两种组合物在制备联合治疗糖尿病肾病药物中的应用.pdf

本发明公开了两种组合物在制备联合治疗糖尿病肾病药物中的应用，所述两种组合物分别是组合物A和组合物B，所述组合物A由下列原料药构成：人参、水蛭、土鳖虫、制乳香、赤芍、降香、檀香、全蝎、蝉蜕、蜈蚣、冰片、炒酸枣仁；所述组合物B由下列重量份的原料药构成：人参、黄精、苍术、苦参、茯苓、麦冬、炙何首乌、地黄、山茱萸、黄连、佩兰、荔枝核、淫羊藿、知母、丹参、葛根、地骨皮；组合物A和组合物B在制备联合抑制Akt/mTOR信号转导通路活化的药物中的应用。本发明采用组合物A和组合物B联合治疗糖尿病肾病的效果好，没有明显副作用。

1.  两种组合物在制备联合治疗糖尿病肾病药物中的应用，所述两种组合物分别是组合物A和组合物B，所述组合物A由下列重量份的原料药构成：人参3-10、水蛭3-11、土鳖虫5-10、制乳香1-5、赤芍3-9、降香1-5、檀香1-5、全蝎3-9、蝉蜕3-12、蜈蚣1-3、冰片1-7、炒酸枣仁3-10；所述组合物B由下列重量份的原料药构成：人参42-160、黄精50-200、苍术30-100、苦参20-60、茯苓35-100、麦冬50-200、制何首乌35-100、地黄50-120、山茱萸50-200、黄连20-60、佩兰30-60、荔枝核75-150、淫羊藿30-60、知母30-100、丹参35-120、葛根50-200、地骨皮30-100。

2.  根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物A由如下重量份数的原料药制成：
人参6   水蛭10   土鳖虫7   制乳香2   赤芍5    降香2   
檀香2   全蝎7    蝉蜕7    蜈蚣1    冰片5    炒酸枣仁5；
所述组合物B由如下重量份数的原料药制成：
人参42、黄精200 、苍术30、苦参60、茯苓35、麦冬200、制何首乌35、地黄120、山茱萸50、黄连60、佩兰30、荔枝核150、淫羊藿30、知母100、丹参35、葛根200、地骨皮30。

3.  根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物A由如下重量份数的原料药制成：
人参 6   水蛭 11   土鳖虫 7   制乳香2   赤芍 5    降香 2   
檀香 2   全蝎 3    蝉蜕 7    蜈蚣 1    冰片 5    炒酸枣仁5；
所述组合物B由如下重量份数的原料药制成：
人参102、黄精136 、苍术68、苦参56、茯苓83、麦冬136、制何首乌83、地黄102、山茱萸136、黄连56、佩兰56、荔枝核136、淫羊藿56、知母68、丹参89、葛根136、地骨皮83。

4.  根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物A由如下重量份数的原料药制成：
人参 10   水蛭 8   土鳖虫 7  制乳香 2   赤芍 5    降香 2   
檀香 2   全蝎 9    蝉蜕 7    蜈蚣 1    冰片 5    炒酸枣仁5；
所述组合物B由如下重量份数的原料药制成：
人参160、黄精50 、苍术100、苦参20、茯苓100、麦冬50、
制何首乌100、地黄50、山茱萸200、黄连20、佩兰60、荔枝核75、淫羊藿60、知母30、丹参120、葛根50、地骨皮100。

5.  根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述组合物A的活性成分由以下步骤制成：
a 平均粒径小于100 μm的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕及制乳香药粉;
b 冰片药粉;
c 由降香和檀香提取的挥发油;
d 人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸膏;
e 提取成分c后的降香和檀香药渣的水提液、赤芍和炒酸枣仁加水煎煮后的水提液以及提取成分d后的人参药渣的水提液过滤、混匀后浓缩成的水提浸膏；
 所述组合物B的活性成分由以下步骤制成:
 a、按照原料药重量比例称取中药材，净选、碎断；
b、佩兰、苍术加5-9倍量水提取挥发油，提取3-6小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用；
c、山茱萸用5-9倍量50-90%乙醇做溶剂，浸渍12-48小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，烘干，备用；
d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加6-10倍量50-90%乙醇，回流提取1-3次，每次1-3小时，提取液过滤，回收乙醇，浓缩成稠膏，烘干，备用；
e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加7-11倍量水，煎煮1-2次，每次1-3小时，提取液过滤，与步骤b中佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩成清膏，加乙醇调节醇浓度为50-80%，冷藏放置，过滤，滤液回收乙醇，浓缩至稠膏，烘干，备用；
步骤c所得山茱萸干膏、步骤d所得醇提干膏、步骤e 所得水提醇沉干膏与步骤b所得挥发油共同构成该中药组合物的活性成分。

6.  根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述组合物A和组合物B的制剂剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂。

7.  根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述组合物A的胶囊剂的制备过程如下：
a) 按照重量份比例称取各原料药；
b) 药材粉碎工艺： 
将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于100 μm；待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；
c) 提取浓缩和干燥工艺：
降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和炒酸枣仁加水煎煮，水提液过滤后，待浓缩成浸膏；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，浓缩成醇提浸膏，水提液过滤与所有的水提液混匀后浓缩成水提浸膏；
d) 制剂工艺：
在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤c）所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成胶囊。

