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1、10申请公布号CN104083753A43申请公布日20141008CN104083753A21申请号201410241521622申请日20140603A61K38/1620060171申请人中国人民解放军南京军区福州总医院地址350025福建省福州市西二环北路156号72发明人聂晓晶马雷丁晓华74专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊54发明名称B19病毒VP1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用57摘要本发明公开了B19病毒VP1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用。以纯化好的B19病毒VP1独特区蛋白经尾静脉注射BALB/C小鼠。共注射3次，每次间隔10D，最后1次。
2、注射后10D，取标本进行相关检测。经肾脏组织分别行光镜、电镜和TUNEL免疫荧光分析，尿液行尿常规检查。结果表明B19病毒VP1独特区蛋白引起肾脏组织及尿液改变，说明了其能够成功的构建病毒性肾病动物模型。常见的活病毒感染建立病毒性肾病动物模型有一定的危险性，而本发明采用B19病毒VP1独特区蛋白建立病毒性肾病动物模型具有安全性好、可操作性好及成功率高的特点。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图2页10申请公布号CN104083753ACN104083753A1/1页21B19病毒VP1独特区蛋白在制备构建病毒。
3、性肾病模型的试剂中的应用。2如权利要求1所述的应用，其特征在于，B19病毒VP1独特区蛋白被制成注射剂。3如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的注射剂中B19病毒VP1独特区蛋白的浓度不小于10MG/ML。4如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的注射剂中B19病毒VP1独特区蛋白的浓度为12MG/ML。5如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂为引起肾脏组织病毒性病变及尿液改变的试剂。6如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肾脏组织病毒性病变表现为光显微镜、透射电镜下能够观察到的病毒性病变。7如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肾脏组织病毒性病变表现为TUNEL免疫荧光。
4、能够检测到的病毒性病变。8如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的尿液改变包括检测到尿蛋白、尿隐血的改变。9B19病毒VP1独特区蛋白在构建病毒性肾病模型中的应用。权利要求书CN104083753A1/7页3B19病毒VP1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用技术领域0001本发明属于病毒性肾病模型构建技术领域，涉及B19病毒VP1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用。背景技术00021、病毒性肾病的研究现状病毒性肾病是一组因病毒感染而导致的肾脏疾病，常见的病原有乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、B19病毒、艾滋病病毒（HIV）等。国外报道B19病毒感染引起的病毒性肾病包括肾小球肾。
