含有黄嘌呤甲基衍生物类精神兴奋成分的 抗癌增效剂
本发明涉及的是一种含有黄嘌呤甲基衍生物类精神兴奋成分的抗癌增效剂，其虽特别适合作为与抗癌药物顺铂联合使用的抗癌增效剂，但也可以作为与其它化学抗癌药或放射治疗联合使用的抗癌增效剂。
咖啡因(1，3，7-三甲基黄嘌呤)、茶碱(1，3，-二甲基黄嘌呤)及柯柯碱(3，7-二甲基黄嘌呤)等黄嘌呤甲基衍生物，作为临床上常用的精神兴奋药物和利尿药物已很久了。但其可对化学抗癌药物具有的增效作用是近些年才被发现的。如，对咖啡因，及含有茶碱的茶叶等可具有良好的抗癌辅助作用和效果已多有报导，特别是对其中咖啡因的研究较为深入。现已有细胞学的实验报导证实，咖啡因在与铂类或烷化剂等抗癌药物联合使用时，可通过抑制被化疗药物损害后的细胞的DNA的修复而发挥抗癌增效作用的。但另一方面，这些黄嘌呤甲基衍生物，特别是其中的咖啡因，又是众所周知具有很强的中枢兴奋作用的药物，其小剂量时可兴奋大脑皮层及收缩脑内小动脉；大剂量时能兴奋延脑呼吸中枢、血管运动中枢和迷走中枢；过量时可兴奋脊髓，引起惊厥和肌肉震颤。当其作为抗癌增效剂使用时，由目前的试验和研究可知，增大剂量可提高其抗癌增效的效果。而此时所不需要但又为其本身所固有的强烈地精神兴奋作用所带来的中枢兴奋、躁动不安、呼吸加快、肌肉震颤、心动过速和期外收缩等副作用也必然随之增大。因此，当辅助使用咖啡因作为抗癌增效剂时，在研究和探索其最佳增效用量的同时，尽量减少和克服因其强烈精神兴奋作用所带来的副作用及影响也是不容忽视和需要解决的一个重要问题。
本发明的目的是针对上述问题，在研究和探索使用这些黄嘌呤甲基衍生物类精神兴奋成分，特别是其中咖啡因的最佳抗癌增效用量的同时，为尽量减少和克服因其强烈的精神兴奋作用所带来的副作用及影响而提供一种含黄嘌呤甲基衍生物类精神兴奋成分的抗癌增效剂。由目前对其抗癌增效作用机理的研究可知，本发明的这一抗癌增效剂虽特别适合作为与抗癌药物顺铂联合使用的抗癌增效剂，但显然也可以作为与其它化学抗癌药或放射治疗联合使用的抗癌增效剂。
本发明所说的含有黄嘌呤甲基衍生物类精神兴奋成分，特别是含咖啡因的抗癌增效剂，是以黄嘌呤甲基衍生物类精神兴奋成分和巴比妥类化合物为有效药物组分，其重量组成比例为：黄嘌呤甲基衍生物∶巴比妥类化合物＝(4～12)∶1，必要时可加入药物制剂允许其它的辅助添加成分，如常用的赋型剂、填充分散剂、崩解剂、矫味剂等辅助添加成分。其中所说的黄嘌呤甲基衍生物类精神兴奋成分可为咖啡因、茶碱或柯柯碱中的任何一种。巴比妥类化合物属于巴比妥酸的衍生物或其盐类化合物，随着其结构中取代基和/或是否成盐，本发明中所说的这类化合物可以有常用的巴比妥、苯巴比妥(钠)、异戊巴比妥、戊巴比妥(钠)，以及速可眠等，其均具有与所说的黄嘌呤甲基衍生物类精神兴奋成分，特别是其中的咖啡因的精神兴奋作用相对抗的中枢抑制和镇静作用。上述的几种黄嘌呤甲基衍生物类精神兴奋成分，特别是其中咖啡因与这类巴比妥类化合物的重量组成在上述的比例范围内，均可同时具有抗癌增效作用和抑制中枢兴奋的副作用的双重效果。其中尤以采用比例≥8∶1时为好，通常在比例(8～9)∶1时即可有较为满意的效果。
在研究实验中，首先以咖啡因为例，由咖啡因与常用的苯巴比妥以不同组成比例所成的抗癌增效剂与抗癌药顺铂联合应用，进行了药效学实验，以确定其有效和最佳的组成比例及用药量。实验方法为：将Hela细胞株在RPMI 1640培养基(美国GIBCO)中培养后转移到96孔板，细胞浓度为30万/毫升，设4组以不同组成比例的本发明抗癌增效剂与顺铂同时使用的实验组，实验1～4组所用的抗癌增效剂中咖啡因与苯巴比妥的组成比例分别为2∶1；4∶1；8∶1和12∶1，并设置只单用顺铂的对照组。于CO2孵箱中培养。为保证实验结果的可靠性和准确性，实验重复三次，并用二种检测手段(活细胞计数和MTT测定法)进行结果检测。实验结果如表1。此实验结果表明，由咖啡因与苯巴比妥以不同组成比例所成的本发明抗癌增效剂均能增加顺铂对肿瘤细胞的杀伤作用，且其抗癌增效作用随咖啡因比例的增大而增强。由表1的结果显示，其中咖啡因的比例以≥8为佳。
