本发明涉及富含异黄酮的植物分离蛋白及其制备方法。 异黄酮存在于各种豆科植物中，包括植物蛋白原料如大豆。对于本发明来说，这些化合物一般包括黄豆苷、60AC-黄豆苷、黄豆苷原、染料木苷、60AC染料木苷、染料木黄酮、大豆异黄酮、生原禅宁-A、芒柄花黄素和拟雌内酯。通常这些化合物与大豆固有的苦味有关，在生产商品如分离物和浓缩物时，焦点一直集中在如何除去这些物质。例如，在传统的生产大豆分离蛋白的方法中，用碱液介质浸取大豆片，大部分异黄酮溶解在浸出液中并在乳清中保持溶解状态，用酸沉淀蛋白质形成分离物后乳清通常被排掉。通过彻底洗涤分离物通常可以除去残留在酸沉淀的分离蛋白中的异黄酮。
最近人们认识到植物蛋白如大豆中所含的异黄酮能抑制人类癌细胞的生长，如在下列文献中描述的乳腺癌细胞和前列腺细胞：Peterson和Barnes的“Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells：Independence from Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene”（Biochemical and Biophysical Research Communications，Vol.179，NO. 1，P. 661-667，August 30，1991），Peterson和Barnes的“Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostrate Cancer Cells but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosphorylation”，（The Prostate 22:335-345（1993））以及Barnes等人的“Soybeans Inhibit Mammory Tumors in Models of Breast Cancer”（Mutagens and Carcinogens in the Diet P.239-253（1990）.）。
上述令人感兴趣的异黄酮引起对适合于在膳食中摄取的富含这些化合物的蛋白质物料的需求，而在以前生产商品蛋白质材料的方法中总是尽可能地除去这些化合物。
因此，本发明的目的是提供一种富含异黄酮的分离蛋白及其生产方法。此目的和其它目的在下面详细描述的本发明中能够实现。
本发明涉及一种富含异黄酮的植物分离蛋白及其生产方法，本发明的方法包括用PH值高于大约蛋白质等电点的含水提取剂提取植物蛋白质原料得到含有蛋白质和异黄酮的水相提取液。然后调节水相提取液的PH值至大约蛋白质材料的等电点以沉淀蛋白质材料。分离沉淀出的蛋白质材料，但避免或最大限度地减少对沉淀物的进一步的洗涤以防止失去剩余的异黄酮，提供富含异黄酮的分离物。另外，既然异黄酮容易溶解在用于溶解蛋白质的含水提取剂中，那么所采用的蛋白质原料与水的特定重量比应在提取过程中最大程度地溶解异黄酮。
对本发明来说，有用的异黄酮具有下列通式：
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其中R
1、R
2、R
3和R
4可选自H、OH和OCH
3以及这些化合物的葡糖苷。具体地说，已从植物蛋白质原料分离出的这些化合物和其葡糖苷包括黄豆苷、60AC-黄豆苷、黄豆苷原、染料木苷、60AC-染料木苷、染料木黄酮、大豆异黄酮、生原禅宁-A、芒柄花黄素和拟雌内酯。本发明分离物富含的异黄酮优选包括黄豆苷、60AC-黄豆苷、黄豆苷原、染料木苷、60AC-染料木苷和染料木黄酮。
尽管本发明是针对大豆制品进行描述的，而且其方法特别适合于由大豆原料生产的富含异黄酮的分离物，但本发明方法一般也适用于从包含异黄酮的各种植物蛋白源中生产分离蛋白。
