一种放射性核素131I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法.pdf

本发明涉及一种放射性核素131I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法，包括：(1)叶酸中加入EDC，NH2-PEG-COOH溶液，反应得FA-PEG-COOH；(2)将树状大分子溶液中加入HPAO，反应得到G5.NH2-HPAO；(3)将FA-PEG-COOH的溶液加入EDC活化，加入到G5.NH2-HPAO的水溶液中，反应得到树状大分子溶液；(4)将上述溶液中加入N(C2H5)3、乙酸酐，反应得到功能化的树状大分子溶液，然后加入Na131I进行标记反应，即得。本发明所得材料具有良好的SPECT成像及放射性治疗的功能，在形成集诊断与治疗为一体的纳米材料领域具有潜在的应用价值。

1.  一种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法，包括：
(1)将叶酸FA溶于溶剂中，加入EDC活化2-3h，然后加入NH₂-PEG-COOH溶液，搅拌反应1-2d，得到FA-PEG-COOH；
(2)将第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液G5.NH₂加入3-(4-羟基苯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯HPAO溶液，搅拌反应24h，得到G5.NH₂-HPAO；
(3)将FA-PEG-COOH的水溶液经过EDC活化2-3h，然后加入到G5.NH₂-HPAO的水溶液中，搅拌反应2-3d，得到树状大分子G5.NH₂-HPAO-(PEG-FA)溶液；
(4)将上述树状大分子G5.NH₂-HPAO-(PEG-FA)溶液中加入三乙胺N(C₂H₅)₃搅拌20-40min，最后加入乙酸酐Ac₂O，搅拌反应12-24h，透析，冷冻干燥，得到功能化的树状大分子G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)；
(5)将上述功能化的树状大分子G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)的PBS溶液中加入氯胺T(ch-T)及碘化钠Na¹³¹I，反应2min后，加入Na₂S₂O₅及碘化钾，反应1min，分离纯化，即得放射性元素碘¹³¹I标记的纳米材料¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)。

2.  根据权利要求1所述的一种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)、(2)中溶剂均为二甲基亚砜DMSO。

3.  根据权利要求1所述的一种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中EDC与FA的摩尔比为1：1，FA与NH₂-PEG-COOH的摩尔比为1.5-2：1。

4.  根据权利要求1所述的一种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中HPAO与第五代聚酰胺-胺树状大分子的摩尔比为12:1。

5.  根据权利要求1所述的一种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中FA-PEG-COOH与G5.NH₂-HPAO的摩尔比为50:1，EDC与FA-PEG-COOH的摩尔比为20:1。

6.  根据权利要求1所述的一种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中三乙胺N(C₂H₅)₃、乙酸酐Ac₂O和树状大分子G5.NH₂-HPAO-(PEG-FA)的摩尔比为120-660:100-550:1。

7.  根据权利要求1所述的一种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中透析为用纤维素透析膜MWCO＝14000，在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3-5天。

8.  根据权利要求1所述的一种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中Na¹³¹I放射性活性为185-370MBq。

9.  根据权利要求1所述的一种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中分离纯化为：用PD-10脱盐层析柱分离纯化，以pH＝7.2-7.4的PBS为流动相，每15滴收集在同一试管中，总共收集20管，用放射性活度仪测量放射性活性以收集纯¹³¹I标记的功能化树状大分子。

一种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法
技术领域
