基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统及应用.pdf

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1、10申请公布号CN104212778A43申请公布日20141217CN104212778A21申请号201410299205422申请日20140626C12N9/22200601C12N15/8520060171申请人绍兴市人民医院地址312000浙江省绍兴市越城区中兴北路568号72发明人宋春娇茹国美郎娟郭艳张林74专利代理机构绍兴市越兴专利事务所33220代理人王余粮54发明名称基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统及应用57摘要本发明涉及基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统及应用，由核酸酶TALEN和PMD18载体组成，核酸酶TALEN为剪切目的基因靶序列的转录激活子样。

2、效应因子，TALEN由识别所述靶序列5端的核酸酶TALENL和识别所述靶序列3端的核酸酶TALENR组成；PMD18载体为插入人类AR定点突变基因的PMD18同源重组模板质粒，PMD18载体由靶基因的相应上下游序列和嘌呤霉素筛选标记组成。本发明使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用PMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编辑；采用导入同源序列以重新编辑DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化筛选过程中的人工劳动。51INTCL权利要求书2页说明书8页序列表1页附图7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书8页序列表1页附图7页1。

3、0申请公布号CN104212778ACN104212778A1/2页21一种基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统，其特征在于由核酸酶TALEN和PMD18载体组成，所述核酸酶TALEN为剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子，TALEN由识别所述靶序列5端的核酸酶TALENL和识别所述靶序列3端的核酸酶TALENR组成；所述PMD18载体为插入人类AR定点突变基因的PMD18同源重组模板质粒，PMD18载体由靶基因的相应上下游序列和嘌呤霉素筛选标记组成。2如权利要求1基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统，其特征在于所述定点突变系统的定点突变方法为切割目标基因组所形成的DNA断。

4、裂位点通过同源重组修复，将一对TALEN质粒和携带同源重组基因的质粒共同转染受体细胞，TALEN质粒表达的蛋白会在受体细胞基因组TALEN靶点的位置上切开一个口；外源基因会在切口处同源重组入受体基因组；所述的目标基因为人类雄激素受体AR基因。3一种基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于包括细胞株的构建和定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用；所述细胞株的构建方法如下对转染后的受体细胞进行稀释培养，药物筛选，获得细胞克隆，鉴定外源基因在受体细胞基因组上整合的情况，挑选出符合整合位置要求的阳性细胞克隆；所述定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR。

5、基因的应用为采用权利要求2所述的定点突变系统为将相应质粒转入人类正常前列腺细胞系中，准确识别人类AR基因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳定细胞株可以稳定传代。4如权利要求3所述基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于所述构建的细胞株为细胞株RWPEARKO，所述细胞株为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，不表达AR蛋白。5如权利要求4所述基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALENL和核酸酶TALENR；所述PMD18载体包括PMD18载体的第2外显子上游的同源左臂序列核苷酸和PMD18载体。

6、的第2外显子下游的同源右臂序列核苷酸。6如权利要求3所述基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于所述构建的细胞株为细胞株RWPEE872Q，所述细胞株RWPEE872Q为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，稳定表达第872位氨基酸残基由谷氨酸突变为谷氨酰胺的AR蛋白。7如权利要求3所述基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于所述构建的细胞株为细胞株RWPEH874Y，所述细胞株RWPEH874Y为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，稳定表达第874位氨基酸残基由组氨酸突变为酪氨酸的AR蛋白。8如权利要求3所述基于TALEN和PMD。

7、18载体的定点突变系统的应用，其特征在于所述构建的细胞株为细胞株RWPET877A，所述细胞株RWPET877A为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸的AR蛋白。9如权利要求3所述基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于所述构建的细胞株为细胞株RWPET877S，所述细胞株RWPET877S为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丝氨酸的AR蛋白。10如权利要求3所述基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于所述构建的细胞株为细胞株RWPEM88。

8、6I，所述细胞株RWPEM886I为人正常前列腺离体细权利要求书CN104212778A2/2页3胞系RWPE1改造的细胞株，稳定表达第886位氨基酸残基由蛋氨酸突变为异亮氨酸的AR蛋白。11如权利要求610任一权利要求所述基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALENMUTL和核酸酶TALENMUTR；所述PMD18载体包括PMD18载体的携带点突变位点的同源左臂序列核苷酸和PMD18载体的第8外显子下游的同源右臂序列核苷酸。12如权利要求610任一权利要求所述基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于所述人细胞株转。

