抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞的多肽类药物 【技术领域】
本发明涉及一种抗SARS冠状病毒药物，具体涉及抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞的多肽类抗病毒药物。
背景技术
SARS冠状病毒是引起2003年在我国和世界范围内爆发的“非典型肺炎”的病原体，目前还没有特效的药物能够治疗。
SARS病毒是一种带囊膜的冠状病毒，其侵染细胞的第一步就是病毒囊膜与宿主细胞的融合。多肽类融合阻断分子因其能够阻断病毒囊膜与宿主细胞的融合，在其他病毒药物的开发研制中有着成功的经验，如HIV囊膜蛋白GP41有两段HR结构域，分别形成三个N螺旋和三个C螺旋。在HIV侵入细胞的过程中，这三个N螺旋和三个C螺旋形成Coiled-coil六聚体结构起着至关重要的作用。根据这一原理设计的多肽类药物T-20(商品名Fuzeon)已经上市，它能够有效地阻断由GP41本身的α螺旋形成六聚体，从而阻断HIV膜结构和细胞膜的融合。研究表明，T-20的阻断能力强，对机体副作用低，是一种理想的药物。
SARS囊膜蛋白SPIKE的结构研究表明，在SPIKE蛋白中同样存在能够形成Coiled-coil结构的两段HR结构域。
发明内容：
本发明的目的是开发一类阻断SARS冠状病毒进入宿主细胞的抗病毒药物。
本发明地技术方案是寻找可起到SARS冠状病毒多肽类融合阻断作用的物质，通过该物质与SARS囊膜蛋白Spike的相互作用，阻止SARS囊膜蛋白Spike的构型改变，从而阻断病毒囊膜与宿主细胞的融合，达到预防和治疗SARS病毒感染的目的。
本发明提供的SARS冠状病毒多肽类融合阻断药物的具有如下通式：
X-SEQ-Z
其中，SEQ表示SARS冠状病毒囊膜蛋白SPIKE中的多肽，所述多肽包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21个氨基酸序列。
在SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21个氨基酸序列的多肽中：
至少一个氨基酸残基的连接使用非肽键连接方式，例如，以亚氨基、酯、肼、氨基脲或含氮化学键的形式连接；
至少一个氨基酸残基以D构型存在；
至少有一个氨基酸被另一个不同的氨基酸置换，所述置换方式是保守的和/或不保守的；
所述多肽可以是SARS自然突变株相对应氨基酸位置的同源物；
所述多肽可以被包含在一段其它多肽中；
所述多肽可以以单体，二聚体，三聚体和多聚体的形式存在。
X包括氨基、乙酰基，及某些疏水基团和大分子载体基团；
Z包括羧基、氨基及某些疏水基团和大分子载体基团；
所述疏水基团包括9-芴基甲氧羰基(9-fluorenyl methoxy-carbonyl)、苄氧羰基(carbobenzoxyl)1-二甲胺基萘-5-磺酰(dansyl)和叔丁氧羰基(t-butyloxy carbonyl)；
所述大分子载体基团是共轭脂肪酸(Lipid-fatty acid conjuate)、聚乙二醇或碳水化合物类基团。
上述通式中，X和Z也可以不存在。即，如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21个氨基酸序列也可用作阻断SARS冠状病毒进入宿主细胞的抗病毒药物。
本发明所述的多肽可以从真核细胞表达系统、原核细胞表达系统或固相化学合成的途径得到。
在采用原核表达系统的实验中，先用PCR的方法扩增SARS囊膜蛋白SPIKE的一段序列，将其克隆到表达载体上。诱导表达后，使用GlutathioneSepharose 4B系统纯化得到多肽样品。
化学合成可选用本技术领域人工合成多肽的常规操作方法。
经药效学实验测试，本发明的多肽类药物对于SARS冠状病毒活病毒感染其易感细胞VeroE6具有阻断能力，表明本发明的多肽类药物可抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞。
【具体实施方式】
本发明SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21个氨基酸序列所示的多肽中，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15采用原核表达系统得到，SEQ ID NO.16～21为人工合成得到。
实施例1大肠杆菌表达多肽
1.SARS病毒样本的总RNA的提取
(1)用1ml trizol(GIBCO)抽提含有SARS病毒样本；
(2)加200μl氯仿，剧烈振荡15秒；
(3)室温静置3-5min，10000g4℃离心15min；
(4)吸出500μl水相，转移到新管中；
(5)加入500μl异丙醇，充分振荡混匀；室温静置10min
(6)10000g4℃离心10min，得到SARS病毒RNA沉淀。
2.SARS病毒SPIKE蛋白基因的克隆
(1)将SARS病毒RNA基因组反转录为DNA
反转录引物：SPIKE蛋白antisense primer
反转录酶：MMLV-RT(promega)
(2)通过PCR方法扩增出SPIKE的DNA序列。
扩增引物：
Sense：5’-cgggatccaacgaacatgtttattttcttattatttc-3’
antisense：5’-cggaattcgtttatgtgtaatgtaatttgacaccc-3’
(3)将PCR产物连接到pcDNA3.1+载体中
连接方式：BamHI，EcoRI双切连接。
3.克隆得到下列SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15的多肽的序列及其PCR引物如下：
SEQ ID NO.1：NGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTA
AATGGCATTGGAGTTACC
TGC AGT TGA TGT TGT TGT AAG
SEQ ID NO.2：PDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQ
CCAGATGTTGATCTTGGC
TTGAAGGTCAATGAGTGATTC
SEQ ID NO.3：GDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQ
GGCGACATTTCAGGCATTAAC
TTGAAGGTCAATGAGTGATTC
SEQ ID NO.4：ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPW
A TTT CAG GCA TTA ACG CTT C
CCAAGGCCATTTAATATATTGC
SEQ ID NO.5：INASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPW
ATTAACGCTTCTGTCGTCAAC
CCAAGGCCATTTAATATATTGC
SEQ ID NO.6：VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPW
G TCG TCA ACA TTC AAA AAG
CCAAGGCCATTTAATATATTGC
SEQ ID NO.7：IQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPW
A TTC AAA AAG AAA TTG ACC GC
CCAAGGCCATTTAATATATTGC
SEQ ID NO.8：IDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPW
A TTG ACC GCC TCA ATG AGG TC
CCAAGGCCATTTAATATATTGC
SEQ ID NO.9：ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGK
A TTT CAG GCA TTA ACG CTT C
TTTTCCCAATTCTTGAAG
SEQ ID NO.10：INASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGK
ATTAACGCTTCTGTCGTCAAC
TTTTCCCAATTCTTGAAG
SEQ ID NO.11：VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGK
G TCG TCA ACA TTC AAA AAG
TTTTCCCAATTCTTGAAG
SEQ ID NO.12：IQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGK
