一种小牛血清去蛋白注射液及其制备方法.pdf

本发明公开了一种小牛血清去蛋白注射液及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：1)向小牛血清中加入活性炭，进行活性炭吸附，得到除杂后的混合液；2)将所述混合液和乙醇混合进行醇沉除杂，收集回收液；3)将所述回收液和复合蛋白酶混合进行酶解，得到酶解液；4)将所述酶解液和氧化剂混合进行氧化反应，即可得到所述小牛血清去蛋白注射液。制备得到的小牛血清去蛋白注射液富含小分子多肽的，其具有更高的生物活性和稳定性，并且本发明的生产工艺收率更高，成本更低，对工业化生产意义重大，对于缺血缺氧性疾病具有显著的疗效，应用前景广阔。

1.  一种小牛血清去蛋白注射液的制备方法，包括如下步骤：
1)向小牛血清中加入活性炭，进行活性炭吸附，得到除杂后的混合液；
2)将所述混合液和乙醇混合进行醇沉除杂，收集回收液；
3)将所述回收液和复合蛋白酶混合进行酶解，得到酶解液；
4)将所述酶解液和氧化剂混合进行氧化反应，即可得到所述小牛血清去蛋白注射液。

2.  根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述小牛血清为出生1-6个月的新生小牛采血分离得到的；
所述活性炭的加入量为所述小牛血清质量的1.8％-2.2％；
所述活性炭吸附的时间为20-30min。

3.  根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述混合液和所述乙醇的体积比为1：(3.4-3.6)；
所述醇沉除杂的时间为1.8-2.2h；
所述乙醇是以乙醇水溶液的形式存在，所述乙醇水溶液的体积分数为96％。

4.  根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述复合蛋白酶的加入量为所述回收液质量的1.8％-2.2％；
所述复合蛋白酶是由木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶组成，所述木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶的质量比为1：(0.9-1.1)：(0.55-0.65)；
所述木瓜蛋白酶的活力为3500U/mg；所述胰蛋白酶的活力为3000U/mg；所述枯草蛋白酶的活力为4000U/mg；
所述酶解的条件为：酶解温度为38-42℃，酶解时间为22-26h，pH值为7.8-8.2。

5.  根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤4)中，所述氧化剂为H₂O₂；
所述氧化剂的加入量为所述酶解液质量的0.18％-0.22％；
所述氧化反应的反应温度为36.5-37.5℃，反应时间为0.9-1.1h；
所述氧化反应时的反应体系的pH值为5.1-5.3。

6.  根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，还包括对醇沉除杂后所得液进行离心，弃去沉淀物，收集上清液，并对所述上清液减压蒸馏除去乙醇的步骤；
所述离心为在3000r/min离心20分钟，所述加压蒸馏为在55℃和0.2Mpa条件下加压蒸馏。

7.  根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，还包括对所述酶解液进行超滤截留的步骤：用5K中空纤维柱进行超滤截留。

8.  根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤4)中，还包括向所述氧化反应后所得物中加入MnO₂除去多余H₂O₂，并且过滤除去过量MnO₂的步骤：向所述氧化反应后所得物中加入过量的MnO₂，在60℃下保温10h，并且用0.22μm微孔滤膜过滤除去过量MnO₂即可；
步骤4)中，还包括对所述氧化反应后所得物进行病毒灭活和灌封的步骤。

