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1、10申请公布号CN104160846A43申请公布日20141126CN104160846A21申请号201410334010922申请日20140715CCTCCNOM201431420140703A01G1/00200601A01C1/00200601A01G7/00200601C12N1/14200601C12R1/7720060171申请人武汉市蔬菜科学研究所地址430345湖北省武汉市黄陂区武湖农业生态园市农科院72发明人吴仁锋杨绍丽74专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人张红兵54发明名称一种豇豆抗枯萎病的苗期鉴定方法57摘要本发明属于园艺作物抗病性检测领域，涉及一种豇豆。
2、抗枯萎病的苗期鉴定方法，包括豇豆种子催芽、播种与育苗；接种专用菌株的分离、培养，枯萎病菌孢子悬浮液制备；病原菌侵染；发病调查等步骤。采用菌液浸泡侵染幼苗根系方式使豇豆幼苗人工感染枯萎病菌，将豇豆种子在育苗基质中培养至二叶一心，再拔出侵染，故豇豆幼苗的长势、大小易于控制，容易拔起，保证了鉴定结果的一致性和可靠性。本发明采用了专用的指示菌株、合适的侵染时间、合适的枯萎病菌孢子悬浮液浓度，侵染效果较好，接菌均匀，发病迅速。本发明只需将长势一致的不同植株直接自然摩擦伤根后侵染病菌，操作简便、鉴定迅速、结果可靠，尤其适合大批量豇豆育种材料的枯萎病抗性鉴定。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明。
3、书6页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图2页10申请公布号CN104160846ACN104160846A1/1页21一种豇豆抗枯萎病的苗期鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤A、浸种催芽以常用栽培豇豆品种为鉴定对象，挑选籽粒饱满的豇豆品种种子，用纱布包好，在55恒温水浴锅中温汤浸种2小时进行种子消毒，再将种子放在铺有吸水纸的培养皿中，最后用33恒温处理，直至得到萌发种子；B、播种与幼苗培育将萌发的种子播种于育苗基质上进行培养，得到二叶一心的幼苗；C、豇豆枯萎病菌孢子悬浮液的制备A选择豇豆枯萎病田间典型病株，在发病植株茎基部病健交界处切取2MM2。
4、MM组织，用无菌水冲洗干净；B对上述组织用70酒精消毒处理05MIN，再用01的升汞溶液消毒051MIN，然后用无菌水冲洗3次，每次1MIN，得到消毒处理后的病组织；C将消毒处理后的病组织接入PDA平板上，置25恒温条件下培养；D当接种后的PDA平板培养基的表面即植物病组织周围长出菌落后，将该菌落转入PDA斜面培养基中，筛选得到鉴定豇豆枯萎病的指示菌即豇豆枯萎病菌FUSARIUMOXYSPORUMSCHLJWS1，送中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCCNOM2014314；E从转入菌落的PDA斜面培养基中取豇豆枯萎病菌JWS1，转入PDA平板培养基中，于25下恒温培养7天，得到培养。
5、好的豇豆枯萎病菌；F将培养好的豇豆枯萎病菌，每皿加10ML灭菌水，用灭菌的盖玻片刮取表面菌丝层，用三层纱布过滤得到分生孢子滤液，用血球计数板调整孢子浓度，得到豇豆枯萎病菌孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度为37106个/ML，优选为5106个/ML。D、病原菌侵染处理A用铲子将二叶一心的豇豆幼苗从育苗培养基质中取出，轻轻抖动，进行清洗处理，无需人为伤根，得到自然伤根幼苗；B将自然伤根后的豇豆幼苗进行枯萎病菌的侵染处理；E、发病调查分别于侵染处理后的10D、15D、20D、25D，调查侵染苗的发病状况，根据豇豆枯萎病病情分级标准确定0、1、3、5、7、9共6个发病等级，再根据该发病等级计算病情指数，最后。
