用于改善仔猪肠道营养的结合态谷氨酰胺的制备方法.pdf

本发明涉及一种用于改善仔猪肠道营养的结合态谷氨酰胺的制备方法，以小麦谷朊粉为原料，先用淀粉酶处理后，再依次用碱性蛋白酶/木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶水解，酶解物经酸化后加热灭酶、离心沉淀、上清液经微滤膜过滤、减压浓缩和喷雾干燥，得到富含结合态谷氨酰胺的活性肽。经动物实验表明，该产物可显著促进仔猪小肠绒毛膜的生长发育，改善仔猪的肠道营养。本发明具有原料来源广、易操作、产物活性高、市场用量大等特点。

1.  一种用于改善仔猪肠道营养的结合态谷氨酰胺的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取谷朊粉与65～75℃水按1:2～5的重量比混合，15～50分钟后，再按当前物料总重的0.1～0.3wt%加入淀粉酶，反应0.5～2.0小时后，将该物料降温到50～55℃，用碱液调整pH至8.0～10.0，再按物料的0.2～1.2wt%加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶，二者重量比为1:1，然后保温反应1.0～2.5小时，再按照所得物料总重的0.2～1.0wt%加入复合蛋白酶，搅拌条件下反应1.0～2.5小时后，将所得物料温度调整为35～38℃，用碱液调整pH至7.5～8.0，按照当前物料总重的0.05～0.3wt%加入胰蛋白酶，搅拌反应2.0～3.5小时；
（2）用酸调节上步所得物料pH至4.3～4.8，加热到100℃灭酶15～20分钟，2500～3500转/min离心除去沉淀物；
（3）将上步所得离心上清液用微滤膜超滤，然后经过浓缩、压力喷雾干燥，得到含有结合态谷氨酰胺的粉状物。