9、入的PMD18载体含有抗嘌呤霉素的基因，能将嘌呤霉素抗性基因带入基因组，从而表达抗嘌呤霉素的蛋白。权利要求书CN104212778A1/8页4基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统及应用技术领域0001本发明涉及生物技术领域，特别是涉及基于TALEN和PMD18载体的人类AR基因定点突变系统及其基因组水平定点突变系统的应用。背景技术0002基因组靶向修饰是近年来生命科学研究的热点之一，特别是在基因治疗人类疾病方面，基因组靶向修饰具有广阔的应用前景。通过转基因或者基因敲除等操作改变基因的遗传组成，获得满足各种需要的基因工程工具。传统较常用的转基因方法为质粒稳定转染法、反转录病毒携带法和同源。

10、重组法。但质粒转染稳定筛选的插入位点随机，且需要抗生素维持，容易导致非正常的细胞表型；而反转录病毒携带目的基因的效率虽高，但是插入位点不确定，影响其它内源基因的表达，限制了该方法的应用；另外，同源重组法虽然可以定点插入，但是成功率很低（重组概率为106107）。0003目前，基因组工程学中的三大利器为ZFN（ZINCFINGERNUCLEASES）、TALEN（TRANSCRIPTIONACTIVATORLIKEEFFECTORNUCLEASE）和CRISPR/CAS9。0004ZFN是指锌指蛋白，是转录因子，每个模块识别34个碱基序列，将这些模块混合搭配，可以靶定任何序列，然后，通过C末端的。

11、FOKI核酸内切酶结构域可以切断双链DNA分子。SANGAMO生物科学公司和SIGMAALDRICH公司已经将ZFN技术商业化，推出COMPOZRZFN平台。但是，由于锌指蛋白之间存在相互作用，锌指模块与DNA序列之间没有一个简单的对应关系，所以以锌指蛋白为基础设计针对序列特异性DNA结合蛋白依然是个难题，并且花费昂贵，经常要做大规模的筛选，构建过程长达几周至数月。0005CRISPR/CAS9系统是由短的向导RNA介导，CAS9核酸酶在特定的双链DNA位点上产生断裂。CRISPR/CAS可通过添加多个向导RNA而实现多重编辑。然而，由于向导RNA序列比ZFN或TALEN所靶定的序列短，致使脱。

12、靶效应高。但CHURCH最近发现，通过利用CAS9的一种突变形式（只切割单链DNA）和两个紧挨着的向导RNA，有可能大大提高系统的切割位点保真性，降低脱靶效应。0006TALEN技术是一种崭新的分子生物学工具。TALEN是转录激活样效应因子，来源于黄单胞杆菌。利用TALEN蛋白的核酸结合结构域的氨基酸序列与核酸序列有恒定的对应关系，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，再通过添加非特异内切酶FOKI结构域，TALEN蛋白在理论上可以靶向切割任意基因组DNA双链。TALEN蛋白中DNA结合域为高度保守的重复单元，每个重复单元含有34个氨基酸，除了第12和13位氨基酸变化外，其它氨基酸都是相。

13、同的，这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基（REPEATVARIABLEDIRESIDUES，RVD），与碱基识别相关。TALEN识别DNA的机制在于每个重复序列的RVD可以特异识别DNA的1个碱基，HD特异识别C碱基，NI识别A碱基，NN识别G碱基，NG识别T碱基。另外，通过对天然TALEN的研究发现，TALEN蛋白框架固定识别1个T碱基，所以TALEN的识别序列总是以T碱基开始。0007在真核细胞内，TALEN切割的双链DNA，可以激活两条保守的DNA修复通路。非同源说明书CN104212778A2/8页5末端连接修复（NONHOMOLOGOUSENDJOINING，NHEJ）。