6、根据该病情指数判断所述豇豆品种的豇豆枯萎病抗性分级；其中步骤B中育苗基质为蛭石和干河沙，按重量比为110混匀，加福尔马林溶液或采用高温焖晒方法消毒。步骤D的B步骤中的所述的侵染处理，是将自然伤根的豇豆幼苗放到枯萎病菌的孢子悬浮液中浸泡10MIN，取出后定植于装有灭菌培养基质的营养钵中，放置于塑料大棚中培养，控制温度为282，控制相对湿度为85或以上。2一种分离的适用于豇豆枯萎病抗性鉴定的豇豆枯萎病菌FUSARIUMOXYSPORUMSCHLJWS1，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNOM2014314。3权利要求2所述的豇豆枯萎病菌FUSARIUMOXYSPORUMSCHLJ。
7、WS1在豇豆枯萎病抗性鉴定中的应用。权利要求书CN104160846A1/6页3一种豇豆抗枯萎病的苗期鉴定方法技术领域0001本发明属于园艺作物抗病性鉴定技术领域，具体涉及一种豇豆抗枯萎病的苗期鉴定方法，与作物抗病育种中抗性材料的早期快速鉴定技术领域有关。背景技术0002豇豆学名VIGNAUNGUICULATA俗称角豆、姜豆、带豆、挂豆角，属于豆科一年生植物，主要产于热带、亚热带和温带地区。豇豆在我国栽培历史悠久，种植分布面积广，除青海和西藏外，全国各省市区均有种植。近年来，我国豇豆种植面积维持在33万公顷以上。河北、河南、江苏、浙江、安徽、四川、重庆、湖北、湖南、广西等地每年栽培面积超过1万。
8、公顷，并形成了浙江丽水、江西丰城、湖北双柳等面积超过1000公顷的大型专业化豇豆生产基地。一般以春夏栽培为主，其次是秋季栽培。由于豇豆生长于高温湿热的环境，易诱发豇豆枯萎病的发生。0003豇豆枯萎病菌FUSARIUMOXYSPORUMSCHL以菌丝体和厚垣孢子随病残体遗落在土中越冬种子也能带菌，能在土中营长时间的腐生生活。病菌借助灌溉水、农具、施肥等传播，从伤口或根冠部侵入，在维管束组织的导管中繁殖，并向上扩展。豇豆枯萎病多数从开花期开始，结荚盛期可造成植株大量枯死。初期病株下部叶片先变黄，逐渐向上发展，病叶叶脉变褐，近脉的叶肉组织变黄，终致叶片干枯、脱落，病株易被拔起。检视根部及茎基部，根部。
9、变褐腐烂，根茎维管束变红褐色至黑褐色。严重危害时，全田植株死亡，仅剩枯藤一片，相当触目。0004培育抗病品种是防治豇豆枯萎病的重要方法之一，抗性资源的获得对于抗病育种意义重大，客观、快速地评价豇豆品种枯萎病抗性的强弱是豇豆抗枯萎病育种过程中最基础、最重要的环节。目前豇豆枯萎病抗性鉴定主要是通过人工病圃鉴定和室内苗期鉴定。人工病圃鉴定被认为是最接近自然实际，最为可靠的抗性鉴定方法，在抗病育种过程中应用最为普遍。但此鉴定方法过于依赖自然发病条件，如果环境条件不适合发病或者病圃病菌分布不均匀，容易造成抗性误判，历时太长，且具有较强的季节性。豇豆苗期鉴定方法简便、迅速、容易控制外界环境条件。常用的方法。
10、为，剪根幼苗浸根法方木壬等豇豆枯萎病抗原筛选研究，华南农业大学学报，1984，545761、胚根法张衍荣等豇豆枯萎病抗病性鉴定技术研究，华南农业大学学报，2005，2632225。其中胚根法发芽率与成苗生长势的差异常造成结果不一致，不能准确反映苗期的抗性，并且胚根接种到苗期显症的周期比较长。剪根幼苗浸根法，虽然周期较短，简便可行，但剪根长短易不均匀，且剪根费时费力。两种鉴定方法均有一定的缺点，这是造成苗期鉴定结果与人工病圃鉴定存在显著差异的原因之一。因此探索一套发病迅速、育苗时间短、管理简便、适合大批量育种材料的豇豆枯萎病抗性快速鉴定方法对于评价豇豆种植材料的抗病性、培育抗病新品种、进行合理品。