A TTC AAA AAG AAA TTG ACC GC
TTTTCCCAATTCTTGAAG
SEQ ID NO.13：ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDL
A TTT CAG GCA TTA ACG CTT C
AAG GTC AAT GAG TGA TTC A
SEQ ID NO.14：INASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDL
ATTAACGCTTCTGTCGTCAAC
AAG GTC AAT GAG TGA TTC A
SEQ ID NO.15：VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDL
G TCG TCA ACA TTC AAA AAG
AAG GTC AAT GAG TGA TTC A
4，多肽的表达
(1)将PCR产物回收纯化后连接到pGEX-6p-2载体
(Amersham Pharmacia Biotech.27-4598-01)的sma I切点。
(2)将正确构建的重组质粒转入到JM109(DE3)感受态细胞中，用含抗生素的LB培养基过夜培养。
(3)过夜培养物1∶50接400ml新鲜培养基，2小时后加80ml 1M IPTG诱导，继续培养4小时。
(4)4℃，8000rpm 6min离心培养的细菌，加入15ml Lysis Buffer重悬沉淀，加入溶菌酶至终浓度为100mg/ml，置冰上30min，冰上超声12次(300W，10s/10s)
(5)4℃，12000rpm离心15min，取上清以5-10mgGST/ml的比例加入Glutathione Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech.17-0756-01)，在冰上结合1h，使样品液过层析柱(Bio-Rad 74306)使用5倍体积的Hepes500洗涤GST柱子，之后使用10倍体积的Hepes100洗涤，再用0.5ml含10mMGSH的Hepes100洗涤柱料4次，收集流出液。
(6)在酶切Buffer终透析过夜，除去GSH，使用分光光度计定量(1OD280＝0.5mg/ml)，按照每100mg加入1ml(2units)preScissionProtease(Amersham Pharmacia Biotech.27-0843-01)，4℃酶切3h。以5-10mg GST/ml的比例加入Glutathione Sepharose 4B(Amersham PharmaciaBiotech.17-0756-01)，在冰上结合1h，使样品液过层析柱(Bio-Rad74306)，收集流出液，使用0.5ml酶切Buffer再洗一次，收集流出液。
实施例2多肽抑制SARS病毒感染靶细胞实验
一、实验材料及方法
1病毒的获取和培养
取含有SARS病毒的上清加到长成单层的VeroE6细胞上，37℃感染1小时，加入DMEM+2％FBS，继续于37℃培养观察CPE，待CPE完全时收获上清。
2病毒滴度的测定
将病毒上清连续稀释，将只有一半细胞样品出现CPE，而下一个稀释度没有CPE的稀释度定为最大稀释度。
3测定多肽对病毒的抑制活性
每份测试细胞加入多肽样品终浓度1μM，加入病毒200TCID50，24小时后观察CPE判断细胞是否被感染。
二、实验结果
所观察到CPE细胞未被感染，证明受试多肽可阻断SARS冠状病毒进入宿主细胞。
序列表
<110>北京大学
<120>抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞的多肽类药物
<130>03-01
<160>19
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>38
<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
<400>1
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1 5 10 15
Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu
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Thr Thr Thr Ser Thr Ala
35
<210>2
<211>40
<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
<400>2
Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val
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<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
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<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
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<210>5
<211>43
<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
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<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
<400>6
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<213>SARS冠状病毒
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<213>SARS冠状病毒
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<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
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<213>SARS冠状病毒
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Gly Lys
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<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
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<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
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<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
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<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
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<213>SARS冠状病毒
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<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
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<213>SARS冠状病毒
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<213>SARS冠状病毒
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<212>PRT
<213>SARS冠状病毒
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<213>SARS冠状病毒
<400>21
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