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1、10申请公布号CN104087516A43申请公布日20141008CN104087516A21申请号201410301231622申请日20140626CCTCCNOM201364020131208C12N1/14200601C12N9/18200601C12R1/6920060171申请人华南理工大学地址511400广东省广州市南沙区环市大道南路25号华工大广州产研院72发明人吴晖胡博涵赖富饶刘素纯曾岚74专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102代理人何淑珍54发明名称一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用57摘要本发明提供一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用，所述米曲霉分类命名为米曲霉（。
2、ASPERGILLUSORYZAE）米3，由中国典型培养物保藏中心保藏，简称CCTCC，保藏编号为CCTCCNOM2013640，保藏日期为2013年12月8日。本发明菌株以麦麸为发酵基质来发酵生产阿魏酸酯酶，并用阿魏酸酯酶断裂植物细胞壁多糖及木质素和阿魏酸之间的酯键，获得束缚型酚酸阿魏酸的方法，并且利用微生物生长周期短，不受气候限制，易于实现大规模生产，为阿魏酸等束缚型酚酸类物质提取提供了新的生物方法。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表2页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表2页附图3页10申请公布号CN104087。
3、516ACN104087516A1/1页21一株产阿魏酸酯酶的米曲霉，其特征在于，所述米曲霉分类命名为米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNOM2013640，保藏日期为2013年12月8日，其ITS序列表如表1所示。2权利要求1所述米曲霉应用于产阿魏酸酯酶中。3根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤利用天然麦麸直接接种米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3，进行曲盘发酵，利用高效液相色谱测量阿魏酸释放量。4根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵的条件为用麦麸在曲盘上进行固体发酵，天然麦麸厚度控制在2。
4、3CM内,米曲霉种子接种量为05即含菌量为12109个/G，温度为2528，进行通风培养，发酵时间为4855H；PH自然。5根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述米曲霉种子由米曲霉接种到三角瓶种子培养基中，于281培养5860H得到。权利要求书CN104087516A1/5页3一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用技术领域0001本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用。背景技术0002小麦是世界上种植面积最为广泛的作物之一，约占粮食作物种植面积的26，我国小麦年产量高，小麦麸皮的年产量可达2000万吨以上，但是一直以来对于麸皮的开发利用较少，基本上仅以作为饲料原料而加以。
5、利用。小麦麸皮中主要含有非淀粉多糖、淀粉、脂肪、木质素、蛋白质、维生素和酚类物质等多种成分，其中以阿拉伯木聚糖为主的非淀粉多糖含46，是小麦细胞壁的主要成分。麸皮中还含有一定数量的酚酸类物质，如阿魏酸（FERULICACID）、P香豆酸PCOUMARICACID、咖啡酸CAFFEICACID、芥子酸SINAPICACID和丁香酸SYRINGICACID等成分，其中以阿魏酸为主要成分，约为麸皮质量的0407。阿魏酸主要通过酯键与细胞壁多糖和木质素项链，一般可以使用强碱将酯键断开而释放出来。0003酚酸组要存在于麦麸皮层中，其具有较强的抗氧化活性和抗肿瘤作用，并对环境中的有毒物质如多环芳烃和亚硝酸。
6、胺以及真菌毒素有抗诱变作用。有研究报道发现，在麦麸膳食纤维的离体发酵试验中，结肠微生物能通过发酵作用将结合在麦麸膳食纤维上的阿魏酸释放出来。而阿魏酸可显著降低人子宫颈癌细胞的生存能力、存活和抗氧化水平，同时提高癌细胞保内的活性氧水平并增加癌细胞的脂质过氧化及DNA损伤作用。另有报道认为阿魏酸可通过对血管内皮生长因子（VEGF、血小板源生长因子（PDGF）和缺氧诱导因子（HIF）的作用来调节血管的形成。0004目前，研究表明酚类物质主要以游离型、结合型和束缚型等几种形式存在于植物机体内，一般来说，游离性和结合型酚类物质为可溶性酚类；束缚型则为不溶性酚类物质，以酯键、糖苷键和醚苷键形式与其他物质（。
