幽门螺杆菌抗原 本发明涉及一种幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)新抗原或其抗原片段、这种抗原或其抗原片段在检测幽门螺杆菌中的用途、包含它们的试剂盒、包含这种抗原或其抗原片段的疫苗以及分离这种抗原的方法。
哺乳动物，特别是人类的肠感染通过激活粘膜免疫系统来刺激粘液分泌的免疫反应。这种反应最初经常和血清中的抗体反应平行，尽管血清中的抗体反应通常以IgA抗体的存在为特征。然而，从体内除去抗原(细菌或病毒)后，分泌免疫反应(包括唾液)能迅速地减少。因此，在粘液分泌中抗体的存在反映了现在，也就是当时的感染。在微生物感染的情况下，例如，粘液分泌中的抗体(下文称作分泌抗体)反映了微生物当时的定居状态(如在肠中)，并且这是当时感染有用的监测器。另一方面，把微生物从体内除去后，血清抗体仍持续一段时间。因此，阳性血清抗体试验既反映过去也反映现在暴露于抗原中，其对诊断没有帮助。另一方面，阳性分泌抗体试验表明现在或当时的微生物感染。
可以通过显微镜、微生物培养、在胃粘膜活组织中检测脲酶、脲呼吸试验或通过血清EISAs中存在的特异性抗体来进行幽门螺杆菌感染的诊断。预知幽门螺杆菌感染(作为一种胃粘膜感染)将引起胃分泌中IgA抗体反应。然而，已发现粘液分泌中幽门螺杆菌的特异性抗体属于IgG而非所期望的IgA类。很少IgA抗体被检测到(如果有的话)。因此，AU-A-9067676直接针对粘液分泌中对幽门螺杆菌特异性的IgG抗原的检测，因此提供了在哺乳动物中检测现在，也就是当时的微生物感染地方法。相应的学术出版物见Witt等，粘膜免疫学前沿1693-696(1991)。
在美国胃肠学会年度会议论文集中，已经注意到了幽门螺杆菌阳性患者的唾液中存在IgG抗体。Czinn等在1989年论文集中公开了这种抗体存在后，Larsen等在1991论文集中断定唾液IgG水平在抗生素治疗过程中是一种实用的而非侵害性标记。Landes等在1992年四月论文集中确认了更早期的观察并注意到对幽门螺杆菌唾液IgG的测量是检测幽门螺杆菌阳性患者(特别是对于其它检验不可行的大众或儿童)的一种实用的而非侵害的检验方法。
WO-A-9322682公开了一种方便且可靠的用于幽门螺杆菌的体外试验。该试验利用了与被检验的哺乳动物粘液分泌中的IgG抗体反应的抗原制剂。
因此，有必要鉴定、分离、并提供可用于诊断检验中的幽门螺杆菌的新抗原。这些抗原应该是特异性的，确实可纯化的，同时其特征应该是良好的特异性并且在用于这种检验时无假阳性结果。此外，它们也可以形成用于幽门螺杆菌感染治疗或预防有用的疫苗基础。
这样，在第一个方面，本发明提供了为幽门螺杆菌抗原的蛋白质，在变性和还原的条件下测定时，其分子量在55-65kDa的范围内。
合适地，所述抗原蛋白质在其氨基端末端具有以下氨基酸顺序：
M V T L I N N E D D
Met-Val-Thr-Leu-Ile-Asn-Asn-Glu-Asp-Asp或者与该序列实质上同源的序列。
在氨基酸水平上，如果大量重要的氨基酸显示同源性，可以看作蛋白质序列和另一个蛋白质序列实质上同源。随着优选等级的增加，至少40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，甚至99％的氨基酸可以是同源的。
也发现了完整蛋白的部分本身是抗原性。这样，在第二方面本发明提供了本发明的蛋白质的抗原片段。
在本发明这一方面的一个优选的实施方案中，抗原片段是具有下列序列的肽：
M V T L I N N E
Met-Val-Thr-Leu-Ile-Asn-Asn-Glu