5、炎、肾病综合征、肾功能不全等疾病。近来，B19病毒感染被认为与临床表现重、治疗效果差、病程进展快、预后差的塌陷性肾小球病（CG）密切相关，CG患者肾脏组织和外周血中B19病毒DNA检出率分别为78和87。国内郝文等报道B19病毒感染是过敏性紫癜发病的重要原因之一，且B19病毒感染更易引起肾脏病变。余建莉等发现肾脏病患儿B19病毒感染阳性率明显高于健康儿童，原发性肾脏病中急性肾小球肾炎B19病毒感染阳性率最高，继发性肾脏病中狼疮性肾炎B19病毒感染阳性率最高。王薇等发现B19病毒感染引起的肾脏疾病有自限性，其中女性患者较多。0003目前研究认为病毒感染致肾脏病变的机制包括病毒蛋白或组织中的致炎因。
6、子引起肾脏细胞坏死、凋亡或功能障碍；病毒抗原与肾小球直接结合，针对病毒抗原的免疫反应引起肾脏损伤；循环系统中的抗原抗体免疫复合物损伤肾脏；病毒对肾小球的直接破坏；肾小管间质因细胞病变和肾小球产生的炎症因子而损伤；血流动力学紊乱；抗病毒治疗引起肾脏损伤。病毒感染导致肾脏病变涉及的信号通路主要有TNFR信号通路、NOTCH信号通路、GDNFRET信号通路。KOMATSUDAA等认为B19病毒抗原刺激产生的抗体所形成的抗原抗体复合物是B19病毒感染引起肾脏损伤的原因之一。00042、B19病毒及其致病性人细小病毒B19HUMANPARVOVIRUSB19,PVB19是1975年COSSARTYE用对。
7、流免疫电泳法筛选健康献血者血液中乙型肝炎病毒时于第19号标本中偶然发现的，因此得名。它是细小病毒科细小病毒属中目前己知的唯一致人类疾病的病毒，也是动物病毒中体积最小结构最简单的DNA病毒。1981年，在患镰状细胞贫血和再生障碍性贫血的儿童中检测到这种病毒，从而证实了其致病性，以后又相继在传染性红斑又称第五病、血小板减少性紫癜、关节病、心肌炎、心包炎、急性肝炎患者中检测到该病毒，而且还发现该病毒能通过胎盘感染胎儿，引起孕妇流产、早产或胎儿水肿、死胎。1987年在1例先天性免疫缺陷综合征贫血病人中证实存在有慢性B19病毒感染。随后的研究显示在AIDS患者、器官移植的受者、化疗的肿瘤病人等免疫抑制患。
8、者中都有慢性持续性B19病毒感染的存在。近年来，还证实B19病毒感染与川崎病、一过性成红细胞减少、系统性红斑狼疮、皮肌炎、慢性自身免疫性血小板/中性粒细胞减少症、某些严重的肝炎、由免疫复合物介导的肾脏损害及睾丸生殖细胞瘤等疾病有关，甚至可引起败血症。0005B19病毒颗粒由两个衣壳蛋白和一条线状的单链DNA分子组成，呈对称的二十面说明书CN104083753A2/7页4立体结构，无包膜，直径2224NM，平均23NM。在电镜和阴性染色中可见空壳和完整的病毒颗粒，成熟的有感染力的病毒颗粒分子量为56106道尔顿，其中DNA占全重的一半。B19病毒基因为单链小DNA，全长5596BP，两端有383。
9、BP长的重复序列形成复式发卡结构，G、C含量高，具有强同源性，是合成整条链的引物。两端的复式发卡结构使得B19病毒基因二级结构牢固，而不易克隆入细菌中。在B19病毒基因组内有两个大的开放读框，几乎延伸整个基因组，左侧的开放读框4062501BP编码非结构蛋白NS，右侧的开放读框编码两个衣壳蛋白VPL和VP2。VP2的氨基酸编码序列30885093BP包含在VP1的氨基酸编码序列24165093BP中，其组成比后者少226个氨基酸的氨基尾，故这两种衣壳蛋白在氨基酸组成上具有同一性。0006B19病毒的细胞受体主要是红细胞糖苷脂，也被称为P抗原，它是一种中性糖脂。P抗原主要是在红系祖细胞、成熟红细。