11、种布局具有重要意义。发明内容说明书CN104160846A2/6页40005本发明所要解决的技术问题是提供一种豇豆抗枯萎病的苗期接种鉴定方法。该方法简便易行，所需设备较少，结果可靠，能较为准确地反映不同豇豆品种对枯萎病的抗性表现。0006实现本发明的技术方案为0007一种豇豆抗枯萎病的苗期接种鉴定方法，包括以下步骤0008A、豇豆种子催芽0009选择市售和常用栽培的豇豆品种作为鉴定对象；0010挑选籽粒饱满的豇豆品种种子，用纱布包好，在55恒温水浴锅中温汤浸种2小时，进行种子消毒，再将种子放在铺有吸水纸的培养皿中，最后33恒温处理，直至得到萌发种子。0011B、播种与幼苗培育0012将萌发的种。
12、子播种于育苗基质简称基质，配方见后，进行培养，得到二叶一心的幼苗。0013C、豇豆枯萎病菌孢子悬浮液的制备0014A选择豇豆枯萎病田间典型病株，在发病植株茎基部病健交界处切取2MM2MM组织，用无菌水冲洗干净；0015B对上述组织进行消毒处理，用70酒精消毒05MIN，再用01的升汞溶液消毒051MIN，然后用无菌水冲洗3次，每次1MIN，得到消毒处理后的病组织；0016C将消毒处理后的病组织接入PDA平板上，置25恒温条件下培养；0017D当接种后的PDA平板培养基的表面即植物病组织周围长出菌落后，将该菌落转入PDA斜面培养基中在4冰箱内贮存备用，或可长期应用，筛选得到鉴定豇豆枯萎病的指示菌。
13、即豇豆枯萎病菌JWS1，FUSARIUMOXYSPORUMSCHLJWS1，于2014年7月3日送中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCCNOM2014314；0018E从转入菌落的PDA斜面培养基中取豇豆枯萎病菌JWS1，转入PDA平板培养基中，25恒温培养7天，得到培养好的豇豆枯萎病菌；0019G将培养好的豇豆枯萎病菌，每皿加10ML灭菌水，用灭菌的盖玻片刮取表面菌丝层，用三层纱布过滤得到分生孢子滤液，用血球计数板调整孢子浓度，得到枯萎病菌孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度为37106个/ML，优选为5106个/ML。0020D、病原菌侵染处理0021A用铲子将二叶一心的幼。
14、苗从所述育苗基质中取出在提苗过程使之自然摩擦伤根，不需人工剪根来伤根轻轻提苗并抖动，进行清洗处理，无需进行伤根处理，得到自然伤根幼苗；0022B将自然伤根后的幼苗进行侵染豇豆枯萎病菌处理，放置到枯萎病菌孢子悬浮液中，浸泡10MIN得到侵染苗，然后将所述的侵染苗移植到装有消毒沙土基质的营养钵中，置于塑料大棚中培养，温度控制在282，相对湿度控制在85或以上，进行正常栽培管理，10天后调查发病情况。0023E、发病调查0024分别于侵染处理后的10D、15D、20D、25D，调查所述侵染苗的发病状况，根据豇豆枯萎病病情分级标准确定0、1、3、5、7、9共6个发病等级，再根据该发病等级计算病情指数，。
15、最说明书CN104160846A3/6页5后根据该病情指数判断所述豇豆品种的豇豆枯萎病抗性分级。0025上述育苗基质及制备方法为蛭石和干河沙按重量比为110混匀，再加入福尔马林溶液或将基质在阳光下高温焖晒消毒，得到育苗基质。0026豇豆枯萎病病情分级标准见表10027表1豇豆枯萎病分级标准00280029病情指数DI计算方式为0030病情指数级数株数/最高级数总株数100。式中为和0031上述的的豇豆枯萎病抗性分级标准如下0032按病情指数DI分别划分为，高抗HR0DI15；抗R15DI35；中等M35DI55；感S55DI75；高感HSDI75。0033本发明的试验材料的豇豆品种包括之豇28。