本发明属于功能性树状大分子材料的制备领域，特别涉及一种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法。
背景技术
癌症是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。鉴于恶性肿瘤的局部浸润性和远端转移特性，使得癌症的治疗效果和治疗费用与发现癌症的时期密切相关。及早发现、及早治疗是减少癌症死亡率最为有效的方法。随着纳米科学与技术的发展，各种纳米体系已经开始应用于癌症的早期诊断和治疗，包括氧化铁纳米颗粒、量子点、碳纳米管、金纳米颗粒、树状大分子、硅纳米材料等均可被赋予成像及治疗功能，而一个理想的能够用于癌细胞早期靶向诊断与治疗的纳米粒子系统应该同时负载靶向分子、成像试剂分子和药物，既可以携带足够的成像剂和治疗药物，又可以将其高效地定向输送到肿瘤等病灶区域，以给病灶区提供充足的成像信号和药物浓度。因此，借助功能化的纳米负载系统将诊断与治疗相结合，可望实现癌症的“诊疗”一体化。
核医学成像技术是通过收集、显示放射性核素在体内的分布密度及流动变化情况，获得脏器、骨骼和病变的形状、位置及功能信息的一种技术。放射性核素示踪试剂是由血管注入并随血液流动在体内聚集、分布，随时间而变化。因此，核医学成像已经超出了解剖学结构显影的范围，能够反映脏器或系统的功能变化，且能进行有效的肿瘤诊断，特别在全身骨扫描、甲状腺及甲状旁腺功能显影、肝血池显影中能方便地发现肿瘤并鉴别肿瘤的性质。常使用的探针是用¹⁸F、¹³N、¹¹C、^99mTc，¹³¹I及²⁰¹Tl等生物组织中含量最多元素的放射性核素标记的化合物，它们具有与体内分子类似(包括细胞代谢)的特点。而放射性核素¹³¹I能够衰减可发射出γ射线及β射线。γ射线可用于生物体内成像及其体内生物分布研究，β射线可被用于进行放射性治疗。因此，¹³¹I能够被用作功能性的核素同时进行单光子发射计算机断层成像(SPECT)及放射性治疗。但由于分子¹³¹I在体内较短的血液循环时间及较差的特异性分布限制了其作为有效的诊疗核素进行生物医学应用。因此构建一个有效的负载¹³¹I的纳米系统成为体内SPECT成像及放射性治疗的关键。
聚酰胺胺(poly(amidoamine),PAMAM)树状大分子是通过支化单元逐步重复反应得到的具有树状高度支化结构的大分子。分子结构包括三部分：多臂引发核；由多个重复单元组成的支架；表面多功能基团。它具有高度支化、高度单分散性，拥有可控的、规则的结构和组成。它不仅由于表面拥有众多的功能基团而具有独特的表面物理、化学性质，而且具有独 特的内部空腔结构。表面具有一层官能基团，可以通过链-离子间的相互作用，酸-碱相互作用等稳定金属离子，形成复合材料。例如Shen Y.M.等(Zhang,Y.Q.；Shen,Y.M et al.Journal of Medicinal Chemistry.2010,53,3262)利用端基为氨基的第五代PAMAM树状大分子为模板修饰金属离子螯合剂二乙基三胺五乙酸(DTPA)以螯合放射性元素锝(^99mTc)，并修饰靶向试剂叶酸及聚乙二醇用于体内SPECT成像。Shi X.Y.等(Chen,Q.；Zhang,G.X.；Shi,X.Y.et al.Biomaterials.2013,34,5200)利用端基为氨基的第五代PAMAM树状大分子为模板负载钆(Gd)离子并原位还原制备金纳米颗粒，形成MR/CT双模态成像体系，并在树状大分子外围修饰靶向分子等，制备得到的纳米材料具有良好生物相容性，可对癌症细胞进行有效地靶向和成像。树状大分子由于其独特的物化性质，可作为多功能靶向分子显像探针的载体，也是药物的优良载体。因此，可根据树状大分子优良的理化性质，利用靶向基团将显像探针带到目标部位实现肿瘤的早期诊断，并通过放射性核素独特的性质实现癌症的放射性治疗，有效的抑制癌细胞的生长。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法，本发明方法制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备程序可用于其它功能化树状大分子的制备，具有很好的使用价值。
本发明的一种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的制备方法，包括：
(1)将叶酸FA溶于溶剂中，加入EDC活化2-3h，然后加入NH₂-PEG-COOH溶液，搅拌反应1-2d，得到FA-PEG-COOH；
(2)将第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液G5.NH₂加入3-(4-羟基苯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯HPAO溶液，搅拌反应24h，得到G5.NH₂-HPAO；
(3)将FA-PEG-COOH的水溶液经过EDC活化2-3h，然后加入到G5.NH₂-HPAO的水溶液中，搅拌反应2-3d，得到树状大分子G5.NH₂-HPAO-(PEG-FA)溶液；