10、胞、巨核细胞、内皮细胞和平滑肌细胞上，这与B19病毒感染引起的疾病相关。P抗原或抗P抗原抗体可以保护细胞不被B19病毒感染，P抗原阴性血型的人不感染B19病毒。然而，也有体外试验发现B19病毒不与P抗原结合。51整合素复合物51INTEGRINCOMPLEX是B19病毒进入细胞的核心受体。KU80DNA结合蛋白也被认为与B19病毒进入细胞有关。有一个有趣的现象，只有极少数的B19病毒与细胞膜上P抗原结合后进入细胞内，大多数的B19病毒从结合的细胞膜上脱落下来，将这些脱落的B19病毒加入没有被感染过的细胞中时，这些脱落的B19病毒有极强的结合能力和传染性，深入研究发现这与B19病毒结合P抗原后病。
11、毒蛋白构象发生变化，结合位点被暴露出来有关。B19病毒通过内吞作用进入细胞质，网格蛋白、发动蛋白和细胞骨架都参与了这一过程，内吞膜泡被运送到细胞核的周边。RAS超家族成员RAP1通过调节1整合素复合物受体和或微管网络控制内吞膜泡在细胞质中运输。VP1独特区区域随着内吞膜泡内PH值降低而完全暴露在病毒衣壳表面，暴露区域中包含PLA2结构域，PLA2结构域劈开膜泡，VP2区域的NLS介导病毒衣壳与转入蛋白结合，发生构象变化的病毒核酸通过核膜孔复合物进入细胞核。VP1独特区蛋白对于B19病毒进入宿主细胞至关重要，如果VP1独特区蛋白因核酸突变导致构象变化，病毒核酸将无法进入细胞核。00071983年。
12、，MORTIMERPP等首次提出B19病毒对红系祖细胞有细胞毒性。SRIVASTAVAA等发现B19病毒与红系祖细胞和巨核细胞的P抗原结合后，由NS1蛋白引起细胞死亡。MOFFATTS等提出NS1蛋白引起细胞死亡是通过激活CASPASE3，触发细胞凋亡所导致的。B19病毒诱导细胞凋亡的特性并在超微结构下得以证实。深入研究发现NS1蛋白中的三磷酸核苷结合结构域与B19病毒诱导细胞凋亡有关，这一过程包括NS1蛋白阻止细胞膜两边NA与H交换，降低胞内PH值；触发了TNF受体信号通路，激活CASPASE3和CASPASE6；激活P53，诱导BAX表达，再激活CASPASE9。此后，CHENAY等认为1。
13、1KDA蛋白诱导细胞凋亡的能力比NS1蛋白强，如果抑制11KDA蛋白合成，B19病毒感染导致细胞凋亡的能力明显减弱，并且还发现细胞浆中的11KDA蛋白浓度是细胞核中NS1蛋白浓度的100倍，11KDA蛋白诱导细胞凋亡与激活CASPASE10有关。0008B19病毒感染急性期是多种自身抗体产生的重要时期，这些自身抗体包括ACL、A2GP、DSDNA、抗中性粒细胞胞浆抗体ANCA，抗蛋白水解酶3抗体APR3ANCA和抗髓过氧化物酶抗体AMPOANCA也短暂出现。自身抗体在分子拟态机制下具有病毒抗原表位，引起免疫紊乱，抗独特型抗体也参与了自身抗体的产生和自身免疫反应。VP1独特区蛋说明书CN1040。
14、83753A3/7页5白发挥PLA2活性可促使炎症因子白三烯和前列腺素产生，炎症反应将产生一些不常见的复合物，这些复合物含有细胞磷脂成份，依赖于分子拟态机制，刺激宿主产生相应的APL自身抗体，这些自身抗体会攻击宿主器官。00093、B19病毒VP1独特区蛋白的功能B19病毒VP1独特区蛋白分子量22KDA，VP1独特区蛋白几乎全部暴露在病毒表面。VP1独特区蛋白的功能位点却没有暴露在病毒衣壳表面，只有当环境温度升高和PH值降低时功能位点才暴露出来。暴露出来的功能位点与B19病毒进入细胞内有关。VP1独特区蛋白对于病毒衣壳构建至关重要，具有良好的抗原性。VP1独特区蛋白与心磷脂CL和2糖蛋白2G。
15、P有类似的抗原决定簇。通过分析VP1独特区蛋白和几种VP1独特区蛋白突变体的亲和常数，研究者发现尽管VP1独特区基因片段核苷酸变异较多，但是不管核苷酸如何变异，或者是VP1独特区蛋白在何种环境中，VP1独特区蛋白构象表位都不变。ZDORIZ等在进行VP1独特区蛋白氨基酸序列分析时，发现VP1独特区蛋白含有磷酸酶A2PLA2序列。接着，DORSCHS等采用电喷雾串联质谱ESIMSN技术证实真核系统和原核系统表达的VP1独特区蛋白都有PLA2活性，VP1独特区蛋白发挥PLA2活性时依赖于CA2存在，PLA2活性中心有赖氨酸和组氨酸，使用与赖氨酸和组氨酸结合的二倍半萜内酯MANOALIDE和4二溴苯。