14、，细胞基本上磨平断裂DNA的两端，再将其彼此拉近，将断裂的染色体重新连接，这个过程往往产生移码，或者在断裂位点引进小片段插入或删除，影响基因功能或产生基因敲除效应。同源指导修复（HOMOLOGYDIRECTEDREPAIR，HDR）是指利用相似序列的DNA供体模板，代替断裂点周围的DNA序列，从而实现特定突变或导入外源DNA序列的目的。在本发明专利中，采用携带同源模板的PMD18载体共同转染细胞系的方法，使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用PMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编辑。0008TALEN技术可以广泛的应用于基因组编辑的各个方面细胞水平的基因敲除，定点突。

15、变，结构域缺失，定点整合等等，在疾病治疗领域具有广泛的应用前景。目前TALEN技术主要的缺陷是效率相对较低，一般在520，无法直接获取100编辑的细胞，只能通过挑选阳性的单克隆细胞，扩增成为稳定株。在本发明专利中，采用导入同源序列以重新编辑DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化筛选过程中的人工劳动。发明内容0009基于此，本发明的目的是提供一种基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统及应用，采用携带同源模板的PMD18载体共同转染细胞系的方法，使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用PMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编辑；采用导入同源序列以重新编辑。

16、DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化筛选过程中的人工劳动。0010为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的一种基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统，由核酸酶TALEN和PMD18载体组成，所述核酸酶TALEN为剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子，TALEN由识别所述靶序列5端的核酸酶TALENL和识别所述靶序列3端的核酸酶TALENR组成；所述PMD18载体为插入人类AR定点突变基因的PMD18同源重组模板质粒，PMD18载体由靶基因的相应上下游序列和嘌呤霉素筛选标记组成。0011所述定点突变系统的定点突变方法为切割目标基因组所形成的DNA断裂位点通过同源重。

17、组修复，将一对TALEN质粒和携带同源重组基因的质粒共同转染受体细胞，TALEN质粒表达的蛋白会在受体细胞基因组TALEN靶点的位置上切开一个口；外源基因会在切口处同源重组入受体基因组；所述的目标基因为人类雄激素受体AR基因。0012一种基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统的应用，包括细胞株的构建和定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用，所述细胞株的构建方法如下对转染后的受体细胞进行稀释培养，药物筛选，获得细胞克隆，鉴定外源基因在受体细胞基因组上整合的情况，挑选出符合整合位置要求的阳性细胞克隆；所述定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用为采用权利。

18、要求2所述的定点突变系统为将相应质粒转入人类正常前列腺细胞系中，准确识别人类AR基因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳定细胞株可以稳定传代。0013所述构建的细胞株为细胞株RWPEARKO，所述细胞株为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，不表达AR蛋白。0014所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALENL和核酸酶TALENR；所述PMD18载体包括说明书CN104212778A3/8页6PMD18载体的第2外显子上游的同源左臂序列核苷酸和PMD18载体的第2外显子下游的同源右臂序列核苷酸。0015所述构建的细胞株为细胞株RWPEE872Q，所述细胞株RWPEE872Q为人正。

19、常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，稳定表达第872位氨基酸残基由谷氨酸突变为谷氨酰胺的AR蛋白。0016所述构建的细胞株为细胞株RWPEH874Y，所述细胞株RWPEH874Y为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，稳定表达第874位氨基酸残基由组氨酸突变为酪氨酸的AR蛋白。0017所述构建的细胞株为细胞株RWPET877A，所述细胞株RWPET877A为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸的AR蛋白。0018所述构建的细胞株为细胞株RWPET877S，所述细胞株RWPET877S为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的。

20、细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丝氨酸的AR蛋白。0019所述构建的细胞株为细胞株RWPEM886I，所述细胞株RWPEM886I为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，稳定表达第886位氨基酸残基由蛋氨酸突变为异亮氨酸的AR蛋白。0020所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALENMUTL和核酸酶TALENMUTR；所述PMD18载体包括PMD18载体的携带点突变位点的同源左臂序列核苷酸和PMD18载体的第8外显子下游的同源右臂序列核苷酸。0021所述人细胞株转染的PMD18载体含有抗嘌呤霉素的基因，能将嘌呤霉素抗性基因带入基因组，从而表达抗嘌呤霉素的蛋白。0022本发。