7、包括蛋白质、糖类、有机酸等）相结合。0005对于酚类物质的提取，一般采用有机溶剂为媒介，辅以超声、微波、亚临界等方法进行。由于束缚型酚类物质一般与其他物质以不同的键型相连结，传统的提取方法不足以将酯键、糖苷键或醚键断裂，因此对束缚型酚类物质的提取主要采用强酸强碱或生物方法（酶法和发酵法），其主要目的都是破坏细胞壁纤维成分致密的结构，以使束缚行酚类物质释放出来。0006尽管化学方法操作简单、效率高，但是后续需要处理提取废液，不利于可持续性发展。因此相比较而言，采用生物方法更符合绿色、环保的发展要求。对于麦麸进行发酵方面的多集中在低聚木糖生产和产酶活性等领域，另外已有大量文献报道麦麸经发酵后等到膳。
8、食纤维功能性质比发酵前有大幅改善，如持水性、持油性和对有害物质的结合能力等。0007阿魏酸作为麦麸中的主要酚酸，目前对其获得的方式主要为酶法，以发酵方式的报道较少，特别需要指出的是，麦麸中的阿魏酸基本适宜束缚型的形态存在的，其游离型结合型束缚型的比例为011100。近年来，对酚类物质存在形式的研究逐渐成为新的研究热点。目前已对一些游离型、酯化型、糖苷型、束缚型酚类物质的提取、测定及抗氧化活性等方面的报道。酚类物质的存在形与其含量及抗氧化活性有重要关系，束缚型酚类物质不说明书CN104087516A2/5页4仅含量远远高于游离型和结合型，且抗氧化性活性和抑制DNA损伤方面要高于其他两种类型。00。
9、08本发明旨在利用微生物资源采用发酵工程技术将农业资源转化形成人类社会需求的物质，解决抗氧化物质资源短缺的问题。发明内容0009本发明所要解决的技术问题是针对现有抗氧化供应的提供新的原料和方法，并对小麦等大宗植物进行再利用，提供一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用，其可利用小麦麸皮发酵生产阿魏酸，由于微生物生长周期短、不受气候限制，易于实现大规模生产，从而解决阿魏酸不足等问题。0010本发明提供一株产阿魏酸酯酶的米曲霉，来源于华南理工大学周边植物腐生较多的土壤，经过筛选，分离纯化得到的。所述米曲霉分类命名为米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3，由中国典型培养物保藏中心保藏，简称CCTC。
10、C，保藏编号为CCTCCNOM2013640，其ITS序列表如表1所示，保藏日期为2013年12月8日，保藏地址为中国武汉武汉大学，中国典型培养物保藏中心。0011本发明所得米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3平板观察特征和显微镜特征如下米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3在察氏培养基上菌落生长速度较慢，培养7D直径50MM；有辐射状不规则的沟纹，质地丝绒状中央现絮状，分生孢子结构多，无渗出液，反面呈淡粉红色至淡褐色。在麦芽汁琼脂上菌落生长速度快，培养7D长满全皿，质地丝绒状至厚絮状；黄绿色近于黄橄榄色后变淡褐橄榄色，反面无色。在査氏酵母膏琼脂上菌落培养7D直径70MM。
11、,具辐射状沟纹，质地丝绒状或絮状；分生孢子结构多，淡黄褐色。0012显微镜下可以观察到分生孢子头幼球形后呈辐射形，分生孢子梗发生于基质或气生菌丝；顶囊近球形至烧瓶形,直径1645MM，产孢子结构单层或双层，有些统一顶囊上二种情况兼有，瓶梗814M355M或椭圆形，48M4M,壁近于平滑或稍粗糙。0013所述米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3的ITS与米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）同源性达998。0014一株产阿魏酸酯酶的米曲霉，本发明的米曲霉来源于华南理工大学周边腐生植物较多的土壤，采用不同的培养基进行筛选，筛选到多个菌株，逐一进行阿魏酸含量及牛津杯透明圈测定实验，。
12、得到高产阿魏酸酯酶的米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3，包括如下步骤称取土壤样品10G放入装有90100ML无菌的含玻璃珠的生理盐水的300ML三角瓶中摇荡1820MIN，作10倍递增系列稀释样品匀液110、1100、11000、及110000，取稀释样品匀液1100、11000、及110000各10ML分别加入到无菌平皿；再加1015MLPDA培养基混合均匀，静置12MIN，于281倒置培养7072H，将PDA培养基上单个的菌落转接到斜面PDA培养基上281培养7072H，再转入初筛培养基,于281培养5860H，用牛津杯透明圈实验，筛选得到产阿魏酸酯酶的米曲霉（ASPERGI。
13、LLUSORYZAE）米3；所述土壤样品采集自华南理工大学周边腐生植物较多的土壤。0015上述方法中，将从初筛培养基上获得产阿魏酸酯酶的米曲霉接种到三角瓶种子培养基中，于281培养5860H，即为米曲霉种子；再将米曲霉种子接种到发酵培养基说明书CN104087516A3/5页5中培养，为产阿魏酸的米曲霉的提取物。0016初筛培养基FESO47H2O001G，NANO320G，KCL05G，MGSO47H2O05G，K2HPO410G，蔗糖30G，琼脂20G，蒸馏水1000ML，PH值自然；121灭菌20MIN。灭菌后培养基冷到60左右添加无菌的10阿魏酸乙酯的二甲基甲酰胺溶液100ML，摇匀至。