16、乙酮4BROMOPHENACYLBROMIDE可以阻断VP1独特区蛋白的PLA2活性。在VP1独特区蛋白致病机理方面，LINDNERJ等将含有VP1独特区基因片段的质粒转染B细胞，在把转染后的B细胞加入外周血中，可检测到大量淋巴细胞分泌干扰素IFN，用流式细胞仪进行淋巴细胞分类，发现大部分是CD4T细胞。此外，有PLA2活性的VP1独特区蛋白会刺激滑膜细胞产生环氧合酶2COX2，从而使前列腺素E合成增多。在B19病毒感染导致内皮细胞功能障碍机制研究中，发现具有PLA2活性的VP1独特区可以打开细胞膜上的CA2通道，提高内皮细胞内的CA2浓度，而内皮细胞功能就是由细胞内CA2活性所调节，从而提示。
17、VP1独特区蛋白与内皮细胞功能障碍有关。另外，VP1独特区蛋白还被认为通过细胞外信号调节激酶1和2ERK1/2和JNK信号通路刺激产生IL1、IL6和金属蛋白酶9MMP9。在B19病毒感染急性期，VP1独特区蛋白中PLA2结构域刺激机体产生抗磷脂抗体APL，其中最主要的是抗心磷脂抗体ACL和抗2糖蛋白抗体A2GP。进一步研究发现VP1独特区蛋白刺激产生的A2GP可导致抗磷脂综合征APS。后续，将抗B19病毒VP1独特区蛋白的IGG注射小鼠，小鼠会出现血小板减少、活化部分凝血酶原时间延长、APL和抗双股DNAADSDNA抗体产生，并且通过磷脂酰肌醇3激酶PI3K和ERK产生了MMP9。发明内容0。
18、010本发明解决的问题在于提供一种B19病毒VP1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用，克服了用活病毒构建病毒性肾病动物模型的缺陷。0011本发明是通过以下技术方案来实现B19病毒VP1独特区蛋白在制备构建病毒性肾病模型的试剂中的应用。0012所述B19病毒VP1独特区蛋白被制成注射剂。0013所述的注射剂中B19病毒VP1独特区蛋白的浓度不小于10MG/ML。0014所述的注射剂中B19病毒VP1独特区蛋白的浓度为12MG/ML。说明书CN104083753A4/7页60015所述的试剂为引起肾脏组织病毒性病变及尿液改变的试剂。0016所述的肾脏组织病毒性病变表现为光显微镜、透射电镜下能够观察。
19、到的病毒性病变。0017所述的肾脏组织病毒性病变表现为TUNEL免疫荧光能够检测到的病毒性病变。0018所述的尿液改变包括检测到尿蛋白、尿隐血的改变。0019B19病毒VP1独特区蛋白在构建病毒性肾病模型中的应用。0020与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供B19病毒VP1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用，以纯化好的B19病毒VP1独特区蛋白（分子量22KDA，浓度12MG/ML，纯度967经尾静脉注射BALB/C小鼠。共注射3次，每次间隔10D，最后1次注射后10D，取标本进行相关检测。经肾脏组织分别行光镜、电镜和TUNEL免疫荧光分析，尿液行尿常规检查。结果表明B19病。
20、毒VP1独特区蛋白引起肾脏组织及尿液改变，说明了其能够成功的构建病毒性肾病动物模型。0021与现有技术相比，常见的活病毒感染建立病毒性肾病动物模型有一定的危险性，而本发明采用B19病毒VP1独特区蛋白建立病毒性肾病动物模型具有安全性好、可操作性好及成功率高的特点。附图说明0022图1是光镜鉴定病毒性肾病模型结果；A图200所示为B19病毒VP1独特区蛋白干预组；B图200所示为对照组。0023图2是电镜鉴定病毒性肾病模型结果；A图30000所示为B19病毒VP1独特区蛋白干预组，B图20000所示为B19病毒VP1独特区蛋白干预组，C图70000所示为对照组。0024图3是TUNEL免疫荧光鉴。