21、明的有益效果如下本发明基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统及应用，由剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN和插入人类AR定点突变基因的PMD18同源重组模板质粒组成，并将该相应质粒转染入人类正常前列腺细胞系中，获得稳定细胞株，表达点突变的AR。该系统能够准确识别人类AR基因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳定细胞株可以稳定传代，遗传背景清晰，准确表达定点突变的AR。0023本发明采用携带同源模板的PMD18载体共同转染细胞系的方法，使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用PMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编辑；采用导入同源序列以。

22、重新编辑DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化筛选过程中的人工劳动。附图说明0024图1为人类雄激素受体AR蛋白的结构示意图和MRNA的结构示意图其中，深色框显示AR蛋白的结构域，包括转录激活区、DNA结合区、铰链区和配体结合区，及各自对应的外显子；黑色框显示Q重复区，为富含谷氨酰胺残基的区域；箭头标识突变位点；图2为人类雄激素受体AR基因的序列图，AR基因由8个外显子和7个内含子组成，下划线的序列为外显子序列；框出的序列为TALEN的识别位点；箭头指示出点突变的目标碱说明书CN104212778A4/8页7基和本发明人工改造的替换碱基；其他序列已经省略；图3为PMD18载体骨架。

23、的示意图；图4为TALEN识别序列的上游（左）同源臂序列；图5为TALEN识别序列的下游（右）同源臂序列；图6为TALENMUT1E872Q识别序列上游的同源臂序列，带入突变体MUT1的突变位点G/C；图7为TALENMUT2H874Y识别序列上游的同源臂序列，带入突变体MUT2的突变位点C/T；图8为TALENMUT3T877A识别序列上游的同源臂序列，带入突变体MUT3的突变位点A/G；图9为TALENMUT4T877S识别序列上游的同源臂序列，带入突变体MUT4的突变位点A/T；图10为TALENMUT5M886I识别序列上游的同源臂序列，带入突变体MUT5的突变位点G/T；图11为TA。

24、LENMUT识别序列下游的同源臂序列；图12为TALEN识别位点的上下游同源臂扩增电泳结果，TALENMUT识别位点的上游5种同源臂，分别带入人类雄激素受体AR基因的5种定点突变，和TALENMUT识别位点下游的同源臂的扩增电泳图，M为DL2000，自上而下的条带大小分别为2000BP、1000BP、750BP、500BP、250BP和100BP。具体实施方式0025下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。0026本发明中基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统，由核酸酶TALEN和PMD18载体组成，核酸酶TALEN为剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因。

25、子，TALEN由识别所述靶序列5端的核酸酶TALENL和识别所述靶序列3端的核酸酶TALENR组成；PMD18载体为插入人类AR定点突变基因的PMD18同源重组模板质粒，PMD18载体由靶基因的相应上下游序列和嘌呤霉素筛选标记组成。0027定点突变系统的定点突变方法为切割目标基因组所形成的DNA断裂位点通过同源重组修复，将一对TALEN质粒和携带同源重组基因的质粒共同转染受体细胞，TALEN质粒表达的蛋白会在受体细胞基因组TALEN靶点的位置上切开一个口；外源基因会在切口处同源重组入受体基因组；目标基因为人类雄激素受体AR基因，所述的DNA序列为核苷酸序列。0028本发明基于TALEN和PMD。

26、18载体的定点突变系统的应用，包括细胞株的构建和定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用，所述细胞株的构建方法如下对转染后的受体细胞进行稀释培养，药物筛选，获得细胞克隆，鉴定外源基因在受体细胞基因组上整合的情况，挑选出符合整合位置要求的阳性细胞克隆；本发明定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用为采用权利要求2所述的定点突变系统为将相应质粒转入人类正常前列腺细胞系中，准确识别人类AR基因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳定细胞株可以稳定传代。说明书CN104212778A5/8页80029本发明中构建的细胞株为细胞株RWPEARKO，所述细胞株细。