(4)将上述树状大分子G5.NH₂-HPAO-(PEG-FA)溶液中加入三乙胺N(C₂H₅)₃搅拌20-40min，最后加入乙酸酐Ac₂O，搅拌反应12-24h，透析，冷冻干燥，得到功能化的树状大分子G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)；
(5)将上述功能化的树状大分子G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)的PBS溶液中加入氯胺T(ch-T)及碘化钠Na¹³¹I，反应2min后，加入Na₂S₂O₅及碘化钾，反应1min，分离纯化，即得放射性元素碘¹³¹I标记的纳米材料¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)。
所述步骤(1)、(2)中溶剂均为二甲基亚砜DMSO。
所述步骤(1)中EDC与FA的摩尔比为1：1，FA与NH₂-PEG-COOH的摩尔比为1.5-2：1。
所述步骤(2)中HPAO与第五代聚酰胺-胺树状大分子的摩尔比为12:1。
所述步骤(3)中FA-PEG-COOH与G5.NH₂-HPAO的摩尔比为50:1，EDC与FA-PEG-COOH的摩尔比为20:1。
所述步骤(4)中三乙胺N(C₂H₅)₃、乙酸酐Ac₂O和树状大分子G5.NH₂-HPAO-(PEG-FA)的摩尔比为120-660:100-550:1。
所述步骤(4)中透析为用纤维素透析膜MWCO＝14000，在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3-5天。
所述步骤(5)中Na¹³¹I放射性活性为185-370MBq。
所述步骤(5)中分离纯化为：用PD-10脱盐层析柱分离纯化，以pH＝7.2-7.4的PBS为流动相，每15滴收集在同一试管中，总共收集20管，用放射性活度仪测量放射性活性以收集纯¹³¹I标记的功能化树状大分子。
本发明中使用PEG可以增加该材料的体内循环时间，延长SPECT造影时间及增强其在体内的放射性治疗效果。
本发明中使用靶向分子FA修饰在树状大分子表面以实现其体内外的靶向特异性效果。
本发明中将树状大分子表面剩余的氨基乙酰化以降低其表面电势，提高材料的生物相容性。以三乙胺保持溶液的碱性环境保证乙酰化反应的顺利进行。
本发明中树状大分子G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)的PBS溶液中加入Na¹³¹I，并充分搅拌使¹³¹I充分与树状大分子G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)上的HPAO反应，未反应的Na¹³¹I经PD-10脱盐层析柱分离，收集取得纯¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)。
使用¹HNMR(氢核磁共振)、TLC(薄层色谱法)测试、MTT测试、流式细胞测、共聚焦电子显微镜测、体内SPECT成像、肿瘤尺寸变化、荷瘤鼠体重变化、荷瘤鼠存活率统计表征放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的结果分别如下：
(1)¹H NMR测试结果
¹H NMR测试结果表明：本发明中制备得到的¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)中，一个G5接了9.4个HPAO、35个PEG、20个FA，参见说明书附图2。
(2)TLC测试结果
TLC测试结果表明：本发明中制备得到的功能化树状大分子¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)具有良好的稳定性，在不同时间点(0h，1h，3h，5h，27h及44h)下，¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)的放射性化学纯度均在80％以上，未有大量的¹³¹I从载体上脱落下来，参见说明书附图3。
(3)MTT测试结果
MTT测试结果表明：本发明制备得到的载体功能化的树状大分子G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)具有良好的生物相容性，在功能化树状大分子孵化癌细胞24h后，细胞活力仍然高于80％，其良好的生物相容性可用于以后的体内实验中，参见说明书附图4。
(4)细胞形态结果
细胞形态结果表明：用不同浓度的功能化树状大分子载体G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)(0.1μM，1μM，5μM，10μM及20μM)孵化癌细胞，细胞形态良好，未有明显的凋亡迹象，参见说明书附图5。说明本发明中制备得到的功能化树状大分子载体具有良好的生物相容性。
(5)流式细胞测试结果
流式细胞测试结果表明：本发明中制备得到的经FI标记的功能化树状大分子载体G5.NHAc-FI-HPAO-PEG-FA在浓度为1000nM且孵化癌细胞2h，对高叶酸受体表达的癌细胞具有靶向作用，通过荧光强度的显著性差异说明制得的材料对高叶酸受体表达细胞具有特异性，参见说明书附图6。