21、定病毒性肾病模型结果；B19病毒VP1独特区蛋白干预组，可见绿色荧光代表细胞凋亡；对照组无绿色荧光，蓝色信号提示DAPI衬染细胞核，MERGE为TUNEL和DAPI合并。具体实施方式0025下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。0026本发明采用李志宏、张国成等于2007年在细胞与分子免疫学杂志中公开的人微小病毒B19VP1独特区蛋白的表达及纯化过程的可行性表达纯化B19病毒VP1独特区蛋白，后续具体方案按以下予以实现。00271B19病毒VP1独特区蛋白注射小鼠选择6周龄BALB/C小鼠；使用B19病毒VP1独特区蛋白每次尾静脉注射12GVP1独特区。
22、蛋白（浓度为12MG/ML），对照组予以生理盐水注射；所述的B19病毒VP1独特区蛋白分子量22KDA，纯度967；共注射3次，每次间隔10D；最后1次注射后10D，取标本进行相关检测。说明书CN104083753A5/7页700282光镜观察肾脏组织病变情况取材。处死B19病毒VP1独特区蛋白注射后小鼠，迅速取出肾脏组织，将其切为5MM厚组织块；固定。快速将切好的组织块放入中性福尔马林液，固定24H；脱水。将固定好组织顺次浸泡于70酒精2H、80酒精2H、95酒精2H、95酒精2H、无水酒精2H、无水酒精2H；透明。将脱水后组织顺次浸泡于11二甲苯与无水酒精混合液2H、二甲苯2H、二甲苯2H。
23、；浸蜡。5658将三个蜡杯中石蜡熔化，保持熔蜡在58，把透明处理过组织顺次浸泡于三个蜡杯，每个蜡杯中浸泡1H；包埋。在包埋框中倒入熔化的石蜡，接着把已经浸蜡处理的组织放入，待石蜡凝固后就形成石蜡包埋块；切片。切片机将组织切为4M厚组织片，切片置于载物片表面，放入60烤箱30MIN；脱蜡。把烤好的切片依次放入二甲苯5MIN和二甲苯5MIN；复水。把脱蜡后切片顺次放入无水酒精5MIN、95酒精5MIN、80酒精5MIN、70酒精5MIN、蒸馏水5MIN；染色。把复水后组织切片用去离子水洗涤干净，浸泡于HARRIS苏木精液5MIN，在自来水下冲洗掉多余染液，再浸泡于1盐酸酒精5MIN，进行分色处理，。
24、接着放入自来水浸泡返蓝，返蓝以后浸泡于去离子水5MIN，最后用05伊红酒精染色3MIN；脱水。将染色后切片顺次浸泡于95酒精5MIN、95酒精5MIN、无水酒精5MIN、无水酒精5MIN；透明。将脱水后组织切片依次放入11无水酒精与二甲苯混合液、二甲苯5MIN、二甲苯5MIN；封藏。在透明后的组织切片中央滴一滴树胶，接着加盖盖玻片；显微镜观察，拍照。0029检测结果如图1所示，其中A图200所示为B19病毒VP1独特区蛋白干预组；B图200所示为对照组。A图可见肾小管内大量红细胞箭头所标示，肾小球缩小。表明B19病毒VP1独特区蛋白干预之后出现了肾脏组织病变。00303电镜观察肾脏组织病变情况。
25、取材。用乙醚麻醉小鼠，将麻醉好的小鼠固定在解剖板上，剪刀迅速剪开腹腔，将肾脏组织取出，在冰盒上切成1MM1MM3MM组织块；固定。将4戊二醛20倍标本体积加入组织块，固定24H，1锇酸再固定2H，固定结束后，漂洗30MIN；脱水。固定好的组织块依次放入50丙酮10MIN、70丙酮10MIN、90丙酮15MIN、100丙酮20MIN；浸透。用丙酮和11混合包埋液邻苯二甲酸二丁酯与环氧树脂浸透组织块30MIN，然后取出组织块，放入混合包埋液中浸透12H；包埋。在橡胶包埋板中加入混合包埋液，放入组织块、编码条，滴满包埋液，45烤说明书CN104083753A6/7页812H，60烤48H，将包埋块取。