技术人员将明白在此片段序列中出现有些变异而仍保留其抗原特性是可能的。这种变体也形成了本发明的一部分。
可以以纯化的或分离的制剂形式单独提供本发明的抗原蛋白质或其片段，其也可以作为具有其它幽门螺杆菌抗原蛋白质的混合物的一部分提供。
因此，在第三方面本发明提供了包含本发明的蛋白质或一种或多种其抗原片段的抗原组合物。这种组合物能用于幽门螺杆菌的检测和/或诊断。在一实施方案中，此种组合物包含一种或多种附加的幽门螺杆菌抗原。
在第四个方面，本发明提供了检测和/或诊断幽门螺杆菌的方法，其包括：
(a)使本发明的抗原蛋白质、或其抗原片段、或抗原组合物和待检验的样品接触；和
(b)检测针对幽门螺杆菌抗体的存在。
特别是，可以利用本发明的蛋白质、或其抗原片段、或抗原组合物检测IgG抗体。合适地，待测样品可以是生物样品，例如，血液或唾液的样品。利用粘液分泌样品检测幽门螺杆菌之合适方法的实施例见WO-A-9322682的描述。
在第五个方面，本发明提供了本发明的抗原蛋白质、其抗原片段或抗原组合物在检测和/或诊断幽门螺杆菌的用途。优选的是，此种检测和/或诊断是在体外进行的。
在第六个方面，本发明提供了分离本发明抗原蛋白质的方法，该方法包括下列步骤：
(a)制备幽门螺杆菌的培养物，在合适的条件下使培养物生长并收获它们，其后通过洗涤产生洗涤过的细胞沉淀；
(b)在合适的缓冲液中悬浮洗涤过的细胞，其后打碎细胞；
(c)离心以除去细胞碎片，并获得含有可溶性细胞蛋白质的上清液；
(d)对获得的溶液进行梯度洗脱离子交换色谱，分析这样得到的各组分以确定脲酶的存在。
(e)收集含有脲酶的组分，并对所说收集物进行凝胶渗透色谱；
(f)选择合适的峰；并且
(g)在分离物中确认具有55-65kDa范围内分子量的特定蛋白质的存在，并分离这种蛋白质。
本发明的抗原蛋白质、其抗原片段或抗原组合物可以提供来作为用于体外检测和/或诊断幽门螺杆菌之试剂盒的一部分。这样，在第七个方面，本发明提供了用于检测和/或诊断幽门螺杆菌的试剂盒，其包含本发明的抗原蛋白质、其抗原片段或抗原组合物。
此外，可以用本发明的抗原蛋白质或其抗原片段诱导针对幽门螺杆菌的免疫反应。这样，在另一个方面，本发明提供了一种能够在受治疗者体内引起免疫反应的组合物，其包含本发明的蛋白质或其一种或多种抗原片断。合适地，此组合物将是疫苗组合物，可以包含也可以不包含一种或多种合适的佐剂。这种疫苗组合物可以是预防或治疗性疫苗组合物。
本发明的疫苗组合物可以包含一种或多种佐剂。本领域公知的佐剂的例子包括无机凝胶(如氢氧化铝)或油包水乳状液(如不完全弗氏佐剂)。其它有用的佐剂是技术人员公知的。
在另一个方面，本发明提供了：
(a)本发明蛋白质或其一种或多种抗原片段在制备免疫原性(immunogenic)组合物(优选的是疫苗)上的用途；
(b)此免疫原性组合物在诱导受治疗者免疫反应上的用途；
(c)用于治疗或者预防受治疗者幽门螺杆菌感染的方法，该方法包括向受治疗者施用有效量的本发明的蛋白质、至少一种本发明的抗原片段或者抗原组合物(优选的是疫苗)的步骤。
本发明每一方面的优选特征都是就细节上已作必要修正的每一其它方面而言的。
以下以实施例描述本发明，举出这些实施例不应该在任何方面限制本发明。
实施例1
(a)在合适的条件下，使幽门螺杆菌的培养物生长，并在磷酸缓冲盐溶液中收获培养的细胞。接着重复离心以除去细胞碎片以及其它杂质(如琼脂)，添加三次新鲜的PBS以产生洗涤过的细胞沉淀；
(b)把洗涤过的细胞悬浮在pH值7.2的0.1M TRIS-HCl缓冲液中，以用于离子交换色谱步骤。对细胞悬浮液进行足够强度和时间的超声处理(对来源于100个琼脂平板含有细胞的10ml样品6μ下每处理30秒，停60秒，重复25次)以确保能破裂细胞。
