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1、10申请公布号CN104212783A43申请公布日20141217CN104212783A21申请号201410272769922申请日20140619201410263023120140613CNC12N9/52200601C12R1/0120060171申请人浙江大学地址310027浙江省杭州市西湖区浙大路38号72发明人华跃进王云光王梁燕74专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司33200代理人林松海54发明名称蛋白酶57摘要本发明公开了一种蛋白酶。所述蛋白酶的核心蛋白序列为SEQIDNO1所示；其底物的特异性序列为ELXGXR其中X为任意一种必需氨基酸，切割位置在第二和第三个氨基酸残。
2、基之间；酶切反应的最适温度在3540之间，65时，仍有活性。本发明中涉及的蛋白酶酶切序列特异性高，耐热性较好。66本国优先权数据51INTCL权利要求书1页说明书3页序列表2页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页序列表2页附图2页10申请公布号CN104212783ACN104212783A1/1页21一种蛋白酶,其特征在于它具有锌指蛋白酶结构域、螺旋转角螺旋结构域和GAF结构域，所述的蛋白酶全酶和其独立结构锌指蛋白酶结构域具有同等的蛋白酶活性。2根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于所述锌指蛋白酶结构域的核心蛋白序列如SEQIDNO1所示。3根据权。
3、利要求1所述的蛋白酶，其特征在于所述蛋白酶的底物之一为耐辐射奇球菌DEINOCOCCUSRADIODURANS，ATCCNO13939的转录因子DDROGENEID1798752NP_2962941。4根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于所述蛋白酶的底物酶切特异性序列是ELXGXR，其中X为任意一种必需氨基酸，切割位置在第二和第三个氨基酸残基之间。5根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于所述蛋白酶的反应缓冲液含100200MMNACL、1050MMTRISHCL80、1MMDTT、2050MMMNCL2。6根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于所述蛋白酶的酶活性温度范围为465。7根据权利要。
4、求1所述的蛋白酶，其特征在于所述蛋白酶的最适酶活性温度范围为3540。8根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于所述的蛋白酶来源于耐辐射奇球菌。权利要求书CN104212783A1/3页3蛋白酶技术领域0001本发明涉及一种新发现的耐辐射奇球菌蛋白酶，尤其涉及该蛋白酶的酶切底物、底物酶切特异性序列、活性反应体系、最适温度与耐温性。背景技术0002蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，可以催化蛋白质中肽键的水解。蛋白酶广泛存在于动物、植物和微生物中。到目前为止，国际市场上商品蛋白酶100种以上。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要来自微生物，利用枯草杆菌、酵母、霉菌、大肠杆菌等微生物提取制。
5、备。随着蛋白酶研究的深入，它的工业应用越来越引起了人们的广泛关注。0003蛋白酶已广泛应用在毛皮、皮革、丝绸、医药、食品、酿造、石油钻井等领域。利用蛋白酶，皮革工业的脱毛软化，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，例如用于消化不良、支气管炎、脉管炎等症状的治疗。加入蛋白酶的洗衣粉能高效去除衣物上的血渍和蛋白污物。另外，蛋白酶广泛应用于生化分子实验，作为蛋白质的手术刀，是生命科学研究不可或缺的。0004耐辐射奇球菌是一种极端环境微生物，以对电离辐射、紫外射线、干燥和氧化压力等极端条件表现极强抗性而著称。它的这种超强抗性有一部分归功于其体内PP。
