜总黄酮的提取方法及其应用57摘要本发明涉及一种芹菜总黄酮的提取方法及其应用，具体涉及一种利用超声波辅助醇提和液液液三相萃取相结合的方法。其处理步骤将新鲜的野生芹菜烘干、粉碎超声波法提取合并滤液减压浓缩萃取干燥。本发明工艺简单、提取效率高、节约。
2、能源、成本低、适于大规模工业化生产。本发明所述的芹菜总黄酮提取物尤其适合在制备抗肿瘤产品中的应用，所述的产品包括药品、保健品。51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104173397ACN104173397A1/1页21一种芹菜总黄酮的提取方法，其特征在于以新鲜野生芹菜为原料，清洗干净，烘干，用粉碎机粉碎，将芹菜粉末置于提取器中，然后按照一定的料液比加入乙醇溶液，超声提取，冷却抽滤，滤渣重复提取2次，合并三次滤液后，减压浓缩至原体积的1/41/2，浓缩液转至分液漏斗中用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂进行萃取，。
3、取下层，回收试剂，冷冻干燥得到芹菜总黄酮。2根据权利要求1所述的一种芹菜总黄酮的提取方法，其特征在于所述的料液比为115。3根据权利要求1所述的一种芹菜总黄酮的提取方法，其特征在于所述的乙醇浓度为5070，超声的提取时间为5090MIN，提取温度为6075。4根据权利要求1所述的一种芹菜总黄酮的提取方法，其特征在于所述的超声波提取频率为2080KHZ。5根据权利要求1所述的一种芹菜总黄酮的提取方法，其特征在于所述的浓缩液、石油醚、乙酸乙酯体积比为13536。6根据权利要求15所述方法制备的芹菜总黄酮提取物在制备抗肿瘤产品中的应用。7根据权利要求6所述的抗肿瘤产品包括药品、保健品。权利要求书CN。
4、104173397A1/4页3一种芹菜总黄酮的提取方法及其应用技术领域0001本发明涉及一种利用超声波辅助醇提和液液液三相萃取相结合提取芹菜总黄酮的方法，以及所得芹菜总黄酮在制备抗肿瘤产品中的应用。背景技术0002癌症是一大类恶性肿瘤的统称。癌细胞的特点是无限制、无止境地增生，使患者体内的营养物质被大量消耗；癌细胞释放出多种毒素，使人体产生一系列症状；癌细胞还可转移到全身各处生长繁殖，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等等。与之相对的有良性肿瘤，良性肿瘤则容易清除干净，一般不转移、不复发，对器官、组织只有挤压和阻塞作用，但癌症（恶性肿瘤）还可破坏组织、器官的结构和功。
5、能，引起坏死出血合并感染，患者最终由于器官功能衰竭而死亡。到了科学高速发展的今天，我们有理由相信癌症并非不治之症。致力于自然医学研究的医学专家们研究发现负离子对抑制癌细胞转移有令人鼓舞的效果，重要的是利用自然因子负离子对癌症患者治疗对机体无任何损害，没有任何毒副作用。0003癌症严重威胁着人类的生命，是当今世界上大多数国家的主要死因之一。据世界卫生组织统计，全世界每年死于癌症的患者约500万，因此癌症的治疗和预防任务十分艰巨。0004生物总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇）、异黄酮、双黄酮、黄。
6、烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。0005近年来，由于自由基生命科学的进展，使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。类黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。它们对健康的好处有（1）抗炎症（2）抗过敏（3）抑制细菌（4）抑制寄生虫（5）抑制病毒（6）防治肝病（7）防治血管疾病（8）防治血管栓塞（9）防治心与脑血管疾病（10）抗肿瘤（11）抗化学毒物等。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能时入脂肪组织，进而体现出如下功能消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩。
7、张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。0006芹菜，属伞形科植物。有水芹、旱芹两种，功能相近，药用以旱芹为佳。旱芹香气较浓，又名“香芹”，亦称“药芹”。富含蛋白质、碳水化合物、胡萝卜素、B族维生素、钙、磷、铁、钠等，同时，具有有平肝清热，祛风利湿，除烦消肿，凉血止血，解毒宣肺，健胃利血、清肠利便、润肺止咳、降低血压、健脑镇静的功效。常吃芹菜，尤其是吃芹菜叶，对预防高血压、动脉硬化等都十分有益，并有辅助治疗作用。0007尽管芹菜在人类食品方面已获得广泛应用，但有关芹菜在抗肿瘤药物中的应用很少见报道。说明书CN104173397A2/4页4发明内容0008为了充。