14、均匀的乳白色倒平板。0017种子培养基FESO47H2O001G，NANO320G，KCL05G，MGSO47H2O05G，K2HPO410G，麸皮1000G，蒸馏水1000ML，PH值自然。121灭菌20MIN。0018PDA培养基PDA（马铃薯琼脂）40G，定容至1L，PH自然。121保温灭菌20MIN。0019发酵培养基麦麸水为重量比11，PH值自然。0020一种米曲霉应用于产阿魏酸酯酶，包括如下步骤利用天然麦麸直接接种米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3，于发酵培养基中进行曲盘发酵，获得发酵提取物，利用高效液相色谱测量发酵培养基中麦麸的阿魏酸释放量。0021上述应用中，所述。
15、发酵的条件为用麦麸在曲盘上进行固体发酵，麦麸厚度控制在23CM内,米曲霉种子接种量为05含菌量为12109个/G，培养温度为2528，进行通风培养，发酵时间为4855H；PH自然。所述麦麸为天然麦麸。所述米曲霉种子由米曲霉接种到三角瓶种子培养基中，于281培养5872H得到。0022与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明提供了一种新的米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3，所述菌株具有产阿魏酸酯酶的能力，极大的补充了提取束缚型阿魏酸菌的资料库；所述米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3已经从生物界中分离纯化出来，并且易于培养保存，繁殖迅速，生长能力强。0023本发明同时提。
16、供了所述米曲霉的发酵产阿魏酸酯酶特性试验，通过大量的试验证明了米曲霉的阿魏酸酯酶的酶活很高，可以作为从植物中提取束缚型酚酸的生物菌。0024本发明提供了米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3在植物中束缚型阿魏酸生物法的应用，为束缚型酚酸的释放及后续抗氧化工程，提供了新的生物方法以及强有力的技术支持。附图说明0025图1为本发明菌株初筛培养基的透明圈图及菌落图；图2为本发明发明菌株在显微镜下400倍观察的个体形态图；图3为HPLC测定的阿魏酸标准品色谱图；图4为HPLC测定的阿魏酸标准品的标准曲线；图5为米曲霉发酵色谱图。具体实施方式0026下面结合实施例对本发明作进一步地说明。002。
17、7以下实施例中用到的培养基配方初筛培养基FESO47H2O001G，NANO320G，KCL05G，MGSO47H2O05G，K2HPO410G，蔗糖30G，琼脂20G，蒸馏水1000ML，PH值自然；121灭菌20MIN。灭菌后培养基冷到60左右添加无菌的10阿魏酸乙酯的二甲基甲酰胺溶液100ML，摇匀至均匀说明书CN104087516A4/5页6的乳白色倒平板。0028种子培养基FESO47H20001G，NANO320G，KCL05G，MGSO47H2005G，K2HPO410G，麸皮1000G，蒸馏水1000ML，PH值自然。121保温灭菌20MIN。0029PDA培养基PDA（马铃薯。
18、琼脂）40G，定容至1L，PH自然。121保温灭菌20MIN。0030发酵培养基麦麸水重量比为11，PH自然。121保温灭菌20MIN。0031实施例1米曲菌的初筛，牛津杯透明圈筛菌实验筛选高产菌株。0032从华南理工大学周边腐生植物较多的土壤中采集土壤样品，称取样品10G放入装有90ML无菌的含玻璃珠的生理盐水的300ML三角瓶中摇荡20MIN，作10倍递增系列稀释样品匀液110、1100、11000、及110000，取稀释样品匀液1100、11000、及110000各10ML分别加入无菌平皿；再加15MLPDA培养基混合均匀，静置1MIN，于28倒置培养72H，将培养基上单个的菌落转接到斜。
19、面PDA培养基上28培养72H，再转入含阿魏酸乙酯的初筛培养基28培养60H，筛选产阿魏酸酯的菌株，备用；用平皿牛津杯透明圈实验做再次筛菌，将分离获得的产阿魏酸酯的菌株采用液体发酵方法在发酵培养基中28培养2天，获得发酵液，将发酵液6000R/MIN离心后取200UL上清液，放到初筛培养基上牛津杯中，置于37培养箱中培养527H观察透明圈（如图1所述），发酵液的上清液消解底物而产生透明圈，即可说明产阿魏酸酯酶活性的高低，以此方法在已经产阿魏酸酯酶的菌株中对比筛选透明圈，透明圈大的即为高产阿魏酸酯酶的菌株。0033实施例2菌株的微生物学特性及鉴定米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3在。