2.  根据权利要求1所述用于改善仔猪肠道营养的结合态谷氨酰胺的制备方法，其特征在于：所述淀粉酶为中温α-淀粉酶、真菌α-淀粉酶中的至少一种。

3.  根据权利要求1所述用于改善仔猪肠道营养的结合态谷氨酰胺的制备方法，其特征在于：在所述步骤（1）中，所述碱液为0.5～2.0mol/L的氢氧化钠溶液。

4.  根据权利要求1所述用于改善仔猪肠道营养的结合态谷氨酰胺的制备方法，其特征在于：在所述步骤（2）中，所用酸为0.5～2.0mol/L的盐酸。

5.  根据权利要求1所述用于改善仔猪肠道营养的结合态谷氨酰胺的制备方法，其特征在于：在所述步骤（3）中，所用微滤膜的孔径为0.45微米。

用于改善仔猪肠道营养的结合态谷氨酰胺的制备方法
技术领域
本发明属于仔猪免疫调节技术领域，具体涉及一种以谷朊粉为原料，通过多酶水解，制备能显著改善仔猪肠道营养的结合态谷氨酰胺的方法。
背景技术
肠道是动物消化吸收养分的主要场所。仔猪尤其是断奶仔猪的肠道发育还很不完善，对外部因素的变化比较敏感，断奶带来的巨大应激及饲料形态的改变使肠黏膜破坏，造成养分的消化吸收率降低，免疫功能下降，影响了仔猪的生长发育，进而影响以后整个生长阶段的健康和发育。因此，改善仔猪的肠道营养具有重要意义。
谷氨酰胺是人体和动物机体的必需氨基酸。大量研究表明，它不仅是机体中氨基的主要储存形式，同时也具有一系列生理活性和营养功能，主要表现为：一是机体细胞合成核苷酸的前体物，是快速增值细胞（尤其是淋巴细胞和肠粘膜细胞）的主要能源物质，可提高机体的免疫功能，促进小肠绒毛膜的生长；二是参与合成还原态谷胱甘肽，提高机体的抗氧化能力，保护肠道免受毒素损害和过氧化损伤，减少疾病和环境应激条件对机体的损害，保证机体的正常代谢；三是促进蛋白质（尤其是肌肉蛋白质）的合成，具有抗疲劳的效果。因此，谷氨酰胺不仅是重要的胃肠类药物，也是运动员快速恢复体力的常用补充剂，在动物营养中也得到广泛应用。但游离的谷氨酰胺溶解性低、热稳定性差，在水溶液中容易转化为谷氨酸或焦谷氨酸，大大降低其应用效果。因此，人们更期待制备结合肽替代游离的谷氨酰胺。
研究表明，结合态谷氨酰胺不仅具有游离谷氨酰胺的功能，而且小肽更容易被吸收，且利用率更高。目前所应用的谷氨酰胺肽主要是丙氨酰-谷氨酰胺二肽和甘氨酰-谷氨酰胺二肽，但由于是人工合成，其价格昂贵，在生产实际中应用经济成本较高。因此，以富含谷氨酰胺的蛋白质为原料，通过酶解方法制备结合肽谷氨酰胺是经济、合理的技术选择。
谷朊粉是将小麦面粉中的淀粉去除后的产物，蛋白质含量高达80%。谷朊粉中的谷氨酰胺含量高达33%以上，是目前含谷氨酰胺最多的植物蛋白。通过酶解可以得到含有结合态谷氨酰胺的生物肽，与人工合成的谷氨酰胺二肽相比，其价格优势非常明显。
目前水解谷朊粉(小麦蛋白)的研究文献较多，获得了具有不同功能性质或特征的小麦蛋白酶解物，如潘丽军“双酶分步水解法制备谷氨酰胺活性肽的研究”（食品工业科技，2008），谷中华“小麦面筋蛋白酶解制备合适分子量小肽的研究”（食品工业科技，2013）用了4种蛋白酶，分别用单一蛋白酶直接对谷朊粉酶解考察不同酶的水解功效。杨得胜“水解面筋蛋白高效制备谷氨酰胺结合肽的研究”（食品科学，2006）中采用2种蛋白酶的组合进行研究。关于小麦蛋白酶解的学位论文也有若干篇，如吕艳 “酶解小麦蛋白制取谷氨酞胺活性肤的研究”（浙江大学，2008）用酸性蛋白酶水解；张海华“小麦面筋蛋白源谷氨酰胺肽的酶解制备，结构分析与生理活性研究”（江南大学，2011）中用碱性蛋白酶水解；孔祥珍“麦面筋蛋白的酶解及其阿片肽的研究”（江南大学，2007）中分别单独使用了多种蛋白酶进行研究；洪瑾芳 “酶解小麦蛋白对热应激小鼠生理功能的影响”（福建农林大学，2009）用复合蛋白酶水解；张丽“谷氨酞胺活性肽的制备及性质研究”（合肥工业大学，2009）采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶；李清丽“谷朊粉活性肽的酶解制取工艺研究”（河南工业大学，2007）采用胰蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶中的单酶水解和双酶结合水解等。
有多篇专利文献中也涉及到小麦蛋白的酶解。如新威公司的“一种饲用小麦水解蛋白的工业化生产方法CN200910065614.7” 采用碱性蛋白酶和复合酶两步水解法；春发公司“一种谷朊粉水解液的制备方法CN201110216644.0”采用磷酸预处理加热反应2小时后再加碱液+木瓜酶、胰蛋白酶混合物，最后再用风味酶水解；天九公司“从谷朊粉中酶法制取小麦肽的工业生产方法CN200810015396.1”采用复合酶水解反应8小时；江南大学等“一种酶解小麦蛋白制备小麦蛋白源阿片活性肽的方法CN200910231736.9”采用胃蛋白酶反应9～24小时，再加胰蛋白酶水解4～6小时，灭酶离心后上清液活性碳脱色，再超滤、干燥得产品。远成药业“一种谷朊粉肽的提取方法CN201010540566.5”在物料中加入乙醇和亚硫酸钠并蒸煮数小时后，依次用碱性酶和风味酶水解，再脱色、脱盐、浓缩、干燥得到谷朊粉肽；联海公司“一种小麦水解蛋白的生产方法CN201310191254.1”采用物料先用复合酶水解后再用淀粉酶和糖化酶水解，最后接种酵母菌发酵。