6、RI基因（基因名DR_0167，NCBIGENEID1798483）。它是在基因损伤修复中起整体调控作用。PPRI基因表达的产物PPRI蛋白（NCBIGI15805204）由328个氨基酸组成，预测含3个功能结构域，分别是锌指蛋白酶结构域，螺旋转角螺旋结构域，GAF结构域。但是至今为止，PPRI的蛋白酶活性和酶底物从未被发现。发明内容0005为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种蛋白酶及其酶切特异性底物。0006一种蛋白酶,具有锌指蛋白酶结构域、螺旋转角螺旋结构域和GAF结构域，所述的蛋白酶全酶和单独的锌指蛋白酶结构域均具有蛋白酶活性。0007所述蛋白酶的核心蛋白序列为SEQIDNO1。
7、所示。0008所述蛋白酶的底物为耐辐射奇球菌DEINOCOCCUSRADIODURANS，ATCCNO13939的DDROGENEID1798752NP_2962941。0009所述蛋白酶的底物酶切特异性序列是ELXGXR其中X为任意一种必需氨基酸，切割位置在第二和第三个氨基酸残基之间。0010所述蛋白酶的反应缓冲液为100200MMNACL、1050MMTRISHCL80、1MMDTT、2050MMMNCL2。0011所述蛋白酶的酶活性温度范围为465。0012所述蛋白酶的最适酶活性温度范围为3540。说明书CN104212783A2/3页40013所述的蛋白酶来源于耐辐射奇球菌。0014本。
8、发明有益效果本发明蛋白酶的酶切序列特异性较高，耐热性较好，为基础研究和基因工程等工业应用提供了良好的工具。附图说明0015图1是PPRI蛋白酶体外酶切电泳图；其中，1纯化后的DDRO蛋白；2纯化后的PPRI蛋白；3DDRO与PPRI酶切反应；4FERMENTAS预染蛋白MARKERSM0671（单位KD）。0016图2是PPRI蛋白酶体外酶切WESTERNBLOTTING检测；其中，1纯化后DDRO蛋白经WESTERNBLOTTING检测；2DDRO与PPRI酶切反应后，经WESTERNBLOTTING检测。两条带分别为DDRO蛋白和酶切后DDRO蛋白大片段。0017图3是PPRI蛋白酶的底物。
9、DDRO酶切后大片段的C端测序；其中，峰ADDRO酶切后，其小片段的分子量；峰BDDRO酶切后，其大片段的分子量；峰CDDRO蛋白的分子量。0018图4是PPRI蛋白酶的底物特异性酶切序列；其中，从左至右，从上至下，分别是PPRI蛋白与DDRO不同点突变蛋白的酶切反应。S104A，表示DDRO的第104位残基S突变成A，其它依次类推；WT，表示野生型的DDRO蛋白。0019图5是PPRI蛋白酶的酶切模型。红体标注的氨基酸残基是PPRI蛋白酶的酶切识别序列，其中X表示可变的氨基酸残基，可以是任意一种必需氨基酸。箭头所标位置是其酶切位点。具体实施方式0020以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说。
10、明。0021耐辐射奇球菌蛋白酶PPRI,具有锌指蛋白酶结构域、螺旋转角螺旋结构域和GAF结构域，所述的蛋白酶PPRI全酶和单独锌指蛋白酶结构域均具有蛋白酶活性。0022所述蛋白酶的底物为耐辐射奇球菌DEINOCOCCUSRADIODURANS，ATCCNO13939的DDROGENEID1798752NP_2962941。（图1，图2，图3，图4）所述蛋白酶的底物酶切特异性序列是ELXGXR其中X为任意一种必需氨基酸，切割位置在第二和第三个氨基酸残基之间。（图5）所述蛋白酶的反应缓冲液为100200MMNACL、1050MMTRISHCL80、1MMDTT、2050MMMNCL2。0023所述。
11、蛋白酶的酶活性温度范围为465。0024所述蛋白酶的最适酶活性最适温度范围为3540。0025本发明所用的菌株为耐辐射奇球菌（DEINOCOCCUSRADIODURANS，ATCCNO13939）,大肠杆菌表达菌株BL21DE3CHEMICALLYCOMPETENTCELL基因型FOMPTHSDSBRBMBGALDCMDE3,大肠杆菌克隆菌株TRANS5CHEMICALLYCOMPETENTCELL基因型F80LACZM15LACZYAARGFU169ENDA1RECA1HSDR17RK,MKSUPE44THI1GYRA96RELA1PHOA。说明书CN104212783A3/3页50026（。