(6)激光共聚焦显微镜测试
激光共聚焦显微镜测试结果表明：本发明中制备得到的经FI标记的功能化树状大分子载体G5.NHAc-FI-HPAO-PEG-FA在浓度为1000nM且孵化癌细胞2h，对高叶酸受体表达的细胞具有靶向作用，通过共聚焦显微镜图片可清晰的看到制备得到的功能化树状大分子进入了高叶酸受体表达细胞的细胞质中，说明制得的材料对高叶酸受体表达细胞具有特异性，参见说明书附图7。该结果与流式细胞测试结果相一致，共同说明修饰FA的材料对于癌细胞的靶向特异性。
(7)体内SPECT成像测试
体内SPECT成像测试结果表明：本发明中制备得到的¹³¹I标记的功能化树状大分子¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)，通过尾静脉注射200μL¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)(18.5MBq)至荷瘤鼠后，测试在2min，30min，1h，2h，3h，4h，6h，16h，24h的体内SPECT成像效果。结果表明在6h，16h及24h时，荷瘤鼠的肿瘤部位有明显的SPECT成像信号，且非靶向材料¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG在荷瘤鼠的肿瘤部位没有明显的SPECT成像信号，说明制备得到的¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)具有良好的体内肿瘤靶向SPECT成像特性，参见说明书附图8a。且在尾静脉注射6h及24h时，解剖取出肿瘤部位进行SPECT成像。结果表明在6h时，经靶向材料¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)处理的荷瘤鼠肿瘤部位比经非靶向材料¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG处理的荷瘤鼠肿瘤部位有明显强的SPECT成像信号。且在24h时，¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)处理的荷瘤鼠肿瘤部位具有更强的SPECT 成像信号，然而¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG处理的荷瘤鼠肿瘤部位已经没有SPECT成像信号，参见说明书附图8b。说明经过24h，¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG已经从肿瘤部位清除，代谢出体内。进一步说明了¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)具有良好的体内肿瘤靶向SPECT成像特性。
(8)荷瘤鼠肿瘤尺寸变化测试
荷瘤鼠肿瘤尺寸变化测试结果表明：本发明中制备得到的¹³¹I标记的功能化树状大分子¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)具有明显的抑制肿瘤生长的效果。经过¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)处理的荷瘤鼠肿瘤的生长比经过生理盐水、Na¹³¹I及¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG处理的荷瘤鼠肿瘤的生长慢，参见说明书附图9。
(9)荷瘤鼠体重变化测试
荷瘤鼠体重变化测试结果表明：本发明中制备得到的¹³¹I标记的功能化树状大分子¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)并没有明显影响荷瘤鼠体重的变化。经¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)处理的荷瘤鼠体重变化基本与经生理盐水、Na¹³¹I及¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG处理的荷瘤鼠体重变化趋势相似，参见说明书附图10。
(10)荷瘤鼠存活率统计
荷瘤鼠存活率统计结果表明：本发明中制备得到的¹³¹I标记的功能化树状大分子¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)使荷瘤鼠死亡时间延迟，经统计¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)组的荷瘤鼠直至38d还有存活的荷瘤鼠。而生理盐水组的荷瘤鼠在22d已死完，Na¹³¹I组的荷瘤鼠在28d已死完，¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG组的荷瘤鼠在31d已死完，参见说明书附图11。