20、察氏培养基上菌落生长速度较慢，培养7D直径50MM；有辐射状不规则的沟纹，质地丝绒状中央现絮状，分生孢子结构多，无渗出液，反面呈淡粉红色至淡褐色。在麦芽汁琼脂上菌落生长速度快，培养7D长满全皿，质地丝绒状至厚絮状；黄绿色近于黄橄榄色后变淡褐橄榄色，反面无色。在査氏酵母膏琼脂上菌落培养7D直径70MM,具辐射状沟纹，质地丝绒状或絮状；分生孢子结构多，淡黄褐色。0034显微镜下可以观察到分生孢子头幼球形后呈辐射形，分生孢子梗发生于基质或气生菌丝；顶囊近球形至烧瓶形,直径1645MM，产孢子结构单层或双层，有些统一顶囊上二种情况兼有，瓶梗814M355M或椭圆形，48M4M,壁近于平滑或稍粗糙（如附。
21、图2所示）。0035所述米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3的ITS与米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）同源性达998。0036实施例3固态发酵测定束缚型阿魏酸释放量按种子培养基配方，称10G麸皮加水10G混合入500ML三角瓶，种子培养基灭菌后接种米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米3斜面菌株，接种量为05，28培养3D后，得到米曲霉种子；按发酵培养基配方，称200G麸皮加水200G混合后灭菌，置瓷盘冷却，麦麸厚度控制在25CM内,米曲霉种子接种量为05含菌量为12109个/G，培养温度为28，进行通风培养，发酵时间为48H。将固态发酵麸皮，按15G加90ML。
22、水比例在40水浴锅中浸提60MIN后，于4，12000RMIN离心20MIN，取上清液酶液置于冰箱中保存。说明书CN104087516A5/5页70037取上清液3ML入10ML离心管加3ML甲醇冰醋酸（191）混合，10000RMIN离心取上清液用045M膜过滤如进样瓶冰箱保存，备用。样品做空白对照即麸皮培养基不发酵的按此方法处理即得。HPLC采用VENUSILXBPC18L46MM250MM，5M,保护柱为C184675MM,5M条件为10L进样量，流动相为1冰乙酸乙腈（82），波长320NM,柱温20，流速为09MLMIN1。取10MG阿魏酸标准品，经甲醇定容至10ML，分别配制成浓度为。
23、40、60、80、100、120、140G/ML的溶液，经上述色谱条件进行测定（见图3为某浓度阿魏酸标准品色谱图），并将阿魏酸浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，最后得回归方程为Y311134X202717，R209969见图4为阿魏酸标准品的标准曲线，再根据样品测定的阿魏酸的Y值（见图5），将Y值代入回归方程Y311134X202717，得到X值，即为样品阿魏酸浓度。利用液相色谱测定的束缚型阿魏酸释放量达到0305，而有关相关文献中束缚型阿魏酸的含量为0307。证明通过发酵后束缚型阿魏酸得到了极大的释放。该菌株为高产阿魏酸酯酶及相关酶系并能通过发酵的方法从植物中得到束缚型阿魏酸的菌株。说明书C。
24、N104087516A1/2页8序列表1SEQUENCELISTING华南理工大学一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用1PATENTINVERSION351584DNA米曲霉（ASPERGILLUSORYZAE）米31CGTAGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGTAGGGTTCCTAGCGAGCCCAACCTCC60CACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGG120CTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAG180TCTGA。
25、GTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGC240ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCA300TCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCG360TCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGA420CGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCAC480CCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACC540序列表CN104087516A2/2页9TCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA584序列表CN104087516A1/3页10图1图2说明书附图CN104087516A102/3页11图3图4说明书附图CN104087516A113/3页12图5说明书附图CN104087516A12。