由于使用中咖啡因强烈的精神兴奋作用是不需要，但又是不可避免而同时存在的副作用，为考察其随使用量的变化关系，以及在本发明抗癌增效剂中的巴比妥类化合物对其副作用的对抗效果，取小鼠40只，随机分为4组，每组10只，各组以按等体积灌胃给药的方式进行了对照实验。实验1～3组均单用咖啡因，其咖啡因浓度分别为25、50和75(毫克/千克)，对照组为按咖啡因∶苯巴比妥＝50毫克∶6毫克/千克给药。给药后立即观察，并连续观察7天。实验结果参见表2。此实验结果清楚显示，实验组中咖啡因的精神兴奋副作用随其使用量的增大在明显增大，而使用同时含有苯巴比妥成分的本发明增效剂的对照组则能明显对抗咖啡因的精神兴奋副作用，达到增加咖啡因用量但副作用较小的使用效果。
为进一步考察各种巴比妥类会化合物在本发明抗癌增效剂中使用时对其抗癌增效作用的影响，对由咖啡因与不同巴比妥类化合物组成的本发明的抗癌增效剂进行了实验：将Hela细胞株在RPMI 1640培养基(美国GIBCO)中培养后转移到96孔板，细胞浓度为30万/毫升。实验组加入顺铂和由咖啡因与不同巴比妥类化合物按8∶1比例组成形式的本发明抗癌增效剂，并设置单用顺铂的对照组，于CO2孵箱中培养。用活细胞计数测定法进行结果检测。实验结果如表3。此实验结果表明，由不同巴比妥类化合物按同一组成比例所成的本发明的抗癌增效剂与顺铂联合使用时均可明显提高对肿瘤细胞的杀伤作用，在上述的实验条件下，以实验1组的增效效果最佳，但适当调整咖啡因与其它巴比妥类化合物的组成比例后，其可具有更为满意的增效效果。
对本发明的抗癌增效剂进一步进行了细胞学实验，以检验与顺铂联合应用时的抗癌增效效果。将Hela细胞株在RPMI1640培养基(美国GIBCO)中培养后转移到96孔板，细胞浓度为30万/毫升，以单用不同浓度顺铂作为对照的对照组，对照1～3组的顺铂浓度(微克/毫升)分别为1.25、0.625和0.3125；实验1～3组分另为在上述相应顺铂浓度的基础上均按250微克/毫升同时加入本发明抗癌增效剂(均为采用上述8∶1的比例组成形式)，于CO2孵箱中培养。为保证实验结果的可靠性和准确性，实验重复三次，并用二种检测手段(活细胞计数和MTT测定法)进行结果检测。实验结果如表4。表4的实验结果显示，本发明的抗癌增效剂可显著增强顺铂的细胞毒作用，联合应用时可使相同剂量时的顺铂对肿瘤细胞的杀伤作用增强，经统计学处理，与对照组的结果间有显著差异(P＜0.01)。用MTT法测定的面积图结果还同时显示出，本发明的抗癌增效剂单独使用时并无细胞杀伤作用，只有在与抗癌药顺铂联合使用时才显示出如表4所示的这一显著增强顺铂细胞毒的作用。
在以咖啡因作为黄嘌呤甲基衍生物成分代表的上述实验基础上，又分别对由茶碱和柯柯碱两种黄嘌呤甲基衍生物成分与苯巴比妥组合所成的本发明抗癌增效剂进行了抗癌增效效果的对比实验。实验方法同样为：将Hela细胞株在RPMI1640培养基(美国GIBCO)中培养后转移到96孔板，细胞浓度为30万/毫升。实验组分别加入顺铂和由咖啡因、茶碱及柯柯碱与苯巴比妥按8∶1比例分别所成的本发明的抗癌增效剂，并设置单用顺铂的对照组，于CO2孵箱中培养。用活细胞计数测定法进行结果检测。实验结果如表5。此实验结果表明，以咖啡因、茶碱或柯柯碱等不同的黄嘌呤甲基衍生物类精神兴奋成分构成的本发明抗癌增效剂均可具有较好的抗癌增效效果，且在均采用与苯巴比妥以8∶1比例组成的形式下，表5的实验结果表明，以咖啡因组的抗癌增效效果最佳。