27、胞株为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，不表达AR蛋白。0030本发明中核酸酶TALEN包括核酸酶TALENL和核酸酶TALENR，核酸酶TALENL识别序列如SEQIDNO1所示，核酸酶TALENR识别序列如SEQIDNO2所示；PMD18载体包括PMD18载体的第2外显子上游的同源左臂序列核苷酸和PMD18载体的第2外显子下游的同源右臂序列核苷酸，PMD18载体的第2外显子上游的同源左臂序列如图4所示核苷酸，PMD18载体的第2外显子下游的同源右臂序列如图5所示核苷酸。0031本发明中构建的细胞株为细胞株RWPEE872Q，细胞株RWPEE872Q为人正常前列腺离体细胞系RWP。

28、E1改造的细胞株，稳定表达第872位氨基酸残基由谷氨酸突变为谷氨酰胺的AR蛋白。0032本发明中构建的细胞株为细胞株RWPEH874Y，细胞株RWPEH874Y为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，稳定表达第874位氨基酸残基由组氨酸突变为酪氨酸的AR蛋白。0033本发明中构建的细胞株为细胞株RWPET877A，细胞株RWPET877A为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸的AR蛋白。0034本发明中构建的细胞株为细胞株RWPET877S，细胞株RWPET877S为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，稳定表达第877。

29、位氨基酸残基由苏氨酸突变为丝氨酸的AR蛋白。0035本发明中构建的细胞株为细胞株RWPEM886I，细胞株RWPEM886I为人正常前列腺离体细胞系RWPE1改造的细胞株，稳定表达第886位氨基酸残基由蛋氨酸突变为异亮氨酸的AR蛋白。0036本发明中核酸酶TALEN包括核酸酶TALENMUTL和核酸酶TALENMUTR，核酸酶TALENMUTL识别序列如SEQIDNO3所示，核酸酶TALENMUTR识别序列如SEQIDNO4所示；PMD18载体包括PMD18载体的携带点突变位点的同源左臂序列核苷酸和PMD18载体的第8外显子下游的同源右臂序列核苷酸，PMD18载体的携带点突变位点的同源左臂序列。

30、如图611所示核苷酸，PMD18载体的第8外显子下游的的同源右臂序列如图12所示核苷酸。0037本发明中人细胞株转入的PMD18载体含有抗嘌呤霉素的基因，能将嘌呤霉素抗性基因带入基因组，从而表达抗嘌呤霉素的蛋白。0038本发明的第一方面，提供2对剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN质粒，分别在人类AR基因的2个位点切断DNA双链，造成定点插入外源同源重组序列的位点。其中，TALENL的识别序列如SEQIDNO1所示，TALENR的识别序列如SEQIDNO2所示。TALENMUTL的识别序列如SEQIDNO3所示，TALENMUTR的识别序列如SEQIDNO4所示。0039本。

31、发明的第二方面，提供5种定点改造人类AR基因的同源重组质粒，质粒的骨架为PMD18载体，带有嘌呤霉素抗性基因。定点改造的人类AR基因序列如图611所示，扩增同源序列的引物如SEQIDNO919所示。0040进一步，提供AR敲除的同源臂扩增引物如SEQIDNO58所示。说明书CN104212778A6/8页90041本发明的第三方面，提供一种构建稳定表达人类AR点突变体的细胞株的方法，该细胞株的构建方法使用上述2对TALEN质粒中的一对，分别与5种同源重组模板PMD18质粒组合。用脂质体包裹质粒混合物转染人类正常前列腺细胞系RWPE1，嘌呤霉素筛选出稳定整合点突变AR基因的细胞株，并传代、冻存、。

32、建系。0042本发明的第四方面，采用上述方法构建的5种细胞株RWPEE872Q，RWPEH874Y，RWPET877A，RWPET877S和RWPEM886I。遗传背景清楚，可以稳定传代，点突变AR表达稳定，有嘌呤霉素抗性。0043具体操作过程按照下面步骤进行（1）根据需整合到受体细胞基因组上的位置而设计出识别特异序列的TALEN；（2）根据设计出的TALEN靶点序列构建TALEN质粒，同时，构建外源基因质粒；（3）将TALEN质粒和外源基因共同转染受体细胞，TALEN质粒表达的蛋白会在受体细胞基因组TALEN靶点的位置上切开一个口；外源基因会在切口处整合进入受体基因组；（4）对转染后的受体细。