8.  根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述组合物B的颗粒剂的制备过程如下：
a、按照原料药重量比例称取中药材，净选、碎断；
b、佩兰、苍术合并，加5-9倍量水，水蒸汽法提取挥发油，提取3-6小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用；
c、山茱萸用5-9倍量50-90%乙醇做溶剂，浸渍12-48小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，烘干，备用；
d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加6-10倍量50-90%乙醇，回流提取1-3次，每次1-3小时，提取液过滤，回收乙醇，浓缩成稠膏，烘干，备用；
e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加7-11倍量水，煎煮1-2次，每次1-3小时，提取液过滤，与步骤b中佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩成清膏，加乙醇调节醇浓度为50-80%，冷藏放置，过滤，滤液回收乙醇，浓缩至稠膏，烘干，备用；
f、将步骤c所得山茱萸干膏、步骤d所得醇提干膏、步骤e所得水提醇沉干膏混合均匀，粉碎，加入辅料制粒；
g、步骤b所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤f所得的颗粒，混匀，密闭，分装，即得。

9.  根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，组合物A和组合物B在制备联合抑制Akt/mTOR信号转导通路活化的药物中的应用。

两种组合物在制备联合治疗糖尿病肾病药物中的应用
技术领域
本发明属于药物应用领域，具体来说是两种中药组合物联合在治疗糖尿病肾病中的应用。
背景技术
糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）作为糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一，严重影响着糖尿病患者的生活质量。DN发病机制非常复杂，至今尚未完全阐明。遗传因素、糖脂代谢紊乱、肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）失调、肾小球血液流变学和血流动力学的改变、炎症浸润、以及多种生长因子和细胞因子的表达异常均参与了DN的发生和发展。在众多发病因素中，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）在DN病变中具有重要作用，可刺激内皮细胞增殖分化、抑制内皮细胞凋亡、增强血管通透性，还可上调黏附分子及炎症因子等的表达，从而加剧DN的恶化。此外，VEGF的异常表达还可刺激PI3K/Akt/mTOR信号转导通路激活，该信号通路被激活后，下游蛋白分子发生磷酸化，从而导致核糖体生物合成增强，产生促增殖和抗凋亡效应，最终引起肾小球内皮细胞、系膜细胞增殖，表现为成纤维细胞的增生和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的积聚，导致肾小球硬化、肾脏纤维化。早在机体发生胰岛素抵抗阶段，持续高血糖状态就可诱导肾脏多种细胞表型中Akt/mTOR信号通路的激活，因而，对该信号通路及VEGF的深入研究有助于完善DN发病机制，为开发新药提供理论依据。
到目前为止，尚无逆转或阻断DN进展的药物。现代医学对DN的治疗主要是对症治疗，如降糖、降压、纠正脂代谢紊乱及低蛋白饮食等，临床常用血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI）和血管紧张素II受体拮抗剂（angiotensin II receptor antagonist, ARB），它们通过抑制RAS系统而降低系统血压和肾内血压，改善肾小球滤过膜的通透性，减少尿白蛋白排泄，产生肾脏保护作用。然而，DN发病机制非常复杂，此类单靶点药物只能延缓DN的进展，并不能完全阻断其发展为终末期肾病，而且容易导致低血压、高血钾、血管神经性水肿和过敏性皮炎等毒副作用。
发明内容
本发明的目的是提供两种组合物在联合治疗糖尿病肾病中的应用，
本发明所采用的技术方案是：
两种组合物在制备联合治疗糖尿病肾病药物中的应用，所述两种组合物分别是组合物A和组合物B，所述组合物A由下列重量份的原料药构成：人参3-10、水蛭3-11、土鳖虫5-10、制乳香1-5、赤芍3-9、降香1-5、檀香1-5、全蝎3-9、蝉蜕3-12、蜈蚣1-3、冰片1-7、炒酸枣仁3-10；所述组合物B由下列重量份的原料药构成：人参42-160、黄精50-200、苍术30-100、苦参20-60、茯苓35-100、麦冬50-200、制何首乌35-100、地黄50-120、山茱萸50-200、黄连20-60、佩兰30-60、荔枝核75-150、淫羊藿30-60、知母30-100、丹参35-120、葛根50-200、地骨皮30-100。
作为优选方式，所述组合物A由如下重量份数的原料药制成：
人参 6   水蛭 10   土鳖虫 7   制乳香 2   赤芍 5    降香 2   
檀香 2   全蝎 7    蝉蜕 7    蜈蚣 1    冰片 5    炒酸枣仁5；
所述组合物B由如下重量份数的原料药制成：
人参42、黄精200 、苍术30、苦参60、茯苓35、麦冬200、制何首乌35、地黄120、山茱萸50、黄连60、佩兰30、荔枝核150、淫羊藿30、知母100、丹参35、葛根200、地骨皮30。
或所述组合物A由如下重量份数的原料药制成：
人参 6   水蛭 11   土鳖虫 7   制乳香2   赤芍 5    降香 2   
檀香 2   全蝎 3    蝉蜕 7    蜈蚣 1    冰片 5    炒酸枣仁5；
所述组合物B由如下重量份数的原料药制成：
人参102、黄精136 、苍术68、苦参56、茯苓83、麦冬136、制何首乌83、地黄102、山茱萸136、黄连56、佩兰56、荔枝核136、淫羊藿56、知母68、丹参89、葛根136、地骨皮83。
或所述组合物A由如下重量份数的原料药制成：
人参 10   水蛭 8   土鳖虫 7  制乳香 2   赤芍 5    降香 2   