本发明的起始原料是大豆片，其中所含油已通过溶剂浸取从其中除去。用PH值大于大约蛋白质材料等电点的含水提取剂提取大豆片，优选的PH值大约为6.0-10.0，最优选的PH值大约为6.7-9.7。如果需要，可采用典型的碱性试剂来提高含水提取剂的PH值，提取剂包括氢氧化钠，氢氧化钾和氢氧化钙。所需的异黄酮化合物通常溶解在含水提取剂中，为了最大程度地回收含水提取液中的这些化合物，将薄片与含水提取液的重量比控制至特定的值上以便尽可能多的溶解蛋白质材料中固有的异黄酮。
可用各种方式完成蛋白质和异黄酮的提取，包括以豆片与含水提取液的重量比为大约5∶1-12∶1的比例对豆片进行逆流提取，其中用初始提取液再提取豆片得到含蛋白质和异黄酮的水提液。另外，也可以采用两步提取法，其中第一步提取豆片与提取剂的重量比为大约8∶1，第二步提取是用新鲜提取剂提取豆片，豆片与提取剂的重量比为大约3∶1-大约6∶1，这样在这两步中，两步加起来的豆片与提取剂的重量比不会超过豆片与提取剂的总重量比即大约11∶1-14∶1。
尽管不是严格的，但提取可在温度高达大约120°F下进行大约5-60分钟，优选15分钟。然后通过加入食用酸如醋酸、硫酸、磷酸、盐酸或任何其它适合的酸性试剂将含有上述异黄酮的蛋白质水提液的PH值调节至大约蛋白质的等电点。大豆蛋白的等电点一般在大约4.0-5.0，优选大约4.4-4.6。PH值调至等电点时沉淀出凝乳状的蛋白质。典型地，在生产传统的分离蛋白中，从称为乳清的剩余水提液中分离出酸沉淀的蛋白质，然后洗涤或处理以除去残留的风味物。此后将洗涤的分离物脱水以形成蛋白质含量（以干基计）大于90%地干燥分离物。反复进行彻底的洗涤以除去不期望的风味，这些风味归因于在大豆中的各种“酚”化合物如异黄酮。
在本发明中，完全避免或尽量减少蛋白质材料的洗涤以便基本上减少蛋白沉淀物中异黄酮的除去，由此提供富含异黄酮的分离物。例如通过避免或尽量减少对沉淀的蛋白质材料的洗涤，在干燥的分离蛋白中保留的异黄酮大于两倍。因此应当完全避免用水洗涤酸沉淀的蛋白质或仅限于用水洗涤一次，在洗涤过程中水与起始蛋白质原料的重量比为2∶1-4∶1。由于不洗或少洗酸沉淀的凝乳，得到了富含所需的异黄酮的分离物。
然后结合离心或浓缩法使酸沉淀的蛋白质脱水并用传统的方法干燥。本发明不受具体脱水方法的限制，但优选采用传统的干燥技术如喷雾干燥以形成干燥的分离物。正如下面具体实施例所说明的那样，用上述方法生产的分离蛋白比传统的分离物提高了异黄酮的含量。
实施例1
为了说明按照本发明生产的分离蛋白中异黄酮的含量有所增加，首先说明传统的分离蛋白和其生产方法以表明在传统的方法中所需异黄酮的回收率。将100磅脱脂大豆片放入提取罐中，用加热至90°F的1，000磅水提取，该水中加入有足够量的氢氧化钙使PH值调节至9.7。水与豆片的重量比为10∶1。从提取液中分离出豆片，并用600磅PH值为9.7，温度90°F的水提取液再次萃取豆片。此第二步萃取的水与豆片的重量比为6∶1。通过离心分离除去豆片，将第一和第二步的提取液合并并用盐酸调节到PH值为4.5。通过离心分离从乳清中分离出酸沉淀的凝乳状物，然后用是起始原料重量7倍的水洗涤得到分离蛋白。对凝乳状物、乳清、豆片渣和起始原料中的染料木苷（包括染料木苷、染料木黄酮和60AC-染料木苷）和黄豆苷（包括黄豆苷、黄豆苷原和60AC-黄豆苷）进行分析。用下述方法完成这些异黄酮的分析：
测定总染料木苷和黄豆苷的方法
1.称出0.25g大豆产品并加入到20ml由80份甲醇、10份水和10份3NHCl组成的提取溶液中。
2.另加20ml4NHCl并将混合物搅拌10分钟。
3.用冷凝器将溶液回流1小时。
4.冷却溶液，用Whatman #4滤纸过滤。
5.移出10ml等分试样，往其中加10ml微孔水（milli pore water）和0.4ml醋酸并混合。
6.将每份溶液注入HPLC柱并通过UV吸收测量上述异黄酮的量。
在表1中列出对沉淀的凝乳状物、大豆乳清、豆片渣和起始原料中的上述异黄酮的分析值。结果还给出了从起始原料所含量中回收上述异黄酮的百分率。
表1
含量
(mg/gm干基) ％回收率