33、胞进行稀释培养，嘌呤霉素筛选，获得细胞克隆，鉴定外源基因在受体细胞基因组上整合的情况，挑选出符合整合要求的阳性细胞克隆。0044（5）所述的转染后得到的细胞克隆采用核酸PCR技术或测序进行鉴定，对外源基因在受体细胞基因组上整合的细胞克隆传达、冻存、建系。0045本发明实施例中未注明具体条件的实验方法。通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。涉及的化学试剂盒、生物制品，如未特殊说明，表明它们均为商品化产品。0046TALEN试剂盒购自上海斯丹赛生物技术有限公司。用于原代细胞/普通细胞/肿瘤细胞基因打靶的专用TALEN载体包括10。

34、个，左右臂各5个，它们均含有CMV启动子，NLS，N端，C端，FOKI，嘌呤霉素抗性基因（仅在左臂）等基本结构。载体间的不同之处在于TALEN识别序列的最后一个碱基的不同，分为A/T/C/G四种，此外，包括一个带有EGFP荧光标记的TALEN右臂。左右臂骨架的FOKI序列不同，在TALEN作用时，FOKI酶会形成一个异源二聚体的结构，大大增加TALEN切割的效率。0047PMD18载体购自上海斯丹赛生物技术有限公司，经本发明发明人改建插入左右同源重组臂。0048实施例中使用的细胞为人类正常前列腺细胞系RWPE1，购自ATCC。0049实施例1人类雄激素受体基因AR序列分析从NCBI数据库下载人。

35、类雄激素受体基因AR的序列（NG_0090142）。序列分析显示该基因包括8个外显子，7个内含子，如图2所示。按照基因敲除的一般原则，该基因的第二和第三外显子为理想的敲除靶标位点，本实施例以第二外显子为敲除靶序列。0050序列的设计根据人类雄激素受体基因AR的序列特征，我们选择第二外显子上的序列作为TALEN作用的靶序列，人类雄激素受体基因AR第二外显子核苷酸序列如图2所示，根据TALEN原理将结构为T（N1118）的核苷酸序列SEQIDNO1和SEQIDNO2作为TALEN识别的靶位点，其中N为A，G，T和C中的任一碱基。0051表达载体的构建说明书CN104212778A7/8页10按照上。

36、海斯丹赛生物技术有限公司提供的试剂盒说明书构建核酸酶TALEN左右臂表达载体。转化大肠杆菌感受态细胞，扩增后送测序，选择表达正确TALENL和TALENR的大肠杆菌克隆进行大量扩增，提取质粒，用于后续试验。0052同源重组模板质粒PMD18的改建按照人类雄激素受体AR基因的序列（如图2所示），在TALEN打靶位点的上下游5001000BP的距离内设计上下游同源臂的扩增引物，序列如SEQIDNO58所示。0053高保真PFU酶扩增出的上游（左同源臂）片段（产物如图4所示，PCR扩增后的电泳结果如图12所示）经BAMHI和ECORI双酶切后，插入PMD18骨架载体中；下游（右同源臂）片段（产物如图。

37、5所示，PCR扩增后的电泳结果如图12所示）经HINDIII和XBAI双酶切后，插入PMD18骨架载体中。经连接、转化、测序验证得到正确插入上下游同源臂的PMD18质粒。大量扩增后，提取质粒，用于后续试验。0054建立敲除人类雄激素受体AR的前列腺细胞株RWPEARKO细胞的培养人类正常前列腺细胞系RWPE1购自ATCC，用含有10胎牛血清的1640培养基于37，5CO2孵箱中培养。将对数生长期的细胞用胰酶消化于转染前一天铺6孔板，使其转染时汇合率达到80。0055质粒转染按照FUGENE6说明书进行操作。TALENL质粒和TALENR质粒每6孔板各2UG，PMD18质粒每6孔板05UG。另外。