檀香 2   全蝎 9    蝉蜕 7    蜈蚣 1    冰片 5    炒酸枣仁5；
所述组合物B由如下重量份数的原料药制成：
人参160、黄精50 、苍术100、苦参20、茯苓100、麦冬50、
制何首乌100、地黄50、山茱萸200、黄连20、佩兰60、荔枝核75、淫羊藿60、知母30、丹参120、葛根50、地骨皮100。
所述组合物A的活性成分由以下步骤制成：
a 平均粒径小于100 μm的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕及制乳香药粉;
b 冰片药粉;
c 由降香和檀香提取的挥发油;
d 人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸膏;
e 提取成分c后的降香和檀香药渣的水提液、赤芍和炒酸枣仁加水煎煮后的水提液以及提取成分d后的人参药渣的水提液过滤、混匀后浓缩成的水提浸膏。
所述组合物B的活性成分由以下步骤制成:
 a、按照原料药重量比例称取中药材，净选、碎断；
b、佩兰、苍术加5-9倍量水提取挥发油，提取3-6小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用；
c、山茱萸用5-9倍量50-90%乙醇做溶剂，浸渍12-48小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，烘干，备用；
d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加6-10倍量50-90%乙醇，回流提取1-3次，每次1-3小时，提取液过滤，回收乙醇，浓缩成稠膏，烘干，备用；
e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加7-11倍量水，煎煮1-2次，每次1-3小时，提取液过滤，与步骤b中佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩成清膏，加乙醇调节醇浓度为50-80%，冷藏放置，过滤，滤液回收乙醇，浓缩至稠膏，烘干，备用；
步骤c所得山茱萸干膏、步骤d所得醇提干膏、步骤e 所得水提醇沉干膏与步骤b所得挥发油共同构成该中药组合物的活性成分。
为实现上述技术方案，将组合物A和组合物B的制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂。
其中，所述组合物A的胶囊剂的制备过程如下：
a) 按照重量份比例称取各原料药；
b) 药材粉碎工艺： 
将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于100 μm；待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；
c) 提取浓缩和干燥工艺：
降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和炒酸枣仁加水煎煮，水提液过滤后，待浓缩成浸膏；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，浓缩成醇提浸膏，水提液过滤与所有的水提液混匀后浓缩成水提浸膏；
d) 制剂工艺：
在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤c）所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成胶囊。
组合物B的颗粒剂的制备过程如下：
a、按照原料药重量比例称取中药材，净选、碎断；
b、佩兰、苍术合并，加5-9倍量水，水蒸汽法提取挥发油，提取3-6小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用；
c、山茱萸用5-9倍量50-90%乙醇做溶剂，浸渍12-48小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，烘干，备用；
d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加6-10倍量50-90%乙醇，回流提取1-3次，每次1-3小时，提取液过滤，回收乙醇，浓缩成稠膏，烘干，备用；
e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加7-11倍量水，煎煮1-2次，每次1-3小时，提取液过滤，与步骤b中佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩成清膏，加乙醇调节醇浓度为50-80%，冷藏放置，过滤，滤液回收乙醇，浓缩至稠膏，烘干，备用；
f、将步骤c所得山茱萸干膏、步骤d所得醇提干膏、步骤e 所得水提醇沉干膏混合均匀，粉碎，加入辅料制粒；
g、步骤b所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤f所得的颗粒，混匀，密闭，分装，即得。
作为优选方式，组合物A和组合物B在制备联合抑制Akt/mTOR信号转导通路活化的药物中的应用。
为了验证组合物A和组合物B的在联合治疗糖尿病肾病中的作用，做了如下实验：
多种因素参与了DN肾脏病理和功能的改变，人们对与其有关的细胞因子和细胞信号传导途径进行了大量的研究，发现高糖可以激活多种细胞内信号因子从而导致靶器官损伤，PI3K/Akt/mTOR通路就是其中与DM肾小球硬化有着密切联系的信号途径之一。
1. mTOR简介
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin, mTOR)是大环内酯类抗生素雷帕霉素在哺乳动物体内作用的靶分子。mTOR形成了结构和功能各不相同的两个蛋白复合物，分别为mTORC1（mTOR complex1）和mTORC2，其中mTORC2对雷帕霉素的抑制作用不敏感，主要以mTORC1参与Akt/mTOR通路的信号传导，并发挥相应作用。当体内营养物质、能量水平、各类生长因子如胰岛素及胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor, IGF）等信号发生变化后，mTORC1可通过促使下游的核糖体S6蛋白激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-Binding Protein 1，4E-BP1）磷酸化，从而调节mRNA翻译、蛋白质合成、细胞周期进展和能量代谢等重要功能，在细胞的增殖、生长、分化过程中起着中心调控点的作用。mTOR对于低等和高等动物的生长和发育都是必不可少的，将mTOR基因敲除的小鼠死于胚胎早期。