本发明制备的放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子，其具有良好的稳定性及生物相容性。体外细胞实验结果证明功能化树状大分子载体G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)对高叶酸受体表达的癌细胞具有靶向作用且¹³¹I标记的功能化树状大分子¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)具有良好的稳定性，并在体内具有靶向SPECT成像及靶向放射性治疗功能。
以表面具有大量氨基，内部具有大量空腔和结构精确可控的聚酰胺-胺树状大分子为模板和稳定剂，制备了放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子，本发明涉及了两个基本原理：
(1)充分利用聚酰胺-胺树状大分子的表面大量的可修饰化氨基，在其表面修饰靶向基团叶酸(FA)和3-(4-羟基苯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(HPAO)，可制备得到新型多功能树状大分子。
(2)以NH₂-PEG-COOH为中介，将FA与NH₂-PEG-COOH化学键合，再将生成的FA-PEG-COOH与聚酰胺-胺树状大分子相连，可提高该纳米材料的生物相容性和体内血液循环时间。
制备这种放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子的关键要素就是找到一个合适的载体平台以负载不同的功能基团，形成多功能纳米复合体。本发明利用树状大分子的特定结构和性质，将靶向基团叶酸(FA)和3-(4-羟基苯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(HPAO)修饰在树状大分子表面以实现靶向及标记¹³¹I的功能，其中以NH₂-PEG-COOH为中介，将FA与NH₂-PEG-COOH化学键合，再将生成的FA-PEG-COOH与聚酰胺-胺树状大分子相连，可提高该功能化树状大分子的生物相容性和血液循环时间，并乙酰化树状大分子表面剩余氨基降低表面正电荷性，以降低其毒性，制备出多功能化树状大分子纳米平台，最后在该功能化树状大分子上负载¹³¹I，有望用于SPECT成像和放射治疗一体化。
有益效果
(1)本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备程序可用于其它功能化树状大分子的制备，具有很好的使用价值；
(2)本发明所制备的材料可用于体内肿瘤SPECT诊断，具有良好的诊断应用前景；
(3)本发明制备得到的放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子具有良好的靶向放射性治疗功效，为新型纳米放射性药物的开发打下了良好的基础。
附图说明
图1为本发明反应方程式简图；
图2为本发明制备的(a)FA-PEG-COOH，(b)G5.NH₂-HPAO，(c)G5.NHAc-HPAO-PEG-FA，(d)G5.NHAc-HPAO-mPEG的氢核磁共振谱图；
图3为Na¹³¹I(a)及本发明制备的¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA在0h(b)，1h(c)，3h(d)，5h(e)，27h(f)，44h(g)的放射性化学纯度测试及其放射性化学效率统计(h)；
图4为经过不同浓度的¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA孵化24h的C6细胞MTT测试结果图；
图5为相差显微镜下经PBS(a)和分别用0.1μM(b),1μM(c),5μM(d),10μM(e),20μM(f)的G5.NHAc-HPAO-PEG-FA孵化C6细胞24h之后的细胞形态图；
图6为(a)C6-HFAR细胞用PBS处理；(b),(c)C6-LFAR细胞和C6-HFAR细胞用1000nM的G5.NHAc-FI-HPAO-mPEG分别处理2h；(d),(e)C6-LFAR细胞和C6-HFAR细胞用1000nM的G5.NHAc-FI-HPAO-PEG-FA分别处理2h的流式细胞分析图；(f)为C6细胞的荧光强度分 析数据图；C6-HFAR指高叶酸受体表达的细胞，C6-LFAR指低叶酸受体表达的细胞；
图7为分别用浓度为1000nM的不同材料孵化2h的C6-LFAR细胞和C6-HFAR细胞的共聚焦显微镜图；
图8为荷瘤鼠尾静脉注射¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA及¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG之后不同时间点下荷瘤鼠的SPECT成像图(a)及在6h和24h经解剖后肿瘤部位的SPECT成像(b)；
图9为荷瘤鼠经不同材料处理后的肿瘤体积变化图；
图10为荷瘤鼠经不同材料处理后的体重变化趋势图；