16、、宁豇三号、台湾七号豆角王、桂星101长豆角、雪龙888白玉豇豆、油白长豆角810以及美国无架豆和紫秋豇。0034本发明的PDA平板培养基及制备方法为去皮马铃薯200G，切成厚约2MM的片，加入1000ML水煮沸30MIN，用4层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20G和琼脂20G，加热溶解后再补足水份至1000ML；自然PH不调整，于121高压蒸汽下灭菌30MIN；之后在超净工作台上倒平板，得到PDA平板培养基。0035作为优选方案，上述的枯萎病菌孢子悬浮液孢子浓度为37106个/ML，优选为5106个/ML。0036作为优选方案，上述的浸泡豇豆枯萎病菌孢子悬浮液时间为10MIN。0037本发明相。
17、比现有技术具有以下有益效果00381、按步骤进行鉴定的方法与大田成株期接种相比，避免了气候条件不适宜、环境中其它病虫害等因素的影响，在室内进行苗期抗病性鉴定条件较易控制，鉴定周期短、操作简便、能节省大量人力物力，尤其适合大批量的豇豆材料的枯萎病抗性鉴定。00392、豇豆出苗好，根系发育完整。采用蛭石沙土做培养土吸水好，透气性强，有利于豇豆出苗整齐一致。苗期鉴定中，需要在豇豆两片真叶平展时，取出幼苗接种枯萎病菌孢子悬浮液，要求豇豆苗的根系发育良好。00403、由于将豇豆幼苗先统一在育苗基质中培养至二叶一心再进行侵染，豇豆幼苗的长势、大小易于控制，保证了鉴定结果的一致性和可靠性。00414、由于采。
18、取了合适的侵染时间、调整了枯萎病菌孢子悬浮液的浓度，因此侵染效说明书CN104160846A4/6页6果较好，接菌均匀，发病迅速。附图说明0042图1在育苗基质培养的待接菌的豇豆幼苗。0043图2接菌后在PDA培养基中豇豆枯萎病菌菌落的显微结构图。0044图3侵染处理后15D，之豇28和桂星101长豆角的抗病性鉴定结果图。图3中的A图为未接菌只接种清水的对照图3的A图的上图品种为桂星101长豆角，图3的A图的下图品种为之豇28，图3中的B为接菌处理图3的B图的上图品种为桂星101长豆角，图3的B图的下图品种为之豇28。具体实施方式0045实施例10046豇豆抗枯萎病苗期接种鉴定方法步骤如下00。
19、47A、豇豆种子消毒催芽0048选择不同类型豇豆材料作为鉴定对象豇豆的分类为常用方法，本实施例的接菌的试验品种包括之豇28、宁豇三号、台湾七号豆角王、桂星101长豆角、雪龙888白玉豇豆、油白长豆角810、美国无架豆、紫秋豇上述用于接菌品种为现有的常见栽培品种，作为抗病性鉴定试验，品种不限于此；0049挑选豇豆材料的籽粒饱满的种子，用纱布包好，在55恒温水浴锅中温汤浸种2小时，进行种子消毒，再将种子放在铺有吸水纸的培养皿中，最后33恒温处理，直至种子萌发露白。0050B、播种与幼苗培育0051将萌发的种子播种于装有育苗基质的白色盒子中，进行培养，得到二叶一心的幼苗见图1；0052育苗培养基质及。
20、制备方法为蛭石和干河沙按重量比110混匀，再加入福尔马林溶液消毒或将上述基质在阳光下高温焖晒消毒，得到育苗基质；0053播种将育苗白塑料盒尺寸为650450165MM，不限于此用质量浓度为1高锰酸钾溶液消毒；再在塑料盒内装入约10CM厚的育苗基质，浇透水；再用小耙子耙出约2CM厚的小沟将萌发的种子放在沟内，再抚平育苗基质，盖住萌发种子；0054培养是在大棚中常规管理育苗，将播种后的种子培养至二叶一心见图1，即为待接菌材料。0055C、豇豆枯萎病菌孢子悬浮液的制备0056A按照报道的柯赫氏法则进行分离鉴定，选择豇豆枯萎病田间典型病株，在发病植株茎基部病健交界处切取2MM2MM组织本发明有时称之为。