2. PI3K/Akt/mTOR与糖尿病肾病
磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (phosphoinositide3-kinase/protein kinase B, PI3K/PKB)是细胞内独立于其他通路的一个较新的信号转导系统，mTOR位于该通路下游从而构成PI3K/PKB/mTOR通路。PKB是反转录病毒Akt-8的癌基因V-akt编码的蛋白产物，故又称Akt。在各种细胞因子作用下，PI3K活化生成3位磷酸化的磷脂产物而引起Akt与膜结合，在磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶 (PI3K-dependent kinase, PDK)作用下，PKB的苏氨酸和丝氨酸残基发生磷酸化而进入胞质和胞核，直接或间接通过结节性硬化复合体（tuberous sclerosis complex，TSC）激活mTOR蛋白，调节下游效应分子S6K1和4E-BP1的表达，从而调节细胞生长、增殖及细胞周期的变化，参与细胞大小甚至生物体大小的调控。
在DM高糖状态下，肾脏多种细胞表型的PI3K/Akt/mTOR信号通路均被激活，进而引起血管平滑肌增殖、系膜细胞肥大增殖、细胞外基质积聚，促进DN早期肾脏的肥大。最近研究表明，无论1型或2型DM动物模型，Akt/mTOR信号转导通路都被激活，而使用雷帕霉素特异性阻断mTOR通路则可以抑制系膜扩张及肾脏肥大，从而延缓DN的进展。利用单侧肾切除的小鼠模型研究代偿性肾脏肥大的机制时，证实在单侧肾切除后，残肾的mTOR通路被激活，其下游效应分子P70S6K和4E-BP1磷酸化增加，引起肾脏肥大，而使用雷帕霉素特异性阻断mTOR及其下游蛋白S6K1和4E-BP1的磷酸化，显著抑制肾脏肥大。
此外，Akt/mTOR信号通路在DM阶段就参与影响体内对胰岛素的敏感性，并能促进低氧诱导因子（hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α）、血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial grow factor, VEGF）、转化生长因子β1（transforming growth factor β1, TGF-β1）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）等的表达，加剧DN的恶化。同时，VEGF、TGF-β1与AngⅡ等因子表达的增强又能反作用于Akt/mTOR通路，促使该通路激活。由此可见，VEGF、TGF-β1等生长因子能与Akt/mTOR信号通路相互影响，加快DN的进展。
Akt/mTOR信号转导通路的过度活化在胰岛素抵抗、DM及DN发病中产生重要推动作用，雷帕霉素通过抑制Akt/mTOR通路的活化，不仅能改善胰岛素抵抗，还可降低VEGF、TGF-β等因子的表达，从而减轻DM早期肾脏损害和晚期肾小球基底膜增厚，减少尿白蛋白排泄，延缓DN的进展。然而，由于雷帕霉素具有全身免疫抑制等毒副作用，影响其广泛长期应用。
材料与方法
1 实验材料
1.1 实验动物
SPF级健康雄性SD大鼠80只，体重200±10g，购自中国食品药品检定研究院，许可证编号：SCXK（京）2007-0017。
1.2 实验用药
高糖高脂鼠料，配方：20%蔗糖，10%猪油，5%蛋黄粉，2.5%胆固醇，1%胆酸盐，61.5%普通饲料，购自北京科澳协力饲料有限公司，许可证编号：SCXK（京）2009-0012。
1.3 实验试剂
 小鼠VEGF单克隆抗体                    美国Santa Cruz公司
SP法检测试剂盒SP-9001, 9002         北京中杉金桥生物公司
兔抗大鼠Akt多克隆抗体      美国SAB公司
兔抗大鼠p-Akt多克隆抗体    美国SAB公司
兔抗大鼠mTOR多克隆抗体     美国bioworld公司
兔抗大鼠p-mTOR多克隆抗体   美国bioworld公司
鼠抗人GAPDH单克隆抗体      美国Santa Cruz 公司
辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体  北京中杉金桥生物公司
DAB增强显色试剂盒           天根生物工程公司
考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒    南京建成生物工程研究所
聚偏二氟乙烯膜（PVDF，0.45um） 美国Solarbio公司 
十二烷基磺酸钠（SDS）          美国Solarbio公司
溴酚蓝                         美国Solarbio公司
甘氨酸（Gly）                  美国Solarbio公司
丙烯酰胺                      美国Solarbio公司  
N,N’-甲叉双丙烯酰胺          美国Solarbio公司
过硫酸铵（APS）               美国Solarbio公司
四甲基乙二胺（TEMED）         美国Solarbio公司
苯甲基磺酰氟化物（PMSF）   美国Amresco公司
抑肽酶（Aproptinin）        美国Amresco公司
亮抑肽酶（Leupeptin）      美国Amresco公司
胰蛋白酶抑制剂(Ttypsinin inhibitor)    美国Amresco公司
抑制金属蛋白酶（EGTA）        美国Amresco公司
乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂）  华美生物公司
预染中分子量蛋白 （marker）  上海捷瑞生物工程公司
三羟甲基氨基甲烷(Tris)       天津市华东试剂厂
DAB 显色试剂盒               北京中山生物技术公司
考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒     南京建成生物技术公司
牛血清白蛋白（BSA）          美国 Sigma 公司
脱脂奶粉                     完达山乳制品有限公司
 1.4 实验仪器