图11为荷瘤鼠经不同材料处理后的存活率统计分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)用5mL的DMSO溶解干重为11.37mg的FA，边搅拌边逐滴滴加溶于2mL DMSO溶液的干重为4.94mg的EDC，搅拌反应3h后，向该溶液中逐滴滴加溶于5mL DMSO溶液的干重为85.86mg的NH₂-PEG-COOH(Mw＝5000)，其中FA与NH₂-PEG-COOH的摩尔比为1.5:1，EDC与FA的摩尔比为1:1，反应1天，将所得的溶液用纤维素透析膜MWCO＝1000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到FA-PEG-COOH。
(2)用5mL的DMSO溶解干重为30mg的G5PAMAM树状大分子，边搅拌边逐滴滴加溶于2mL DMSO溶液的干重为3.64mg的HPAO，其中HPAO与G5PAMAM树状大分子的摩尔比为12:1，反应1天，将所得的溶液用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到G5.NH₂-HPAO。
(3)用5mL的蒸馏水溶解干重为30mg的FA-PEG-COOH，边搅拌边逐滴滴加溶于2mL蒸馏水溶液的干重为21.9mg的EDC，搅拌反应3h后，向该溶液中逐滴滴加溶于5mL蒸馏水的干重为3.27mg的G5.NH₂-HPAO树状大分子，其中FA-PEG-COOH与G5PAMAM树状大分子的摩尔比为50:1，EDC与FA-PEG-COOH的摩尔比为20:1，反应3天,将所得的溶液用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到G5.NH₂-HPAO-(PEG-FA)。
(4)用5mL的蒸馏水溶解干重为15mg的G5.NH₂-HPAO-(PEG-FA)，边搅拌边逐滴滴加6.55μL三乙胺，搅拌反应30min后，向反应液中加入3.70μL乙酸酐，在室温下搅拌反应 24小时，将所得的溶液用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到多功能化树状大分子纳米平台G5.NHAc-HPAO-PEG-FA。
合成过程中对树状大分子表面修饰用核磁进行表征，对各个峰进行积分计算可知：树状大分子载体表面修饰了9.4个HPAO、35个PEG、20个FA分子(附图2)。这些测试结果表明已成功设计合成功能化的树状大分子G5.NHAc-HPAO-PEG-FA。并在标记¹³¹I后，测试形成的¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA放射性化学纯度达97.7％±0.7％，说明标记¹³¹I成功。
实施例2
以薄层色谱法对得到的产品¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA进行稳定性分析，参见附图3。将100μL的放射性标记物分别与1mL 0.9％的生理盐水和胎牛血清混合，之后利用薄层色谱法测试37℃下¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA在0h，1h，3h，5h，27h及44h时的放射性化学纯度，结果表明在不同时间点下，¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA的放射性化学纯度均在80％以上，未有大量的¹³¹I从载体上脱落下来。说明得到的产品¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA具有良好的稳定性。
实施例3
以MTT测试来检测制备得到的叶酸靶向的多功能树状大分子载体的体外生物相容性，称取实施例1中载体材料12.7mg，溶于300μL的PBS缓冲液中配制G5.NHAc-HPAO-PEG-FA浓度为200μM的溶液，再分别稀释到浓度为100μM，50μM，10μM，1μM的溶液。将上述不同浓度的材料(其各自的终浓度均为20μM，10μM，5μM，1μM，0.1μM)孵化C6细胞24h后，将材料倒掉，加入180μL培养基和20μL MTT，在37℃孵化4h后，将培养液倒掉，加入200μL DMSO，摇床振摇20min后，用酶标仪测得结果，得到图4所示数据，结果表明在一定浓度范围内实施例1未标记¹³¹I的载体材料不具有明显的细胞毒性，在体外具有良好的生物相容性。
实施例4
用细胞形态来进一步分析所制备的载体材料的生物相容性，称取16.98mg G5.NHAc-HPAO-PEG-FA，溶于400μL的PBS中配制G5.NHAc-HPAO-PEG-FA浓度为200μM的溶液，再分别稀释到浓度为100μM，50μM，10μM，1μM的溶液。将C6细胞种于96孔板，10⁴个细胞/孔，孵化24h后，分别在每孔加10μLPBS，上述不同浓度的材料和90μL培养基，使各材料的终浓度为20μM，10μM，5μM，1μM，0.1μM，孵化C6细胞24h后，将材料倒掉，使用相差显微镜拍摄细胞图像，结果表明用PBS和各浓度G5.NHAc-HPAO-PEG-FA孵化的细胞形态良好，没有明显凋亡迹象，参见附图5。说明本发明中制备得到叶酸靶向的多功能树状大分子载体没有细胞毒性，具有良好的细胞相容性。
实施例5