在对本发明抗癌增效剂的抗癌增效作用进行上述药效学和细胞学的研究和考察的同时，还进行了动物急性毒性实验。将体重为18-21克的昆明种小鼠50只随机分为5组，每组10只。各组按0.2毫升/10克的量等体积灌胃给予不同浓度的本发明抗癌增效剂，给药后立即观察，并连续观察7天，测定其LD50。实验结果如表6。给药后，有些动物出现躁动、兴奋，甚至抽搐等现象，死亡动物在给药后一日内死亡，其余动物第二日后恢复正常活动。经Bliss法计算结果，本发明抗癌增效剂的LD50为387.91毫克/千克，其95％的置信限为354.98～423.90毫克/千克。
上述实验清楚显示，以黄嘌呤甲基衍生物类精神兴奋成分和巴比妥类化合物为有效药物组分所构成的本发明抗癌增效剂在与抗癌药物顺铂联合应用时可具有显著的抗癌增效作用。在研究增大及探索咖啡因等黄嘌呤甲基衍生物类精神兴奋成分的最佳增效用量的同时，还达到了尽量减少和克服其在发挥抗癌增效作用的同时因其强烈的精神兴奋作用所带来的副作用和不良影响，增大了其在发挥抗癌增效作用时的使用安全性和适用范围，具有疗效确切和毒性小的显著特点。由目前对其作用机理的实验和研究可知，本发明的这一抗癌增效剂除可与顺铂药物联合应用外，在与其它抗癌药物的化疗及放射治疗中联合应用，同样会具有相应的抗癌增效作用，在提高癌症治疗效果中具有不可忽视的价值和前景。
表1 药效学实验的Hela细胞死亡时间 组 别 开始死亡时间(小时)完全死亡时间(小时) 顺铂对照组 ＞22 ＞58 实验1组(2∶1) ＞14 ＞36 实验2组(4∶1) 14 36 实验3组(8∶1) ＜14 ＜36 实验4组(12∶1) ＜14 ＜36
表2 苯巴比妥对抗咖啡因副作用的实验 组 别躁动(只)兴奋(只)抽搐(只)死亡(只)实验1组(25毫克) 2 3 1 1实验2组(50毫克) 8 9 5 2实验3组(75毫克) 10 10 9 8对照组(50/6毫克) 8 9 0 0
表3 不同组成形式抗癌增效剂的Hela细胞死亡时间 组 别开始死亡时间(小时) 完全死亡时间(小时实验1组(含苯巴比妥) ＜14 ＜36实验2组(含巴比妥) ＞14 ＞36实验3组(含苯巴比妥钠) ＞14 ＞36实验4组(含戊巴比妥钠) ＞14 ＞36实验5组(含异戊巴比妥) ＞14 ＞36实验6组(含速可眠) ＞14 ＞36 对 照 组 ＞22 ＞58
表4 细胞学实验的Hela细胞死亡时间 组 别 开始死亡时间(小时) 完全死亡时间(小时)对照1组(1.25) 14 32对照2组(0.625) 22 ＞58对照3组(0.3125) 46 ＞＞58 实验1组 14 32 实验2组 14 36 实验3组 18 58
表5 含不同黄嘌呤甲基衍生物增效剂的抗癌增效实验 组 别开始死亡时间(小时) 完全死亡时间(小时) 咖啡因+苯巴比妥组 ＜14 ＜36 茶碱+苯巴比妥组 ＞14 ＞36 柯柯碱+苯巴比妥组 ＞14 ＞36 单用顺铂对照组 ＞22 ＞58
表6急性毒性实验及LD50测定 药物剂量(毫克/千克)动物数 (只) 死亡数 (只)死亡率 (％) 机率单位 (Y) LD50及置信限 (毫克/千克) 554 10 10 100 -- 387.91 354.98～ 423.90 471 10 8 80 5.84 400 10 6 60 5.25 340 10 3 30 4.48 289 10 0 0 --