   2 实验方法
2.1 动物分组
选用SPF级健康雄性SD大鼠80只，体重200±10g，以普通饲料适应性喂养一周后，按体重随机分为正常组（Normal）10只，模型组（Model）、厄贝沙坦组（Irbesartan）、组合物A组（TXL）、组合物B组（JLD）和组合物A和组合物B联用组（TXl+JLD）各14只。实验期间，正常组大鼠给予自来水和普通饲料，其他各组大鼠给予高糖高脂饲料，并在前四周内饮用10%蔗糖水，用于加速胰岛素抵抗的形成。
2.2 模型制备
2.2.1 溶液配制
柠檬酸缓冲液：将2.1g柠檬酸加入双蒸水100ml中配成A液，2.94g柠檬酸钠加入双蒸水100ml中配成B液，取A液114ml与B液86ml混合为柠檬酸缓冲液，PH值约为4.4。
STZ（链脲佐菌素）溶液：将100mg STZ溶于10ml柠檬酸缓冲液中，配为1%的 STZ溶液，0.22μm微孔滤膜过滤杂质后4℃避光，并在30分钟内用完，现用现配。
2.2.2 动物造模
除正常组外，各组大鼠于四周末晚20:00禁食不禁水，次日9:00开始造模。依次取各组大鼠进行固定，按30mg/kg的剂量尾静脉注射STZ，随后2小时内饮用10%蔗糖水，防止早期血糖过低引起死亡。72小时后尾静脉采血测定大鼠空腹血糖，以空腹血糖≥11.1mmol/L为DM模型制备成功，在本实验中所有大鼠空腹血糖均高于11.1mmol/L。
2.3 给药方法
所有药品溶于5‰的羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose, CMC）溶液中以保持颗粒混悬均匀。按照石家庄以岭药业药理室用药规定，组合物A和组合物B均采用中剂量进行灌胃给药，即组合物A组大鼠给予组合物A0.8g·kg^-1·d^-1，组合物B组给予组合物B1.5g·kg^-1·d^-1，组合物A和组合物B联用组给予(组合物A0.8g +组合物B1.5g)·kg^-1·d^-1；厄贝沙坦组按成人剂量的10倍给药，即25mg·kg^-1·d^-1；模型组给予CMC 10ml·kg^-1·d^-1。每日上午9点左右给药一次，给药干预共12周，给药期间自由饮食。
2.4 标本收集
取材前一天，将各组大鼠放入代谢笼内禁食不禁水，收集5小时尿液后冻存，用于测定尿微量白蛋白。于给药12周末20:00禁食不禁水，次日按0.35g/kg体重腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，将大鼠固定后暴露腹腔，腹主动脉采血10～15ml，静置1小时左右，低温离心留取血清，待测各项生化指标；切取双侧肾脏，剥离表层包膜，放入生理盐水中浸洗，滤纸吸干后称量左肾重；切取左肾皮质部1mm³左右，经2.5%戊二醛固定后做电镜观察；左肾浸入10%中性甲醛固定，用于常规病理学观察及免疫组织化学指标测试；右侧肾脏投入液氮瓶，随后保存于﹣80℃冰箱，用于Western Blot检测。
2.5 观察指标：免疫组织化学法检测大鼠肾脏组织中VEGF蛋白的表达；Western blot检测Akt/mTOR信号转导通路中Akt、mTOR的蛋白表达水平及相应磷酸化蛋白（p-Akt与p-mTOR）的表达水平。
2.5.1免疫组织化学法检测肾组织中VEGF蛋白的表达
2.5.1.1 标本处理：大鼠肾脏组织经4%中性甲醛固定48小时后，使用脱水机梯度乙醇脱水，二甲苯透明，62℃浸腊渗透后放入模具中进行石蜡包埋，待冷却后使用切片机制作4μm厚切片，于漂片机中展开，捞于组化载玻片上，编号，65℃烤4小时左右，待做免疫组化实验。
2.5.1.2 免疫组化SP法步骤：
（1）石蜡切片常规脱蜡水化：浸入二甲苯Ⅰ15min；二甲苯Ⅱ10min，依
次放入100%、100%、95%、80%、70%乙醇中各2min，蒸馏水浸洗1min×2次，PBS浸洗3min；
（2）抗原修复：将组织切片放入抗原修复盒，同时加入220ml修复液（0.01mol/L柠檬酸缓冲液，PH 6.0），放入微波炉中高火3min，停3min，（低火3min，停3min）×3次，低火3min，待降至室温（或取出后静置10min，连盒浸入冷水中至室温），PBS浸洗3min；
（3）阻断内源性过氧化物酶：滴加3%H₂O₂，37℃恒温箱孵育10min，PBS浸洗3min×3次；
（4）血清封闭：滴加10%正常山羊血清，37℃恒温箱封闭20min，倾去，勿洗；
（5）第一抗体：滴加1:150稀释后的VEGF抗体，置于湿盒内4℃过夜    （约16小时）后，37℃复温45min，PBS浸洗5min×3次；
（6）第二抗体：滴加生物素标记的相应二抗，37℃孵育30min，PBS浸洗5min×3次；
（7）滴加HRP标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS浸洗5min×3次；
（8）滴加DAB显色5-10min，蒸馏水终止染色；
（9）苏木素复染40s、1%盐酸酒精分化1s、自来水浸洗2min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片（本实验中同时以PBS代替一抗作为阴性对照）。
2.5.2 Western blot检测肾组织中Akt/mTOR信号转导通路中的蛋白表达
2.5.2.1试剂配制
组织裂解液