上述研究虽然是谷朊粉或小麦蛋白的酶解，但由于各种蛋白酶的水解特性和酶解顺序不同，导致其酶解产物的性质和功能也有很大差异。但鲜有以制备可改善仔猪肠道营养为主要研究目标的，仅见于刘文豪 “麦谷蛋白源谷氨酰胺肽的制备和肠道营养效果研究”（华中农业大学，2008），但该文献仅是将小麦谷朊粉中的醇溶蛋白去除后，用其中的麦谷蛋白为原料，再用胰蛋白酶和碱性蛋白酶水解，与本发明采用谷朊粉为原料，通过淀粉酶和蛋白酶的顺序水解方法有根本性不同。
发明内容
鉴于谷氨酰胺对动物生长发育具有重要影响、游离谷氨酰胺不稳定、合成谷氨酰胺二肽成本高、不适宜大量应用等特点，本发明提供一种结合态谷氨酰胺的制备方法，以富含谷氨酰胺的小麦谷朊粉为原料，采用淀粉酶和蛋白酶顺序水解的方法，制备对仔猪小肠绒毛膜发育有显著效果的结合态谷氨酰胺。
为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：
先用淀粉酶将谷朊粉中的淀粉水解为适宜大小的糊精，使其有利于参与后续蛋白酶水解过程中功能性产物的生成。在前述淀粉酶处理的基础上，按照一定的顺序，先后使用不同的蛋白酶定向水解谷朊粉蛋白中的不同位点，将其降解为具有特定功能的小肽分子。具体包括以下步骤：
（1）取谷朊粉与65～75℃水按1:2～5的重量比混合，15～50分钟后，再按当前物料总重的0.1～0.3wt%加入淀粉酶，反应0.5～2.0小时后，将该物料降温到50～55℃，用碱液调整pH至8.0～10.0，再按物料的0.2～1.2wt%加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶，二者重量比为1:1，然后保温反应1.0～2.5小时；再按照上步所得物料总重的0.2～1.0wt%加入复合蛋白酶，搅拌条件下反应1.0～2.5小时；将上步所得物料温度调整为35～38℃，用碱液调整pH至7.5～8.0，按照当前物料总重的0.05～0.3wt%加入胰蛋白酶，搅拌反应2.0～3.5小时；
（2）用酸调节上步所得物料pH至4.3～4.8，加热到100℃灭酶15～20分钟，2500～3500转/min离心除去沉淀物；
（3）将上步所得离心上清液用微滤膜超滤，然后经过浓缩、压力喷雾干燥，得到含有结合态谷氨酰胺的粉状物。
所述淀粉酶优选为中温α-淀粉酶、真菌α-淀粉酶中的至少一种。
所用碱液优选为0.5～2.0 mol/L的氢氧化钠溶液。
所用酸优选为0.5～2.0mol/L的盐酸。
所述微滤膜的优选孔径为0.45微米。
本发明的积极有益效果：
本发明在大量研究的基础上，确定先用淀粉酶处理后，再按照特定的顺序，用四种来源于动植物和微生物的蛋白酶依次水解谷朊粉，经酸化沉淀、膜分离技术处理等制备结合态谷氨酰胺。经动物试验证明，该结合态谷氨酰胺具有改善仔猪肠道营养、促进仔猪小肠绒毛膜生长发育、提高仔猪抗应激能力等效果。
（1）本发明首先使用淀粉酶将谷朊粉中的淀粉大分子降解为小分子的糊精或还原糖，减少淀粉与蛋白质的相互作用，然后，按照特定顺序依次使用不同的蛋白酶水解物料中的蛋白质。
（2）本发明将反应料液调整到特定pH范围再加热，这不仅有利于快速灭酶，还可使轻度水解的大分子蛋白质沉淀，更有利于小分子肽的分离。
（3）经分析本发明所得产物中90%以上是分子量小于2000 Da的成分，结合态谷氨酰胺的含量大于29.1%，游离谷氨酰胺的含量小于0.3%。经动物饲喂试验，该产物对改善仔猪肠道营养、促进其小肠绒毛膜生长发育有显著效果。
（4）本发明所用原料来源广，且具有易操作、产物活性高、市场前景广阔等优点。
附图说明
图1为本发明实施方法1所得产物的分子量图谱（凝胶色谱柱分析）；
图2为本发明实施方法2所得产物的分子量图谱（凝胶色谱柱分析）；
图3为本发明实施方法3所得产物的分子量图谱（凝胶色谱柱分析）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1  用于改善仔猪肠道营养的结合态谷氨酰胺的制备方法，包括如下步骤：
将谷朊粉与70℃热水按1:3重量比混合，于反应釜中保温45分钟后，再按当前物料（谷朊粉+热水）重量的0.15wt%加入中温α-淀粉酶，反应1.5小时；将物料降温至50℃，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至9.0，再按当前物料（谷朊粉+热水+中温α-淀粉酶+氢氧化钠溶液）总重的1.0wt%加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶(二者重量比为1:1)，反应2.0小时；再按当前物料（谷朊粉+热水+中温α-淀粉酶+ pH调节剂+碱性蛋白酶+木瓜蛋白酶）总重的0.8wt%加入复合蛋白酶，搅拌条件下反应1.5小时；将物料温度调整为37℃，调整pH至7.8，按当前物料（谷朊粉+热水+α-中温淀粉酶+pH调节剂+碱性蛋白酶+木瓜蛋白酶+复合蛋白酶）总重的0.1wt%加入胰蛋白酶，搅拌反应2.5小时；用1mol/L盐酸节物料pH至4.5～4.6，加热到100℃灭酶18分钟，然后以2800转/min离心除去沉淀物；上清液用CMW 2000微滤膜超滤，再经过浓缩，压力喷雾干燥，得到粉状物。