以流式细胞测试来证明制备得到的叶酸靶向的多功能树状大分子载体材料的靶向性。将实施例1中的载体材料标记荧光示踪物异硫氰酸荧光素(FI),然后称取经FI标记的实施例1载体材料2.14mg，溶于1000μL的PBS缓冲液中配制浓度为10000nM的溶液；与此同时也将对比例1中的载体材料标记FI，称取经FI标记的对比例1材料2.05mg，溶于1000μL的PBS缓冲液中配制浓度为10000nM的溶液；将C6细胞种于12孔板，2×10⁵细胞/孔，C6细胞分为高叶酸受体表达和低叶酸受体表达，使用2.5μM叶酸处理的细胞为低叶酸受体表达的C6细胞，未使用叶酸处理的细胞为高叶酸受体表达的C6细胞。各细胞使用等体积的PBS处理，孵化24h后，分别在每孔加100μL经FI标记的实施例1载体材料，经FI标记的对比例1材料和900μL培养基，各材料的终浓度为1000nM，孵化2h后将材料吸出，用PBS洗2-3次，用胰蛋白酶将细胞悬浮，离心后，溶于1mLPBS中，使用流式细胞仪进行测量，结果表明用浓度为1000nM的G5.NHAc-FI-HPAO-PEG-FA孵化癌细胞2h，对高叶酸受体表达的癌细胞具有靶向作用，不带叶酸的经FI标记的对比例1材料G5.NHAc-FI-HPAO-mPEG对高低叶酸受体表达的癌细胞不具靶向作用，通过荧光强度的显著性差异说明制得的经FI标记的实施例1载体材料对高叶酸受体表达细胞具有特异性，参见说明书附图6。
实施例6
以共聚焦显微镜测试来进一步证明制备得到的叶酸靶向的多功能树状大分子载体材料的靶向性。称取经FI标记的实施例1载体材料2.14mg，溶于1000μL的PBS缓冲液中配制浓度为10000nM的溶液；称取经FI标记的对比例1材料2.05mg，溶于1000μL的PBS缓冲液中配制浓度为10000nM的溶液；将C6细胞种于放有盖玻片的12孔板，8×10⁴细胞/孔，C6细胞分为高叶酸受体表达和低叶酸受体表达，使用2.5μM叶酸处理的细胞为低叶酸受体表达的C6细胞，未使用叶酸处理的细胞为高叶酸受体表达的C6细胞。各细胞使用等体积的PBS处理，孵化24h后，分别在每孔加100μL经FI标记的实施例1载体材料，经FI标记的对比例1材料和900μL培养基，各材料的终浓度为1000nM，孵化2h后将材料吸出，用PBS洗2-3次，每孔加入2.5％戊二醛500μL固定15min，再用PBS洗2-3次，加1μg/mL Hoechst33342500μL染色20min后，用PBS洗2-3次，将盖玻片上的细胞封片至载玻片上，在共聚焦显微镜下拍摄，结果表明用浓度为1000nM的G5.NHAc-FI-HPAO-PEG-FA孵化癌细胞2h，对高叶酸受体表达的癌细胞具有靶向作用，不带叶酸的经FI标记的对比例1材料G5.NHAc-FI-HPAO-mPEG对高低叶酸受体表达的癌细胞不具靶向作用，通过共聚焦显微镜图片可清晰的看到经FI标记的实施例1载体材料进入了高叶酸受体表达细胞的细胞质中，说明制得的载体材料对高叶酸受体表达细胞具有特异性，参见附图7。该结果与流式细胞测试结 果相一致，共同说明经FI标记的实施例1载体材料对于癌细胞的靶向特异性。
实施例7
以SPECT成像仪测试得到的放射性核素¹³¹I标记的叶酸靶向的多功能树状大分子¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA的SPECT成像效果。以20g左右的雄性裸鼠作为动物模型(上海动物实验中心)，接种肿瘤，待肿瘤长至1.0cm³后，通过尾静脉注射200μL本发明制备的¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA(18.5MBq)进入荷瘤鼠体内，于不同时间点(2min，30min，1h，2h，3h，4h，6h，16h，24h)进行SPECT扫描(附图8a)。从图片8a看出，与对照组(非叶酸靶向材料处理的荷瘤鼠图片)相比较，注射6h，16h，24h后扫描的荷瘤鼠肿瘤部位的SPECT信号强度明显增强，表明¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA材料具有靶向肿瘤SPECT成像效果。然后在6h及24h时，将荷瘤鼠解剖，取出肿瘤并进行SPECT成像(附图8b)，从图片8b看出，6h时¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA的SPECT信号明显比¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG的SPECT信号强。在24h时，¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA的SPECT信号比其在6h的SPECT信号更强，且在24h时¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG的SPECT信号微弱，说明对比材料¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG在24h时被慢慢代谢掉了。通过不同时间点下¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA与¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG的SPECT信号值对比证明了¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA对肿瘤的靶向SPECT成像效果。