12、1）PPRI的蛋白酶活性和底物酶切序列特异性将纯化的PPRI蛋白与其底物蛋白DDRO在反应缓冲液（150MMNACL、20MMTRISHCL80,1MMDTT、20MMMNCL2）中反应40分钟。经SDSPAGE电泳和质谱分子量大小检测，PPRI蛋白可以把DDRO酶切成两段。通过DDRO酶切位点附近氨基酸残基的点突变，获得PPRI蛋白酶切底物的特异性序列为ELRGKR、ELRGAR、ELRGER、ELAGKR、ELAGAR和ELAGER。另外，经蛋白质的C端质谱测序，可以获得切割位置在第二和第三个氨基酸残基之间。如图1，图2，图3，图4，图5所示。0027（2）PPRI蛋白酶的酶活最适温度范围。
13、和耐温性PPRI蛋白酶与底物发生酶切反应的最适温度在3540之间。在此温度范围内蛋白酶活性最高。当温度在5055之间时，蛋白酶活性仍然存在，约降低了三分之一。在65时，仍具有较弱活性。所以PPRI蛋白酶活温度范围较广，是一种耐温蛋白酶。0028实施例2（1）PPRI的蛋白酶活性和底物酶切序列特异性将纯化的PPRI蛋白与其底物蛋白DDRO在反应缓冲液（100MMNACL、30MMTRISHCL80、1MMDTT、30MMMNCL2）中反应40分钟。经SDSPAGE电泳和质谱分子量大小检测，PPRI蛋白可以把DDRO酶切成两段。通过DDRO酶切位点附近氨基酸残基的点突变，获得PPRI蛋白酶切底物的。
14、特异性序列为ELRGKR、ELRGAR、ELAGKR和ELAGAR。另外，经蛋白质的C端质谱测序，可以获得切割位置在第二和第三个氨基酸残基之间。0029（2）PPRI的蛋白酶酶活的最适温度范围和耐温性PPRI蛋白酶与底物发生酶切反应的最适温度在3540之间。在此温度范围内蛋白酶活性最高。在4时，也表现出较弱的蛋白酶活性。在65时，仍具有较弱活性。所以PPRI蛋白酶活温度范围较广，是一种耐温蛋白酶。0030实施例3（1）PPRI的蛋白酶活性和底物酶切序列特异性将纯化的PPRI蛋白与其底物蛋白DDRO在反应缓冲液（200MMNACL、20MMTRISHCL80、1MMDTT、50MMMNCL2）中。
15、反应40分钟。经SDSPAGE电泳和质谱分子量大小检测，PPRI蛋白可以把DDRO酶切成两段。通过DDRO酶切位点附近氨基酸残基的点突变，获得PPRI蛋白酶切底物的特异性序列为ELRGKR、ELRGAR、ELRGER、ELAGKR、ELAGAR和ELAGER。另外，经蛋白质的C端质谱测序，可以获得切割位置在第二和第三个氨基酸残基之间。0031（2）PPRI的蛋白酶的酶活最适温度范围和耐温性PPRI蛋白酶与底物发生酶切反应的最适温度在3540之间。在此温度范围内蛋白酶活性最高。在4时，也表现较弱的蛋白酶活性。当温度在5055之间时，蛋白酶活性仍然存在，约降低了三分之一。0032本发明实施例中所用。
16、的菌株为耐辐射奇球菌（DEINOCOCCUSRADIODURANS，ATCCNO13939），但是根据本发明的教导和启示，任何人工合成或者其他自然含有的蛋白酶以及衍生物，如具有与耐辐射奇球菌蛋白酶PPRI同源的序列和类似的结构和功能，也在本发明的保护范围之内。说明书CN104212783A1/2页6SEQUENCELISTING浙江大学蛋白酶1PATENTINVERSION351161PRTDEINOCOCCUSRADIODURANS1METPROSERALAASNVALSERPROPROCYSPROSERGLYVALARGGLY151015GLYGLYMETGLYPROLYSALALYSAL。
17、AGLUALASERLYSPROHISPRO202530GLNILEPROVALLYSLEUPROPHEVALTHRALAPROASPALALEUALA354045ALAALALYSALAARGMETARGASPLEUALAALAALATYRVALALAALA505560LEUPROGLYARGASPTHRHISSERLEUMETALAGLYVALPROGLYVAL65707580序列表CN104212783A2/2页7ASPLEULYSPHEMETPROLEUGLYTRPARGASPGLYALAPHEASPPRO859095GLUHISASNVALILELEUILEASNSERALAALAARGPROGLUARGGLN100105110ARGPHETHRLEUALAHISGLUILEGLYHISALAILELEULEUGLYASP115120125ASPASPLEULEUSERASPILEHISASPALATYRGLUGLYGLUARGLEU130135140GLUGLNVALILEGLUTHRLEUCYSASNVALALAALAALAALAILELEU145150155160MET序列表CN104212783A1/2页8图1图2图3说明书附图CN104212783A2/2页9图4图5说明书附图CN104212783A。