21、病组织，二者为同一组织，冲洗干净；0057B对上述病组织或称组织、病健部组织进行消毒处理用70酒精消毒05MIN，再用01的升汞溶液消毒051MIN，然后用无菌水冲洗3次，每次1MIN，得到消毒处理后的病组织；0058C将消毒处理后的病组织接入PDA平板上，置25恒温条件下培养；说明书CN104160846A5/6页70059PDA平板培养基及制备方法为去皮马铃薯200G，切成厚约2MM的片，加入1000ML水煮沸30MIN，用4层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20G和琼脂20G，加热溶解后再补足水份至1000ML；自然PH即不调整培养基的PH，为本领域的常用方法之一，于121高压蒸汽下灭菌30。
22、MIN；之后在超净工作台上倒平板，得到PDA平板培养基；0060D当接种后的PDA平板培养基的表面即植物病组织周围长出菌落后，将该菌落进行镜检结果见图2，由图2所示在图2中A为分离后菌落，B为小型分生孢子，C为大型分生孢子，D为厚垣孢子。将镜检确认后的菌落转入PDA斜面培养基中保存，4冰箱内贮存备用；0061E从转入菌落的PDA斜面培养基中取豇豆枯萎病菌，转入PDA平板培养基中，25恒温培养7天，得到培养好的豇豆枯萎病菌；0062F将培养好的豇豆枯萎病菌，每皿加10ML灭菌水，用灭菌的盖玻片刮取表面菌丝层，三层纱布过滤得到分生孢子滤液，用血球计数板调整孢子浓度，得到枯萎病菌孢子悬浮液，孢子悬浮。
23、液浓度为37106个/ML，优选为5106个/ML。0063D、病原菌侵染处理0064A将二叶一心的幼苗从培养育苗的基质中取出，轻轻提起幼苗并抖动再进行清洗处理，即用蒸馏水洗去二叶一心幼苗的根部的育苗基质，无需再伤根，得到自然伤根后的幼苗；0065B将自然伤根后的幼苗放置到豇豆枯萎病菌孢子悬浮液中，浸泡10MIN，然后移植到装好消毒过基质的营养钵中，置于塑料大棚中培养，温度控制在282，相对湿度控制在85或以上，按正常的栽培管理，得到侵染苗。0066E、发病调查0067分别于侵染处理后的10天、15天、20天、25天，调查所述侵染苗的发病状况，根据豇豆枯萎病病情分级标准确定0、1、3、5、7、。
24、9共6个发病等级，再根据该发病等级计算病情指数，最后根据该病情指数判断所述豇豆品种的豇豆枯萎病抗性分级。0068豇豆枯萎病病情分级标准按表1。0069病情指数DI计算方式为0070病情指数级数株数/最高级数总株数100。式中为和。0071公式说明0072级数发病等级，09级；0073株数相同发病等级对应的株数；0074最高级数最高分级级别；0075总株数进行病情调查的所有豇豆植株数。0076豇豆枯萎病抗性分级标准如下0077按病情指数DI分别划分为，高抗HR0DI15；抗R15DI35；中等M35DI55；感S55DI75；高感HSDI75。0078结果见表2侵染处理后10D，除桂星101长豆。
25、角外，其他试材出现轻微的黄叶；侵染处理后15D，各材料均不同程度的感病；侵染处理后25D，病情指数同侵染后20D相似，不同品种抗病性呈现明显不同。0079表2不同豇豆品种的枯萎病抗性鉴定说明书CN104160846A6/6页800800081结果表明，供试的桂星101长豆角为抗病品种，宁豇三号、台湾七号豆角王、雪龙888白玉豇豆为中等抗病品种，超能王油白长豆角810、美国无架豆、紫秋豇为感病品种，之豇28为高感品种。图3为侵染处理后15D桂星101长豆角和之豇28的抗病性鉴定结果。图3中的A为未接菌以清水处理的对照，图3中的B为接菌处理。说明书CN104160846A1/2页9图1图2说明书附图CN104160846A2/2页10图3说明书附图CN104160846A10。