 30%丙烯酰胺贮液
丙烯酰胺58g，N,N’甲叉双丙烯酰胺2g，加双蒸水定容至200mL，滤纸过滤，棕色瓶4℃保存。
Tris-HCl (pH 8.8)
称取18.16g Tris，4M HCL调pH至8.8，加双蒸水定容至100 mL，4℃保存备用。
Tris-HCl (pH 6.8)
称取6.06g Tris，4M HCL调pH至6.8，加双蒸水定容至100mL，4℃保存备用。
4M HCl 
36％盐酸40.5mL，加双蒸水定容至100mL。
10％APS
称取100mg过硫酸铵，用1mL双蒸水溶解，使用前新鲜配制。
10%SDS
称取10g SDS，双蒸水缓慢溶解，定容至100mL，常温保存。
5×电泳缓冲液（pH 8.3）
Tris 15.15g，甘氨酸 72.05g，SDS 5g，双蒸水定容至1000mL，用时稀释5倍。
5×转移缓冲液
Tris 15.15g，甘氨酸 72.05g，双蒸水定容至800mL，用时取160mL，双蒸水稀释至800mL，再加200mL甲醇。
10×TBS漂洗液
Tris 12.1g，氯化钠 40.03g，6M HCL 12.8 mL，双蒸水定容至500 mL，用时稀释10倍。
10×丽春红染液
丽春红S 2g，三氯乙酸 30g，磺基水杨酸 30g，双蒸水溶解并定容至100 mL，用时稀释10倍。
10％分离胶10mL