38、，按质粒脂质体13比例预混脂质体混合物。0056嘌呤霉素筛选转染后24小时，换含05UG/ML嘌呤霉素的完全培养液筛选34天，待对照组细胞全部死亡，稀释传代于10CM培养皿中培养，使细胞之间保持适当距离，便于形成单个克隆，培养时可加嘌呤霉素也可不加嘌呤霉素，因为同源重组序列已经携带嘌呤霉素抗性基因至基因组中，可以稳定遗传。0057PCR扩增及测序鉴定提取细胞基因组DNA，采用同源臂扩增引物SEQIDNO5和SEQIDNO8进行PCR扩增验证和测序验证。实施例2实施例2与实施例1的不同之处在于实施例2的目的是构建5种人类雄激素受体AR点突变体，而实施例1的目的是敲除AR，使其失活；基于实施例2与。

39、实施例1的目的不同，TALENL和TALENR的识别位点在人类雄激素受体AR基因的第8外显子下游，如图2所示；基于实施例2中的点突变位点均位于AR基因的第8外显子，故它们可以共用同源重组右臂，如图11所示，由引物SEQIDNO18和SEQIDNO19扩增；5种AR点突变体均为人工设计合成引物带入突变位点，突变位点均为下游引物（如SEQIDNO10、12、14、15、17所示）带入，产物如图610所示。并且，上下游同源臂（左右同源臂）之间带有嘌呤霉素抗性基因。0058本发明基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统及其应用，由剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN和插入人类A。

40、R定点突变基因的PMD18同源重组模板质粒组成，并将该相应质粒转入人类正常前列腺细胞系中，获得稳定细胞株，表达点突变的AR。该系统能够准确识别人类AR基因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳定细胞株可以稳定传代，遗传背景清晰，准确表达定点突变的AR。0059本发明采用携带同源模板的PMD18载体共同转染细胞系的方法，使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用PMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编说明书CN104212778A108/8页11辑；采用导入同源序列以重新编辑DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化筛选过程中的人工劳动。0060上述实施例。

41、仅用于解释说明本发明的发明构思，而非对本发明权利保护的限定，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应落入本发明的保护范围。说明书CN104212778A111/1页12SEQIDNO1TALENL识别序列5CTGGGTGTCACTATGGA3SEQIDNO2TALENR识别序列5GAAGAAGACCTTGCAGC3SEQIDNO3TALENMUTL识别序列5TAAATACGTACATACAT3SEQIDNO4TALENMUTR识别序列5TTGGGGATTTCTATATGT3SEQIDNO5同源臂引物L上5GGAATTCTGAGAAGACAATAGGGTAATG3SEQIDNO6同源臂引物L。

42、下5CGGGATCCTCAGAAGTCACCTTGTCTAAC3SEQIDNO7同源臂引物R上5GCTCTAGAGCCCACATTCTGCAGTAG3SEQIDNO8同源臂引物R下5CCCAAGCTTAGTATCAGTACATTCGTGGTG3SEQIDNO9MUT1上5GGAATTCCAGACCTGGATGTTTTTC3SEQIDNO10MUT1下5CGGGATCCGTCTCGCAATCTGTAGGG3SEQIDNO11MUT2上5GGAATTCCAGACCTGGATGTTTTTC3SEQIDNO12MUT2下5CGGGATCCACAGCTCTCTCGCAATCT3SEQIDNO13MUT3。

43、4上5GGAATTCCAGACCTGGATGTTTTTC3SEQIDNO14MUT3G下5CGGGATCCCGAACTGATGCAGCTCTCTC3SEQIDNO15MUT4T下5CGGGATCCAGAACTGATGCAGCTCTCTC3SEQIDNO16MUT5上5GGAATTCCAGACCTGGATGTTTTTC3SEQIDNO17MUT5下5CGGGATCCTATGTGTGACTTGATTAGCAG3SEQIDNO18MUTR上5GCTCTAGAGCTTGGCTGTTCTCCTGCTTAG3SEQIDNO19MUTR下5CCCAAGCTTGAGCATTTGCAGGGTTTCTG3序列表CN104212778A121/7页13图1说明书附图CN104212778A132/7页14说明书附图CN104212778A143/7页15说明书附图CN104212778A154/7页16图2图3图4说明书附图CN104212778A165/7页17图5图6图7图8图9说明书附图CN104212778A176/7页18图10图11说明书附图CN104212778A187/7页19图12说明书附图CN104212778A19。