(c)然后将悬浮液离心以除去细胞碎片，同时得到含有可溶性细胞蛋白质的上清液。
(d)将从(C)步骤得到的溶液用强阴离子交换树脂(如MonoQ或QSepharose(Pharmacia))通过离子交换色谱进行分级分离，以预定方式利用基于增加洗脱缓冲液中氯化钠浓度(从0至1.0M)的梯度洗脱。然后分析组分中脲酶的存在；
(e)然后将包含脲酶的组分合并，并利用用于球状蛋白质之截断范围为5×103-5×106Da的树脂对其进行凝胶渗透色谱。
(f)通过下列方法选择合适的峰：
(i)对所有的组分进行脲酶测定并鉴定具有脲酶活性的蛋白质峰；同时
(ii)通过把来源于这些组分的1微克蛋白质点样到硝基-纤维素上或等价物上分析所有显示脲酶阳性反应的组分，并分析和脲酶峰非常接近的但为低分子量的含蛋白的峰，干燥后确定其和来源于幽门螺杆菌阳性个体之血清或唾液样品中的幽门螺杆菌特异性抗体的反应能力。
(g)通过对其进行聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)和Western印迹确认分离液中特异性蛋白质的存在，利用从幽门螺杆菌阳性个体收集的人类血清制备的库之IgG，分析印迹。在变性的条件下，进行PAGE，分离已鉴定具有55-65kDa范围内的分子量之蛋白质。
实施例2
以肽MVTLINNE接种兔。如以下描述方法分析血液样品以检验抗体反应。
分析方法
把每毫升血液中含有25μl1％的Thiomersal的溶液(即25μl/ml cone)加入到血液样品中，检验前将样品保存在-40℃。
利用平板进行分析，其中每一个孔都用100μl 5μl/ml的幽门螺杆菌抗原(如WO-A-93/22682所描述的抗原制备物)涂覆，然后以300μl 1％的BycoA溶液后涂覆。
用CDL洗涤缓冲液稀释血液样品，以产生一定范围的稀释液。
CDL洗涤缓冲液： 1dm3的数量
Tris 12.11g
5M HCl 15ml
蒸馏水 400ml
NaCl 87.66g
Thiomersal 0.1g
Tween 80 50g
i)把tris加至蒸馏水中；
ii)在20℃下加入5M HCl直到pH值为7.80。
iii)加入Thiomersal；
iv)加入NaCl；
v)加入Tween 80；
vi)以蒸馏水定容到最后体积。
利用猪抗兔辣根过氧化物酶和ABTS(2，2-Azino-di-[3-乙基-苯并噻唑啉(benzthiazolin)-磺酸盐)的偶联物(用过氧化物酶柠檬酸缓冲液稀释至1/25)作为底物检测结合的抗体，绿色表明阳性结果。
过氧化物酶柠檬酸缓冲液：1dm3的数量
蒸馏水 700ml
柠檬酸 23.0g
NaOH 100ml
30％H2O20.5ml
用1M NaOH调节pH值至4.0
分析流程如下：
1)向每个孔中加入100μl的稀释样品；
2)培养30分钟(振荡)；
3)以CDL洗涤缓冲液洗涤x5并干燥平板；
4)将100μl猪-兔HRP加入到每个孔中；
5)培养30分钟(振荡)；
6)洗涤5次，并干燥平板；
7)将100μl ABTS加入到每个孔中；
8)培养30分钟；同时
9)在@414毫微米读板。
结果
高峰抗体反应发生在大约接种后的6个月。以下表1显示用所述肽接种的两个兔的血液样品在整个培养期的结果。数据是1/100稀释样品的数据。表1 吸光度接种后的月数 兔1 兔2 2 0.484 0.149 3 0.129 1.154 4 0.491 1.057 5 1.236 0.7255 6 1.656 0.899 7 0.89 0.847 8 0.4095 0.7275
这些结果如图1所示。很明显，可以看出所述肽可以引发抗幽门螺杆菌的抗体反应。