5％浓缩胶5 mL

5×蛋白上样缓冲液

膜封闭液

抗体稀释液

 2.5.2.2. 总蛋白提取与Western blot分析
组织剪碎后置匀浆套管中，按每100mg组织1ml的量加入RIPA裂解液（150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，pH7.8，0.1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS，0.1% EDTA）匀浆。冰浴反应30min，然后4℃、8000rpm离心10min，取上清（即蛋白提取液）加入PMSF调至终浓度为1%，-20℃保存。
2.5.2.3 蛋白浓度的测定
取1cm光径比色杯，据考马斯亮蓝试剂盒说明，用分光光度计测定样品595nm OD值，按如下公式计算样品浓度（g/L）：

2.5.2.4 SDS-PAGE电泳
（1）胶板制备：配制10% SDS-PAGE分离胶，缓慢注入两玻璃板的夹层待分离胶聚合后，灌入5%浓缩胶，使分离胶与浓缩胶的高度比为3：2。待浓缩胶聚合后，拔掉梳齿，制成的胶板供作SDS-PAGE垂直电泳用。
（2）上样：取等量蛋白样品与5×SDS上样缓冲液（0.1mmol/ L Tris-HCl pH6.8，20%甘油，0.1%溴酚蓝，10% β-巯基乙醇，4% SDS）混合均匀，100℃沸水浴加热5min使蛋白变性。冷却后，用微量加样器在上述电泳胶板的加样孔中，每孔加入含50μg蛋白的蛋白样品电泳加样液。在Marker加样孔中加入10μL的预染Marker液。
（3）电泳：开始电压50V，待蛋白样品电泳加样液中的溴酚蓝泳至浓缩胶与分离胶交界部时，电压改为100V。待溴酚蓝泳至距分离胶末缘上1cm，停止电泳。
（4）转膜：依示目的蛋白分子量的Marker蛋白分离条带，切下电泳后含目的蛋白的胶，与PVDF膜对齐贴紧成一体后，在上下两面各放三层滤纸压紧，用电泳转膜仪，4℃、100V、250mA， 电泳转膜2.5h。
（5）封闭：取下转膜后的PVDF膜，丽春红染液观察转膜效果。在摇床上用蒸馏水振荡冲洗3遍（5 min/次，下同）。置塑料薄膜袋内，用5% 脱脂奶粉振荡封闭1h。
（6）加一抗：将上述封闭处理的PVDF膜取出，用TTBS振荡冲洗3遍。置塑料薄膜袋内，加入用抗体稀释液1：200稀释的一抗，摇床混匀后4℃过夜。
（7）加二抗：取出上述加一抗处理的PVDF膜，TTBS振荡冲洗3遍。置塑料薄膜袋内，加入用TTBS 1: 3000稀释的二抗，4℃孵育1h。
（8）化学发光法检测：首先用TTBS室温洗膜3次，每次10min，然后用TBS (10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl) 洗膜1次，约5 min。抗体结合区带用化学发光法检测。
（9）结果分析：将DAB显色的PVDF膜在凝胶成像仪上照像，使用Gel Pro Analyzer 4.0进行定量分析，以样品的IOD与GAPDH 的IOD比值表示。
3 统计学处理
运用SPSS13.0进行统计分析，首先进行正态性检验，若数据符合正态分布，采用单因素方差分析（One-way ANOVA），当方差齐时，组间两两比较采用LSD法，方差不齐时，采用Dunnett’s T3近似检验；若数据不符合正态分布，则进行对数转换或采用非参数秩和检验。本实验中所有数据均符合正态分布，用s表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
1 免疫组化检测结果（见图1）
在正常组大鼠肾脏中，VEGF主要在肾小球和肾小管中表达，以肾小管的阳性染色较为明显；与正常组相比，模型组中VEGF的表达范围有所扩大，特异性染色也明显增强，部分扩张的肾小管上皮细胞着色加深；各给药组中VEGF的表达与模型组相比均有不同程度减弱，其中组合物A和组合物B联用组更接近于正常组中的表达水平，表明厄贝沙坦、组合物A以及组合物B均可降低肾脏VEGF的表达水平，组合物A和组合物B联用联用效果更佳。
2 Western Blot检测结果（见图2～3，表 1）
结果表明，Akt/mTOR信号转导通路中Akt及其下游分子mTOR在各组中的总蛋白表达水平无统计学差异（P＞0.05），而其蛋白磷酸化水平均发生明显变化：p-Akt与p-mTOR在正常组中表达较弱，在模型组中的表达则显著增强（P＜0.01），表明模型组大鼠体内Akt/mTOR信号转导通路被激活；而厄贝沙坦、组合物A、组合物B与组合物A和组合物B联用均可显著降低p-Akt与p-mTOR的蛋白表达（P＜0.01），抑制该通路的活化。尽管各给药组之间p-Akt及p-mTOR的变化无统计学差异，组合物A和组合物B联用组与正常组之间无显著差别（P＞0.05），表明组合物A和组合物B联用能有效抑制Akt/mTOR信号转导通路的活化。
表1各组的Akt、p-Akt、mTOR and p-mTOR(s)