8、分利用芹菜资源，扩大抗肿瘤产品的应用品种，本发明特别提供了一种芹菜总黄酮的提取方法和其在抗肿瘤产品中的应用。0009为实现上述目的，芹菜总黄酮的提取方法采用以下操作步骤1）以新鲜的野生芹菜为原料，清洗干净，烘干，用粉碎机粉碎；2）取一定量芹菜粉末于提取器中，在提取器中加入料液比为115、5070的乙醇溶液，超声提取时间为5090MIN，提取温度为6075，超声波提取频率为2080KHZ；3）冷却抽滤，滤渣利用超声提取2次，合并三次滤液后，将其减压浓缩，减压浓缩至原体积的1/41/2，然后转至分液漏斗中用石油醚和乙酸乙酯的混合物进行萃取，取下层，回收试剂，冷冻干燥得到芹菜总黄酮。0010本发明中。
9、，步骤2）中所述的浓缩液、石油醚、乙酸乙酯体积比为13536。0011本发明的目的在于提供一种液液液三相萃取相的方法提取芹菜总黄酮。0012本发明的另一目的在于提供一种芹菜总黄酮在抗肿瘤产品中的应用。0013本发明制备的芹菜总黄酮的药理活性通过以下药理实验得到了验证。00141、实验目的通过体外实验研究芹菜总黄酮组分的抗肿瘤作用。00152、实验方法采用MTT法观察芹菜总黄酮体外对人肺癌（A549和人大肠癌（HT29）细胞系的生长抑制率。00163、实验步骤（1）选用人肺癌（A549或人大肠癌（HT29）细胞系对数期细胞，用03的胰蛋白酶分解细胞后，用含10胎牛血清的1640培养液中配成单个细。
10、胞悬浮液，接种到96孔培养板中，每孔200L，置37，5CO2的条件下培养48小时，倒置显微镜下观察。（2）设置实验组和对照组，实验组换新的含不同浓度芹菜总黄酮培养基（芹菜总黄酮提取物的浓度为151、056、021、008、00020MG/ML），对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设3组平行孔，置37，5CO2的条件下培养24天，离心（1000转，5MIN），弃去上清液。（3）每孔加入100L新鲜配置的含015MG/MLMTT的无血清培养基。37继续培养3H。小心弃去上清液，并加入200LDMSO，用微型超声振荡器混匀后，在酶标仪上以实验波长为570NM测定光密度值。并计算不同药剂量对肿瘤细。
11、胞的抑制率，求出IC50。结果见表1和表2。0017肿瘤细胞抑制率（1OD实验/OD对照）1004、实验结果表1芹菜总黄酮对人肺癌细胞（A549）的影响说明书CN104173397A3/4页5表2芹菜总黄酮对人大肠癌细胞（HT29）的影响5、实验结论由表1和表2可知芹菜总黄酮提取物对人肺癌（A549和人大肠癌（HT29）细胞系有明显的生长抑制作用，IC50分别为8017G/ML和7331G/ML。其可在抗肿瘤产品中得到应用。0018本发明所制备的芹菜总黄酮提取物活性成分与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂或辅剂结合，制成适合人或动物适合的剂型。0019下面将结合具体实施方式进一步说明本发。
12、明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。0020具体实施方式实施例1芹菜总黄酮的提取以新鲜野生芹菜为原料，清水清洗干净，将其粉碎，取2KG置于提取器中，并加入1L、50的乙醇，超声提取时间为50MIN，提取温度为60，超声波提取功率为20KHZ，冷却抽滤，滤渣超声提取2次，合并3次滤液，减压浓缩至原体积的1/4，并将其移至分液漏斗中，加入浓缩液3倍的石油醚、3倍的乙酸乙酯混合溶剂萃取，取下层，回收试剂，冷冻干燥得到芹菜总黄酮。经UV检测，得到提取物中总黄酮的含量为8478，芹菜总黄酮的提取率为5342。0021实施例2芹菜总黄酮的提取以新鲜野生芹菜为原料，清水清洗干净，将其粉碎，取2。
13、KG置于提取器中，并加入3L、60的乙醇，超声提取时间为70MIN，提取温度为70，超声波提取功率为60KHZ，冷却抽滤，滤渣超声提取2次，合并3次滤液，减压浓缩至原体积的1/3，并将其移至分液漏斗中，加入浓缩液4倍的石油醚、4倍的乙酸乙酯混合溶剂萃取，取下层，回收试剂，冷冻干燥得到芹菜说明书CN104173397A4/4页6总黄酮。经UV检测，得到提取物中总黄酮的含量为8598，芹菜总黄酮的提取率为542。0022实施例3芹菜总黄酮的提取以新鲜野生芹菜为原料，清水清洗干净，将其粉碎，取2KG置于提取器中，并加入5L、70的乙醇，超声提取时间为90MIN，提取温度为75，超声波提取功率为80KHZ，冷却抽滤，滤渣超声提取2次，合并3次滤液，减压浓缩至原体积的1/2，并将其移至分液漏斗中，加入浓缩液5倍的石油醚、6倍的乙酸乙酯混合溶剂萃取，取下层，回收试剂，冷冻干燥得到芹菜总黄酮。经UV检测，得到提取物中总黄酮的含量为8608，芹菜总黄酮的提取率为5489。0023实施例4芹菜总黄酮制成注射剂在制得的芹菜总黄酮活性成分中加入水、乙醇或它们的混合物作为溶剂，并加入卵磷脂作为增溶剂，醋酸盐作为PH调剂剂，葡萄糖作为渗透压调节剂即可制成注射剂。0024实施例5芹菜总黄酮制成冻干粉针剂在制得的芹菜总黄酮活性成分中加入甘露醇、葡萄糖作为支撑剂，制成冻干粉针剂。说明书CN104173397A。