26、出；修块。把包埋块固定于夹持器尖端，通过解剖显微镜用刀片削出肾脏组织，修整整齐；超薄切片。将包埋块固定于超薄切片机上，安装切割刀，调节水槽中液平面与光源的位置、切片速度，进行切片，后小心将切片捞在载网上；超薄切片染色。在蜡板表面滴上柠檬酸铅，用镊子夹在载网边缘，将组织超薄切片浮于柠檬酸铅中，染色15MIN后取出，用去离子水清洗干净；观察记录数据。运行JEM22000EX透射电镜，将载网放入，观察病理改变并拍照。0031检测结果如图2所示，其中A图30000所示为B19病毒VP1独特区蛋白干预组，B图20000所示为B19病毒VP1独特区蛋白干预组，C图70000所示为对照组。A图可见足细胞足突。
27、融合。B图可见肾小管空泡化。表明B19病毒VP1独特区蛋白干预之后出现了肾脏组织病变。00324检测干预后鼠尿液变化情况将最后1次注射B19病毒VP1独特区蛋白再饲养10天的BALB/C小鼠饲养在代谢笼中，代谢笼下面罩一个塑料漏斗，收集BALB/C小鼠尿液；收集完毕后1000RPM离心10MIN，吸取上清进行检查；将收集的尿液用ANIMAL2006型尿液分析仪检测。0033检测结果如表1所示表1B19病毒VP1独特区蛋白注射小鼠后尿液检测数值N15结果表明与对照组相比，B19病毒VP1独特区蛋白干预之后出现了尿蛋白、尿隐血的显著增加，表明B19病毒VP1独特区蛋白干预之后肾脏组织病变。0034。
28、5TUNEL免疫荧光检测肾脏组织细胞凋亡石蜡切片脱蜡。将石蜡切片放入染色缸中，顺次放入二甲苯5MIN、二甲苯5MIN、二甲苯5MIN；水化。将载玻片顺次放入无水酒精5MIN、无水酒精5MIN、95酒精3MIN、80酒精3MIN、70酒精3MIN、50酒精3MIN；洗涤。将载玻片浸入085NACL，室温放置5MIN；再将载玻片浸入PBS液，室温放置5MIN；固定。将载玻片浸入4多聚甲醛溶液PBS配制，室温放置15MIN；洗涤。将载玻片浸入PBS，室温放置5MIN，共洗涤2次；去除组织上的液体，在每片载玻片上各加上100L蛋白酶K20G/ML，室温孵育10MIN，然后PBS洗涤1次；重复步骤、；说。
29、明书CN104083753A7/7页9吸干载玻片上多余液体，用100L平衡缓冲液DEADEND荧光测定TUNEL系统自带试剂覆盖组织，在室温下放置10MIN；在平衡细胞时，冰上解冻核苷混合物DEADEND荧光测定TUNEL系统自带试剂，并在冰上准备足够用于实验样本和阳性对照的RTDT孵育缓冲液DEADEND荧光测定TUNEL系统自带试剂，注意避光；平衡细胞结束后，吸水纸吸掉大部分平衡缓冲液，然后在细胞上加上50LRTDT孵育缓冲液；此后载玻片需避光，把塑料盖玻片盖在组织上以保证试剂均匀分布，将载玻片置于湿盒内，37孵育70MIN；移除塑料盖玻片，将载玻片浸入装有2SSC液体的染色缸中，室温放置。
30、15MIN终止反应，PBS液洗涤2次；将载玻片用VECTASHIELDMOUNTINGMEDIUMWITHDAPI封片并染核，加盖玻片，盖玻片时不能有气泡产生；荧光显微镜下观察，用标准的荧光过滤装置在52020NM荧光下观察绿色荧光，在460NM观察蓝色DAPI。0035检测结果如图3所示，其中B19病毒VP1独特区蛋白干预组，可见代表细胞凋亡的绿色荧光；对照组无绿色荧光，仅显示提示DAPI衬染细胞核的蓝色荧光。MERGE显示了凋亡的细胞在DAPI衬染细胞中的分布。0036本发明提供了B19病毒VP1独特区蛋白可应用于建立病毒性肾病动物模型，通过光镜、电镜、尿液检测、TUNEL免疫荧光证实该动物模型建立成功。所以，B19病毒VP1独特区蛋白可应用于制备构建病毒性肾病模型的试剂。常见的活病毒感染建立病毒性肾病动物模型有一定的危险性，而本发明提供了新的病毒性肾病动物模型的制备方式，可用于病毒性肾病病理生理、药物开发等研究。说明书CN104083753A1/2页10图1图2说明书附图CN104083753A102/2页11图3说明书附图CN104083753A11。