结论
1. 组合物A和B均可减少Akt与mTOR蛋白的磷酸化水平，从而抑制DM大鼠Akt/mTOR信号转导通路的活化，其中两药联用效果最好，可保持该信号通路的活化程度接近于正常大鼠。
2. 组合物A和B对Akt/mTOR信号通路产生的抑制作用也直接导致了其相关蛋白VEGF表达水平的降低，从而对DN产生治疗作用。
3. 组合物A和B联用对Akt/mTOR信号通路的抑制作用是其治疗DN的机制之一。
本发明采用组合物A和组合物B联合治疗糖尿病肾病的效果好，没有明显副作用。这两种中药组合物防治DN的机制之一可能是抑制了Akt/mTOR信号转导通路的活化，进而影响诸如VEGF等多种生长因子的表达，从而对DN产生治疗作用，延缓其进展。
附图说明
图1是各组中VEGF在肾小球和肾小管中表达；
图2是蛋白免疫印迹法检测肾脏中Akt and p-Akt的表达；
图3是蛋白免疫印迹法检测肾脏中mTOR and p- mTOR的表达。
具体实施方式
组合物A的制备
实施例1： 
a) 原料药配方为：
人参39.6g   水蛭72.6g   土鳖虫46.2g  制乳香13.2g   赤芍33g  降香13.2g    檀香13.2g   全蝎19.8g   蝉蜕 46.2g  蜈蚣  6.6g   冰片 33g   炒酸枣仁33g;
b) 药材粉碎工艺： 
将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上;粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于30 μm;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料;
c) 提取浓缩和干燥工艺：
降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和炒酸枣仁加适量水煎煮二次，每次3小时，合并水提液，过滤后，待浓缩成浸膏；人参用适量70%的乙醇提取二次，每次3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再用水提取，醇提液浓缩成60℃测定相对密度为1.05醇提浸膏，水提液过滤与上述所有水提液混匀后浓缩至60℃测定相对密度为1.05的清膏，备用；
d) 制剂工艺：
在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤c）所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成1000粒胶囊。
本发明药物的用量，为每次2-4粒，每日服用三次。
实施例2
a) 原料药配方为：
人参 66g   水蛭 52.8g   土鳖虫 46.2g    制乳香13.2g 
赤芍 33g   降香 13.2g    檀香 13.2g    全蝎 59.4g  
蝉蜕 46.2g 蜈蚣 6.6g    冰片 33g        炒酸枣仁33g
b) 药材粉碎工艺： 
将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上;粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于70 μm;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料;
c) 提取浓缩和干燥工艺：
降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和炒酸枣仁加适量水煎煮二次，每次3小时，合并水提液，过滤后，待浓缩成浸膏；人参用适量70%的乙醇提取二次，每次3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再用水提取，醇提液浓缩成相对密度在60℃测定为1.0醇提浸膏，水提液过滤与上述所有水提液混匀后浓缩至60℃测定相对密度为1.0的清膏，备用；
d) 制剂工艺：
在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤c)所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，按常规制剂工艺压制成1000片。
本发明药物的用量，为每次2-4片，每日服用三次。
实施例3：丸剂的制备
a) 原料药配方为：
人参 39.6g 水蛭 66g   土鳖虫  46.2g 制乳香13.2g  
赤芍 33g   降香 13.2g   檀香  13.2g 全蝎  46.2g   
蝉蜕 46.2g 蜈蚣 6.6g    冰片  33g     炒酸枣仁33g
b) 药材粉碎工艺： 
将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上;粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径10μm;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料;
c) 提取浓缩和干燥工艺：
降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和炒酸枣仁加适量水煎煮二次，每次3小时，合并水提液，过滤后，待浓缩成浸膏；人参用适量70%的乙醇提取二次，每次3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再用水提取，醇提液浓缩成60℃测定相对密度为1.0醇提浸膏，水提液过滤与上述所有水提液混匀后浓缩至60℃测定相对密度为1.1的清膏，备用；
d) 制剂工艺：
按常规制剂工艺，制成1000粒丸剂。
本发明药物的用量，为每次2-4粒，每日服用三次。
实施例4
a)原料药配方
人参 60g  水蛭 100 g   土鳖虫 70 g   制乳香 20 g   赤芍 50 g    降香 20 g   檀香 20 g   全蝎 70 g    蝉蜕 70g    蜈蚣 10g    冰片 50g    炒酸枣仁50g；
b) 药材粉碎工艺： 
将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上;粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径20 μm;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料;
c) 提取浓缩和干燥工艺：
降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和炒酸枣仁加适量水煎煮二次，每次3小时，合并水提液，过滤后，待浓缩成浸膏；人参用适量70%的乙醇提取二次，每次3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再用水提取，醇提液浓缩成60℃测定相对密度为1.1醇提浸膏，水提液过滤与上述所有水提液混匀后浓缩至60℃测定相对密度为1.1的清膏，备用；
d) 制剂工艺：
按常规制剂工艺，制成颗粒剂。
组合物B的制备
实施例5：
原料药配方为：
人参102 g、黄精136 g、苍术68 g、苦参56 g、茯苓83 g、麦冬136 g、制何首乌83 g、地黄102 g、山茱萸136 g、黄连56 g、佩兰56 g、荔枝核136 g、淫羊藿56 g、知母68 g、丹参89 g、葛根136 g、地骨皮83 g。
制备方法为：
a、按照处方量称取中药材，净选、碎断； 
b、佩兰、苍术加6倍量水，提取挥发油，提油时间为5小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用，残渣弃去;
c、山茱萸用7倍量75%乙醇浸渍24小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30的稠膏，70℃烘干，备用；
d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加8倍量70%乙醇，回流提取3次，每次2小时。提取液过滤，回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.30的稠膏，65℃烘干，备用；
e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加9倍量水，煎煮2次，每次2小时，提取液过滤，与佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩至60℃时测定相对密度为1.15的清膏，加95%乙醇调解醇浓度为60%，冷藏放置24小时，过滤，滤液回收乙醇，并浓缩至60℃时测定相对密度为1.30的稠膏，70℃烘干，备用；
f、将步骤c所得山茱萸干膏、步骤d所得醇提干膏、步骤e 所得水提醇沉干膏混合均匀，粉碎； 
g、将步骤f所得干膏粉与乳糖粉、糊精按4：5：1混合均匀，用60%乙醇为黏合剂，制软材，14目筛网制颗粒，60℃烘干，12-60目筛网整粒，筛出部分细粉，喷入步骤b所得挥发油，混匀，密闭半小时，即得556克颗粒。
实施例6：
原料药配方为：
人参42 g、黄精200 g、苍术30 g、苦参60 g、茯苓35 g、麦冬200 g、制何首乌35 g、地黄120 g、山茱萸50 g、黄连60 g、佩兰30 g、荔枝核150 g、淫羊藿30 g、知母100 g、丹参35 g、葛根200 g、地骨皮30 g。
制备方法为：
a、按处方量称取中药材，净选、碎断； 
b、佩兰、苍术加5倍量水，提取挥发油，提油时间为3小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用，残渣弃去;
c、山茱萸用5倍量50%乙醇浸渍12小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30的稠膏，65℃烘干，备用；
d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加6倍量5%乙醇，回流提取2次，每次1小时。提取液过滤，回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.30的稠膏，65℃烘干，备用；
e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加7倍量水，煎煮1小时，提取液过滤，与佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩至60℃时测定相对密度为1.10的清膏，加95%乙醇调解醇浓度为50%，冷藏放置24小时，过滤，滤液回收乙醇，并浓缩至60℃时测定相对密度为1.30的稠膏，65℃烘干，备用；
f、将步骤c所得山茱萸干膏、步骤d所得醇提干膏、步骤e 所得水提醇沉干膏混合均匀，粉碎，制成颗粒； 
g、将步骤b所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤f所得颗粒，按常规制剂方法制成片剂即得。
实施例7：
原料药配方为：
人参160 g、黄精50 g、苍术100 g、苦参20 g、茯苓100 g、麦冬50 g、制何首乌100 g、地黄50 g、山茱萸200 g、黄连20 g、佩兰60 g、荔枝核75 g、淫羊藿60 g、知母30 g、丹参120 g、葛根50 g、地骨皮100 g。
制备方法为：
a、按处方量称取中药材，净选、碎断； 
b、佩兰、苍术加9倍量水，提取挥发油，提油时间为6小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用，残渣弃去;
c、山茱萸用9倍量90%乙醇浸渍48小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.35的稠膏，70℃烘干，备用；
d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加10倍量90%乙醇，回流提取3次，每次3小时。提取液过滤，回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.35的稠膏，70℃烘干，备用；
e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加11倍量水，煎煮2次，每次3小时，提取液过滤，与佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩至60℃时测定相对密度为1.15的清膏，加95%乙醇调解醇浓度为80%，冷藏放置24小时，过滤，滤液回收乙醇，并浓缩至60℃时测定相对密度为1.35的稠膏，70℃烘干，粉碎，备用；
f、将步骤b所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤e所得干膏粉中，按常规制剂方法制成丸剂即得。