9.  权利要求1-8中任一项所述的制备方法而制备得到的小牛血清去蛋白注射液。

10.  根据权利要求9所述的小牛血清去蛋白注射液，其特征在于：所述小牛血清去蛋白注射液中小分子多肽的含量为7.0-8.0mg/ml，分子量<5000D。

一种小牛血清去蛋白注射液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种小牛血清去蛋白注射液及其制备方法。
背景技术
小牛血清中含有很多生物活性物质，对缺血缺氧性疾病具有治疗作用。将小牛血清经过去除大分子物质而得到的小分子混合物在临床上用于疾病的治疗已经有多年的历史了，目前仍然是临床常用药物之一；而且对于该领域的研究也从未间断。本品为混合物，其作用机制甚为复杂，现有的研究结果证明其中的小分子多肽和多糖以及某些小分子生物素都具有生物活性。有研究表明，其中的活性小分子多肽为2肽到9肽，分子量为300D-1000D(虞维俊，小牛血及血清去蛋白提取物注射液的质量控制方法研究，硕士学位论文)；亦有研究表明，多肽含量不同的产品，其生物活性亦有差别(任淑萍，小牛血清去蛋白注射液与小牛血去蛋白注射液有效成分含量和生物活性的比较；中华神经医学杂志2006年8月第5卷第8期，767-769)。
发明内容
本发明的目的是提供一种小牛血清去蛋白注射液及其制备方法，该小牛血清去蛋白注射液富含小分子多肽的，具有更高的生物活性和稳定性。
本发明所提供的小牛血清去蛋白注射液的制备方法，包括如下步骤：
1)向小牛血清中加入活性炭，进行活性炭吸附，以除去小牛血清中的小分子有害物质(例如：组胺、尿酸、肌酐等)，得到除杂后的混合液；
2)将所述混合液和乙醇混合进行醇沉除杂，收集回收液；
3)将所述回收液和复合蛋白酶混合进行酶解，得到酶解液；
4)将所述酶解液和氧化剂混合进行氧化反应，即可得到所述小牛血清去蛋白注射液。
上述制备方法中，步骤1)中，所述小牛血清为出生1-6个月的新生小牛采血分离得到的。
所述活性炭的加入量为所述小牛血清质量的1.8％-2.2％，优选为2％。
所述活性炭吸附的时间为20-30min，优选为20min。
上述制备方法中，步骤2)中，所述混合液和所述乙醇的体积比为1：(3.4-3.6)，优选为1：3.5。
所述醇沉除杂的时间为1.8-2.2h，优选为2h。
所述乙醇是以乙醇水溶液的形式存在，所述乙醇水溶液的体积分数具体可为96％。
上述制备方法中，步骤2)中，还包括对醇沉除杂后所得液进行离心，弃去沉淀物，收集上清液，并对所述上清液减压蒸馏除去乙醇的步骤，所述离心具体可在3000r/min离心20分钟，所述加压蒸馏具体可在55℃和0.2Mpa条件下加压蒸馏。
上述制备方法中，步骤3)中，所述复合蛋白酶的加入量为所述回收液质量的1.8％-2.2％，优选为2％。
所述复合蛋白酶是由木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶组成，所述木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶的质量比为1：(0.9-1.1)：(0.55-0.65)，优选为1:1:0.6。
所述木瓜蛋白酶的活力为3500U/mg；所述胰蛋白酶的活力为3000U/mg；所述枯草蛋白酶的活力为4000U/mg。
所述酶解的酶解温度为38-42℃，优选为40℃。
所述酶解的酶解时间为22-26h，优选为24h。
所述酶解时的体系的pH值为7.8-8.2，优选为8。
上述制备方法中，步骤3)中，还包括对所述酶解液进行超滤截留的步骤，具体可用5K中空纤维柱进行超滤截留。
上述制备方法中，步骤4)中，所述氧化剂具体可为H₂O₂。
所述氧化剂的加入量为所述酶解液质量的0.18％-0.22％，优选为0.2％。
所述氧化反应的反应温度为36.5-37.5℃，反应时间为0.9-1.1h，优选为1h。
所述氧化反应时的反应体系的pH值为5.1-5.3，优选为5.2。
上述制备方法中，步骤4)中，还包括向所述氧化反应后所得物中加入MnO₂除去多余H₂O₂，并且过滤除去过量MnO₂的步骤，具体可按如下步骤：向所述氧化反应后所得物中加入过量的MnO₂，在60℃下保温10h，并且用0.22μm微孔滤膜过滤除去过量MnO₂即可。
上述制备方法中，步骤4)中，还包括对所述氧化反应后所得物进行病毒灭活和灌封的步骤，具体可灌注至安瓿中，冲入氮气后封口。
本发明由上述制备方法制备得到的小牛血清去蛋白注射液也属于本发明的保护范围。
所述小牛血清去蛋白注射液中小分子多肽的含量为7.0-8.0mg/ml，分子量<5000D。
小牛血清去蛋白注射液是小牛血清经过去除大分子物质(如蛋白质、核酸、脂多糖等)得到的小分子活性物质的混合物。
本发明通过复合蛋白酶水解增加多肽的含量，使微量呼吸活性刺激指数达到11.5以上，技术指标提升效果显著。既往的传统的纯化方法(例如醇沉、超滤)等只能除掉小分子物质，而血清中的小分子有害物质(例如：组胺、尿酸、肌酐等)无法通过 过滤的方法去除，层析虽然可以，但是层析损耗太大。本发明在醇沉离心前加入活性炭，活性炭会选择性优先吸附高极性的小分子有害物，后吸附极性相对低的蛋白和多肽，这样适量的活性炭可以有效去除上述小分子有害物质而保留活性物质。在经过除蛋白得到的小分子多肽中，含有大量的胱氨酸和半胱氨酸，有大量的游离巯基，多肽的巯基会通过形成二硫键而发生聚合，进而重新生成蛋白，降低稳定性，增加过敏反应的几率。本发明中通过在酸性条件下加入H₂O₂而将游离巯基氧化成磺酸基，磺酸基可以保留一定的生物活性，又可以避免多肽聚合，再通过MnO₂催化使过量的H₂O₂分解，最后通过微孔膜滤过除去MnO₂。本发明显著提升了产品的生物活性，又进一步提高了产品的稳定性，具有显著的进步意义，对于缺血缺氧性疾病具有一定的疗效。
附图说明
图1为实施例2中酶解温度对3种蛋白酶水解度、呼吸活性的影响；柱形图为水解度，从左到右依次为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶；折线为呼吸活性，是木瓜蛋白酶，是胰蛋白酶，是枯草蛋白酶。
图2为实施例2中pH值对3种蛋白酶水解度、呼吸活性的影响；柱形图为水解度，从左到右依次为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶；折线为呼吸活性，是木瓜蛋白酶，是胰蛋白酶，是枯草蛋白酶。
图3为实施例2中加酶量对3种蛋白酶水解度、呼吸活性的影响；柱形图为水解度，从左到右依次为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶；折线为呼吸活性，是木瓜蛋白酶，是胰蛋白酶，是枯草蛋白酶。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所述胰蛋白酶活力为3000U/mg；所述木瓜蛋白酶活力为3500U/mg；所述枯草蛋白活力为4000U/mg；所述胃蛋白活力为12000U/mg；所述糜蛋白酶活力为1200U/mg；所述碱性蛋白酶活力为2000U/mg；上述各蛋白酶均购自国药集团化学试剂有限公司。
实施例1、复合蛋白酶筛选：
取适量小牛血清，加入3.5倍体积的96％乙醇，混合搅拌2小时，3000r/min离心除沉淀，上清液减压除乙醇后，均分成6等份，分别加入2％的胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草蛋白酶和碱性蛋白酶，37℃酶解24小时，分别用截留5000D的中空纤维柱超滤截留，得到的滤液分别采用瓦氏微量呼吸减压法检测微量呼吸活性刺激指数(SI)，结果如下表1所示：
表1 不同蛋白酶的水解效果