枯草芽孢菌液体发酵甘草微生态制剂、制备方法及其作为畜禽饲料添加剂的应用.pdf

本发明涉及一种枯草芽孢菌液体发酵甘草微生态制剂，其将枯草芽孢杆菌种子液接种至甘草发酵培养基中，经振摇培养而得；所述甘草发酵培养基配方为：甘草水提液0.5－1.5mg/L，LB液体培养基250mg/L，pH7.4。本发明利用枯草芽孢杆菌液体发酵甘草，生产成本低，同时促进枯草芽孢杆菌活菌量增加和芽孢率形成，发酵后成新型微生态制剂，添加于畜禽饮水中，提高畜禽消化率、生产性能和免疫力。

1.  一种枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂，其特征在于，将枯草芽孢杆菌种子液接种至甘草发酵培养基中，经振摇培养而得；所述甘草发酵培养基配方为：甘草水提液0.5－1.5mg/L，LB液体培养基250mg/L，pH 7.4。

2.  如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂，其特征在于，所述甘草水提液经下述方法获得：取甘草加水煎煮3次，第一次煎煮加4～5重量倍的水，第二次煎煮加3～4重量倍的水，第三次煎煮加2～3重量倍的水，每次煎煮30～60分钟，合并三次煎煮液，过滤即得。

3.  权利要求1所述枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将枯草芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中，37±3℃振摇培养48±12h，获得枯草芽孢杆菌种子液；
2）将枯草芽孢杆菌种子液按5%的接种量接种至甘草发酵培养基中，37±3℃振摇培养24－72h即得。

4.  权利要求1所述枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂作为畜禽饲料添加剂的应用。

枯草芽孢菌液体发酵甘草微生态制剂、制备方法及其作为畜禽饲料添加剂的应用
技术领域
本发明属于微生态制剂技术领域，具体涉及一种枯草芽孢菌液体发酵甘草微生态制剂、制备方法及其应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，能形成芽孢，革兰氏阳性菌，作为一种畜禽饲料添加剂能产生多种消化酶，具有提高动物消化吸收、生产性能和动物免疫性能的作用。目前市场上常用的枯草芽孢杆菌微生态制剂多以普通培养基培养，以固体粉末的形式添加于饲料或饮水中，效果不佳。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种枯草芽孢菌液体发酵甘草微生态制剂，发酵后该微生态制剂具有枯草芽孢杆菌和甘草的双重功效，且其作用明显大于二者的复配。
本发明还提供了上述枯草芽孢菌液体发酵甘草微生态制剂的制备方法及其作为畜禽饲料添加剂的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂，其将枯草芽孢杆菌种子液接种至甘草发酵培养基中，经振摇培养而得；所述甘草发酵培养基配方为：甘草水提液0.5－1.5mg/L，LB液体培养基250mg/L，pH 7.4。
LB液体培养基的配方：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH 7.4。
所述的甘草发酵培养基配方优选为：甘草水提液1.5mg/L，LB液体培养基250mg/L，pH 7.4。
较好的，所述甘草水提液经下述方法获得：取甘草加水煎煮3次，第一次煎煮加4～5重量倍的水，第二次煎煮加3～4重量倍的水，第三次煎煮加2～3重量倍的水，每次煎煮30～60分钟，合并三次煎煮液，过滤即得。
上述枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂的制备方法，其包括如下步骤：
1）将枯草芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中，37±3℃振摇培养48±12h，获得枯草芽孢杆菌种子液；
2）将枯草芽孢杆菌种子液按5%（v/v）的接种量接种至甘草发酵培养基中，37±3℃振摇培养24－72h即得。
上述枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂作为畜禽饲料添加剂的应用，尤其是可以作为仔猪饲料添加剂的应用。
甘草是一种常用中药，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药作用。本发明利用枯草芽孢杆菌液体发酵甘草可以使枯草芽孢杆菌和甘草互相作用，发酵后可提高甘草酸、甘草黄酮等甘草活性物质含量，降低其毒副作用；同时能使枯草芽孢杆菌活菌含量明显增加。
和现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明利用枯草芽孢杆菌液体发酵甘草，生产成本低，同时促进枯草芽孢杆菌活菌量增加和芽孢率形成，发酵后形成一种新型的微生态制剂，添加于畜禽饮水中，可显著提高畜禽的消化能力、生产性能和免疫力。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。
下述各实施例中所用枯草芽孢杆菌菌株购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），编号23759。LB液体培养基的配方：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH 7.4。
所述甘草水提液经下述方法获得：取甘草加水煎煮3次，第一次煎煮加5重量倍的水，第二次煎煮加4重量倍的水，第三次煎煮加3重量倍的水，每次煎煮50分钟，合并三次煎煮液，过滤即得。
对比例1
一种枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂，其将枯草芽孢杆菌种子液接种至甘草发酵培养基中，经振摇培养而得；所述甘草发酵培养基配方为：甘草水提液0%，LB液体培养基0.25%，余量为水，pH 7.4。
上述枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂的制备方法，其包括如下步骤：
1）将枯草芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中，37℃振摇培养48h，获得种子液；
2）将种子液按5%（v/v）的接种量接种至甘草发酵培养基中，37℃振摇培养24－72h即得。
实施例1
一种枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂，其将枯草芽孢杆菌种子液接种至甘草发酵培养基中，经振摇培养而得；所述甘草发酵培养基配方为：甘草水提液0.5mg/L，LB液体培养基250mg/L，pH 7.4。
甘草水提液5%，LB液体培养基0.25%，余量为水，pH 7.4。
上述枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂的制备方法，其包括如下步骤：
1）将枯草芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中，37℃振摇培养48h，获得枯草芽孢杆菌种子液；
2）将枯草芽孢杆菌种子液按5%（v/v）的接种量接种至甘草发酵培养基中，37℃振摇培养24－72h即得。
实施例2
所述的枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂中，甘草发酵培养基配方为：甘草水提液1.0mg/L，LB液体培养基250mg/L，pH 7.4。其它及制备方法均同实施例1。
实施例3
所述的枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂中，甘草发酵培养基配方为：甘草水提液1.5mg/L，LB液体培养基250mg/L，pH 7.4。其它及制备方法均同实施例1。
实施例4
所述的枯草芽孢杆菌液体发酵甘草微生态制剂中，甘草发酵培养基配方为：甘草水提液2.0mg/L，LB液体培养基250mg/L，pH 7.4。其它及制备方法均同实施例1。
上述各实施例所述微生态制剂中的枯草芽孢杆菌菌体量测试
供试样品：对比例1及实施例1－4所制备的微生态发酵品。
试验方法：分别于发酵后的第24h、48h、72h对上述实施例取样进行枯草芽孢杆菌、芽孢率和pH测定。枯草芽孢杆菌测定方法：吸取1mL样品匀液注入装有9mL生理盐水的无菌试管中，混匀，制成1:10的样品匀液。按照上述操作顺序，依次倍比稀释至10^-10。选择3个连续的适宜稀释度，每个稀释度取0.1mL样品稀释液，分别置于2个普通琼脂平板上，涂布均匀。37℃培养48h，对平板上的所有菌落进行计数。根据公式：每毫升样品中菌落数=平板上菌落数×稀释倍数/平板中菌液添加量，来计算发酵样品中细菌总数。试验结果见表1。