材料 染料木苷 黄豆苷 染料木苷 黄豆苷
凝乳状物 0.90 0.54 23％ 15％
乳清 3.24 3.30 75％ 83％
豆片渣 0.21 0.19 2％ 2％
起始原料 1.72 1.58
上述实施例清楚地说明，在传统方法中，所需异黄酮大部分富集在乳清中，使大多数商品分离蛋白中异黄酮的含量低。
实施例2
将100磅脱脂大豆片放入提取罐中，用800磅加热至90°F的水以连续两步逆流法提取，所说的水中加有足够的氢氧化钙使PH值调节至9.7。水与豆片的重量比为8∶1。通过离心分离除去豆片，调节水提液至PH值为4.5以便沉淀出蛋白质，然后通过离心分离从乳清中分离出蛋白质。避免用水洗涤分离的凝乳状物。用类似于实施例1中描述的方法对凝乳状物、乳清、豆片渣和起始原料进行分析。这些结果列于表2中。
表2
含量
(mg/gm干基) ％回收率
材料 染料木苷 黄豆苷 染料木苷 黄豆苷
凝乳状物 2.31 1.59 59％ 44％
乳清 1.68 2.11 39％ 53％
豆片渣 0.21 0.28 2％ 3％
起始原料 1.72 1.58
上述回收结果表明，与实施例1相比，在凝乳状物中所需异黄酮的量已显著地增加，由此得到富含异黄酮的大豆分离蛋白。
实施例3
同实施例2描述的制备酸沉淀的凝乳状物，但接着酸沉淀凝乳状物后，用等于2倍于豆片重量的室温水洗涤凝乳状物。如实施例1描述的进行分析，异黄酮的回收率列于表3中。
表3
含量
(mg/gm干基) ％回收率
材料 染料木苷 黄豆苷 染料木苷 黄豆苷
凝乳状物 2.03 1.37 52％ 38％
乳清 1.94 2.35 45％ 59％
豆片渣 0.31 0.28 3％ 3％
起始原料 1.72 1.58
回收结果表明，与实施例1相比，凝乳状物中异黄酮回收率显著地增加，由此得到富含异黄酮的大豆分离蛋白。
实施例4
按实施例2的描述制备酸沉淀的凝乳，但接着用酸沉淀后，用等于4倍于豆片重量的室温水洗涤凝乳状物。由此方法得到的异黄酮回收率列于表4中。
表4
含量
(mg/gm干基) ％回收率
材料 染料木苷 黄豆苷 染料木苷 黄豆苷
凝乳状物 1.80 1.12 46％ 31％
乳清 2.20 2.63 51％ 66％
豆片渣 0.31 0.28 3％ 3％
起始原料 1.72 1.58
与实施例1相比，尽管回收数据表明了凝乳状物中异黄酮回收明显的增加，但回收率比实施例3描述的少。
实施例5
用800克90°F的水提取100克脱脂大豆粉。浆液的PH值为6.7。将浆液搅拌5分钟并离心分离以除去粉渣。用盐酸调节提取液至PH值为4.5并通过离心分离10分钟从大豆乳清中分离出凝乳状物。不洗涤凝乳状物。如实施例1的描述测定各部分中异黄酮的回收率并列于表5中。
表5
含量
(mg/gm干基) ％回收率
材料 染料木苷 黄豆苷 染料木苷 黄豆苷
凝乳状物 2.49 1.76 60％ 46％
乳清 1.25 1.47 29％ 37％
豆粉渣 0.91 1.40 11％ 17％
起始原料 1.72 1.58
可以看出，与实施例1相比，凝乳状物中异黄酮的量普遍得到提高。
实施例6
用800g 90°F的水提取100g脱脂大豆粉。通过加氢氧化钙调PH值至9.7。搅拌浆液15分钟，然后离心分离5分钟以分离出提取液。通过将粉与300g水混合5分钟对粉渣进行第二次提取。通过离心分离5分钟从粉渣中分离出第二次提取液。将第一和第二次的水提液合并并调PH值至蛋白质的等电点4.5。通过离心分离回收酸沉淀的凝乳状物，按实施例1的描述测定凝乳状物，乳清和粉渣中异黄酮的回收率。异黄酮的回收列于表6中。
表6
含量
(mg/gm干基) ％回收率
材料 染料木苷 黄豆苷 染料木苷 黄豆苷
凝乳状物 2.23 1.48 57％ 41％
乳清 1.77 2.27 41％ 57％
豆粉渣 0.21 0.19 2％ 2％
起始原料 1.72 1.58
显然，对本领域技术人员来说，可对在此描述的本发明进行许多的改变和改进。