实施例8
按照实施例7所述建立肿瘤模型，待肿瘤长至0.5-1.2cm³后，每隔3天尾静脉注射生理盐水(200μL，7.4MBq)、Na¹³¹I(200μL，7.4MBq)、¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG(200μL，7.4MBq)及¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA(200μL，7.4MBq)。用游标卡尺每隔3天测量肿瘤尺寸，并按照(肿瘤长径×(肿瘤短径)²)/2计算肿瘤尺寸，荷瘤鼠的相对肿瘤体积(V/V₀，V为每次测量的肿瘤尺寸，V₀为第0天的肿瘤尺寸)(附图9)及体重变化(附图10)每3天记录一次，与此同时记录荷瘤鼠的死亡情况，做致死率统计(附图11)。从附图9可知，经不同材料处理的荷瘤鼠肿瘤生长速率¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA＜¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG＜Na¹³¹I＜生理盐水。与¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG相比，¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA具有靶向放射性治疗功效，且其体内治疗效率比纯Na¹³¹I明显。从附图10可知，经¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA处理后，并未明显影响荷瘤鼠体重变化，经¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)处理的荷瘤鼠体重变化基本与经生理盐水、Na¹³¹I及¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG处理的荷瘤鼠体重变化趋势相似，说明其具有良好的体内生物相容性。从附图11可知，¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)使荷瘤鼠死亡时间延迟，经统计¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)组的荷瘤鼠直至38d还有存活的荷瘤鼠。而生理盐水组的荷瘤 鼠在22d已死完，Na¹³¹I组的荷瘤鼠在28d已死完，¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG组的荷瘤鼠在31d已死完，说明¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-FA)具有较好的治疗功效，能够有效延缓荷瘤鼠死亡时间。
对比实施例1
(1)用5mL的DMSO溶解干重为30mg的G5PAMAM树状大分子，边搅拌边逐滴滴加溶于2mL DMSO溶液的干重为3.64mg的HPAO，其中HPAO与G5PAMAM树状大分子的摩尔比为12:1，反应1d，将所得的溶液用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到G5.NH₂-HPAO。
(2)用5mL的蒸馏水溶解干重为30mg的mPEG-COOH(Mw＝5000)，边搅拌边逐滴滴加溶于2mL蒸馏水溶液的干重为23mg的EDC，搅拌反应3h后，向该溶液中逐滴滴加溶于5mL蒸馏水的干重为3.42mg的G5.NH₂-HPAO树状大分子，其中mPEG-COOH与G5PAMAM树状大分子的摩尔比为50:1，EDC与mPEG-COOH的摩尔比为20:1，反应3天,将所得的溶液用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到G5.NH₂-HPAO-mPEG。
(3)用5mL的蒸馏水溶解干重为20mg的G5.NH₂-HPAO-mPEG，边搅拌边逐滴滴加9.12μL三乙胺，搅拌反应30min后，向反应液中加入5.16μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24小时，将所得的溶液用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到多功能化树状大分子纳米平台G5.NHAc-HPAO-mPEG。
合成过程中对该对比载体材料用核磁进行表征，对各个峰进行积分计算可知：树状大分子载体表面修饰了9.4个HPAO、35个PEG。这些测试结果表明已成功设计合成对比载体材料G5.NHAc-HPAO-mPEG。并在标记¹³¹I后，测试形成的¹³¹I-G5.NHAc-HPAO-mPEG放射性化学纯度在98％以上，说明标记¹³¹I成功。