     从上述的表1可以看出：随着甘草水提液在甘草发酵培养基中添加比例的增加，枯草芽孢杆菌菌体量也明显增加；甘草水提液添加量为1.5mg/L时，菌体的数量最多，发酵72h可以达到5.98×10⁹；随后菌体数量又开始下降，说明添加1.5mg/L甘草水提液比较合适，同时菌体芽孢率也达到最高。从该试验结果来看：适量添加甘草水提液对于枯草芽孢杆菌杆菌的增殖和芽孢的产生具有明显效果。
以实施例3的配方进行相关的应用试验：
选择体重、日龄（28日龄）相近的三元（杜×长×大）断奶仔猪200头，随机分为5组，每组4个重复，每个重复10头（公母各半），分别为试验1组（0.2%），试验2组（0.4%），试验3组（0.6%）、空白对照组、枯草芽孢杆菌对照组（0.005%）。试验期30天，全程采用自由采食、饮水的饲喂方法，按猪场常规程序进行消毒和免疫。试验期间仔细观察猪只的精神、食欲状况，并做好详细记录。分别于试验开始和结束时对试验猪逐一进行空腹称重，以组为单位记录采食量，计算平均日采食量、平均日增重及料肉比。
平均日采食量=（总采食量/猪头数）/试验天数
平均日增重=（末重－初重）/试验天数
料肉比=总采食量/总增重
在试验结束后第2天早晨空腹对各试验组仔猪静脉采血，制备血清后保存于-20℃冰箱中，利用试剂盒和酶标仪分别检测各试验组血清中IgG、IgA的含量。

由表2可知，平均日采食量、平均日增重、料肉比三个指标，添加本发明发酵甘草微生态制剂的试验组均比空白对照组和添加枯草芽孢杆菌组效果好，且差异显著。添加0.6%的试验3组总体效果较好，平均日采食量比空白对照组、枯草芽孢杆菌对照组分别提高13.64%和9.08%；平均日增重比空白对照组、枯草芽孢杆菌对照组分别提高20.29%和14.77%；料肉比比空白对照组、枯草芽孢杆菌对照组分别提高7.69%和6.25%。

由表3可知，血清中IgG、IgA含量添加本发明发酵甘草微生态制剂的试验组均比空白对照组和添加枯草芽孢杆菌组效果好，且差异显著。添加0.6%的试验3组总体效果较好，IgG含量比空白对照组、枯草芽孢杆菌对照组分别提高12.60%和5.69%；IgA含量组比空白对照组、枯草芽孢杆菌对照组分别提高15.45%和13.24%。
因此，本发明发酵甘草微生态制剂使用时选择添加0.6%（重量百分比）于饲料中比较合适，可以显著提高动物免疫力。