用TSKgel G2000 SWXL凝胶色谱柱分析，该产物的分子量图谱如图1所示。通过已知分子量标准肽（分别为细胞色素C，MW12500；抑肽酶，MW6500；杆菌酶，MW1450；乙氨酰-乙氨酰-酪氨酰-精氨酸，MW451；乙氨酰-乙氨酰-乙氨酸，MW189)在相同条件下凝胶色谱分析和计算，该产物中分子量小于2000Da的组分含量为93.5%。经氨基酸分析可知，其中结合态谷氨酰胺的含量为29.1%，游离态谷氨酰胺的含量为0.25%(分析方法参考中国专利文献CN201410131180.7)。
仔猪应用试验：选用14日龄断奶的杜大长三元杂交断奶仔猪应用试验，日粮中添加本实施例产物2.5wt%，试验周期20天，以添加小麦蛋白者为对照。结果显示，试验组仔猪平均日增重比对照组提高8.05%，饲料报酬提高9.3%；饲喂5天时，试验组仔猪十二指肠、空肠和回肠的宽度比对照组分别提高12.2%、5.3%和11.2%，高度分别提高12.5%、6.6%和14.1%。表明本发明所得结合态谷氨酰胺比小麦蛋白具有较好的肠道营养效果。
实施例2用于改善仔猪肠道营养的结合态谷氨酰胺的制备方法，包括如下步骤：
于反应釜中将谷朊粉与65℃热水按1:2重量比混合15分钟后，再按当前物料重量的0.1%加入真菌α-淀粉酶，反应0.5小时；将物料降到55℃后，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调整pH为8.0，再按当前物料重量的1.2%加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶(二者重量比为1:1)，反应1.0小时；再按当前物料重量的1.0%加入复合蛋白酶，反应1.0小时；将物料温度调整为35℃，调整pH为7.5，按当前物料重量的0.05%加入胰蛋白酶，搅拌反应2.0小时；用0.5mol/L盐酸调节pH至4.3～4.4，加热到100℃灭酶15分钟，然后以2500转/min离心除去沉淀物；上清液用CMW 2000微滤膜超滤，再经过浓缩，压力喷雾干燥，得到粉状物。
用TSKgel G2000 SWXL凝胶色谱柱分析，该产物的分子量图谱如图2所示。通过已知分子量标准肽的分析和计算，该产物中92.1%的组分分子量小于2000Da。经氨基酸分析可知，其中结合态谷氨酰胺的含量为28.9%，游离态谷氨酰胺的含量为0.25%。
选用14日龄杜大长三元杂交断奶仔猪应用试验显示，日粮中添加本实施例产物2.5wt%，以添加小麦蛋白者为对照。结果显示，试验周期20天内，试验组仔猪平均日增重比对照组提高8.11%，饲料报酬提高9.5%；饲喂5天时，试验组仔猪十二指肠、空肠和回肠的宽度比对照组分别提高12.1%、5.4%和11.3%，高度分别提高12.7%、6.5%和14.3%。表明本发明的结合态谷氨酰胺比小麦蛋白具有较好的肠道营养效果，且具有较好的稳定性。
实施例3用于改善仔猪肠道营养的结合态谷氨酰胺的制备方法，包括如下步骤：
于反应釜中将谷朊粉与75℃热水按重量比1:5混合50分钟后，再按当前物料重量的0.3%加入中温α-淀粉酶，反应2小时；将物料降温到55℃后，用2mol/L氢氧化钠溶液调整pH至10.0，再按当前物料重量的0.2%加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶(二者重量比为1:1)，反应2.5小时；按照当前物料重量的1.0%加入复合蛋白酶，反应2.5小时；将物料温度调整为38℃，pH调整为8.0，按当前物料重量的0.3%加入胰蛋白酶，反应3.5小时；用2mol/L盐酸调节pH至4.8，加热到100℃灭酶20分钟，然后以3000转/min离心除去沉淀物；上清液用CMW 2000微滤膜超滤，再经过浓缩，压力喷雾干燥，得到粉状物。
用TSKgel G2000 SWXL凝胶色谱柱分析图谱如图3所示。该产物中91.6%的组分分子量小于2000Da。结合态谷氨酰胺的含量为29.4%，游离态谷氨酰胺的含量为0.20%。
选用14日龄杜大长三元杂交断奶仔猪应用试验显示，日粮中添加本实施例产物2.5wt%，以添加大豆分离蛋白者为对照。结果显示，试验周期20天内，试验组仔猪平均日增重比对照组提高8.77%，饲料报酬提高10.7%；饲喂5天时，试验组仔猪十二指肠、空肠和回肠的宽度比对照组分别提高13.2%、6.8%和13.1%，高度分别提高13.9%、7.9%和16.1%。表明本发明的结合态谷氨酰胺比大豆分离具有较好的肠道营养效果。