医用胶原蛋白海绵及其制造工艺 本发明属医疗器械敷料类，具体地说就是以胶原蛋白制成海绵状物，应用于临床用以止血和促进伤口愈合。
胶原蛋白是生物体内最丰富，广泛存在的一种结构蛋白质，它存在于结缔组织中，是皮肤、骨骼、肌腱的主要组成成份。各种组织中分离出来的胶原蛋白的分子量约为283000，它由二个相同的含1056个α-氨基酸残基的α1亚基和一个含1029个α-氨基酸残基的α2亚基所组成，构成三螺旋的基本结构，它们在组织中以纤维状态存在，起着支架作用。在进化上，胶原蛋白是十分保守的，种属间差异很小，因而免疫源性极低。所以从动物组织中(如牛跟腱)提取出来的胶原蛋白可作为被人体接受的植入原料。利用胶原蛋白的理化特性，生物学特性、免疫学特性及机械物理方面的特性；利用它的易被修饰和可塑性；制造成胶原蛋白海绵，应用于临床医疗。
目前以胶原蛋白为基楚的医疗产品研究和开发正方兴未艾。近十余年来胶原蛋白在生物医学上的运用已经进入一个新时代，随着科学的进步胶原蛋白材料在医学上潜在的功能和作用不断被发现，必将加速胶原蛋白在医药科学方面的发展。我查阅和检索了四十年至今的胶原蛋白国内外研究文献和发明专利，供鉴前人经验，积多年知识积累，完成本专利的研制。
在临床止血材料的研究中，曾有以多糖类、胶原蛋白等为主要原料，制成各种形式膜，或者海绵状物，作为止血材料。或将胶原蛋白经过浸泡止血剂，以增强止血作用(US-4.606910)。可由牛或猪来源的生物材料，经过酸、碱分离纯化，溶胀、粉碎、稀释和冷冻干燥生产细孔的胶原蛋白海绵应用于临床止血。(DE-3203-957)。有用酸处理的动物结缔组织(真皮、肌腱)再经冷冻干燥制造出多孔的胶原片材料。(US-4,412,947)90年代初开始分别以酸，碱处理，浓缩，洗涤、脱水干燥等方法生产具有天然结构的医药胶原膜。具有止血、保护创面、促进伤口愈合功效。(US-5,028,695)。提取胶原蛋白的原材料由动物的结缔组织进展到人体组织上来，利用胎盘、胎膜、脐带提取人体胶原蛋白制成膜，更降低了免疫源性，增加了临床应用的安全性(JP特开平5-56987)。近几年来胶原蛋白提取制备技术趋向完善，经酸、碱、盐、酶解、冷冻干燥技术处理制成海绵状物，广泛应用于临床。(RU-2039766)。94年进入我国医药市场地欧洲科研大药厂生产的解尔分恩片(GELIX)就属上述类型产品。国内关于胶原蛋白制备技术也有报道，将胶原蛋白制备成膜，用以止备和覆盖烧伤创面，已收到一定疗效，(医用胶原蛋白和胶原膜研制及临床应用。中华创伤杂志95.11(3)-149-150)。
本发明的目的：在于公布一种医用胶原蛋白海绵及其制造工艺。本发明的医用胶原蛋白海绵具有良好的止血效果，尤其对组织渗血，实质脏器出血效果更佳。它能促进纤维母细胞、毛细血管的生长，具有促进伤口愈合的作用，用胶原蛋白海绵覆盖烧伤创面有防止感染，减少分泌物，减少疤痕组织作用，有促进皮肤溃烂、瘘管、窦道及褥疮愈合作用。
现将本发明内容说明如下：
1．从肉联厂购买新鲜牛跟腱，剔出跟腱外壳，肌肉、脂肪组织及其他杂质，自来水冲洗三遍，去离子水冲洗三遍。
2．75％酒精浸泡5分钟消毒处理，再用无菌水冲洗后冷冻8小时，然后取出切成厚为1mm片或匀浆。
3．将牛跟腱片(或匀浆液)以50～60倍体积，稀碱液(NaOH、KOH、NaHCO3、CaCO3)PH8.5浸泡过液，充分溶胀。在10℃条件下，用碱性蛋白酶水解96小时，酶量按1∶500～1000加入，将酶解液离心4000rpm 20分钟，保留沉淀1，收集上清夜1，向上清液中加入有机溶剂0.25～25％(W/W)(甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇)混匀过夜，离心12000rpm 30分钟，弃上清液2，保留沉淀2(即胶原蛋白)。
4．将上述沉淀用无菌水稀释5倍，用酸调PH至2.0±0.5(甲酸、乙酸、丙二酸、柠檬酸)，加蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶)按1∶500～1000(V/V)，在10℃条件下水解96小时，离心4000rpm 20分钟，弃沉淀3留取上清夜3，加入有机溶剂0.25～25％(V/V)，(甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇)充分混匀。离心12000rpm 30分钟，弃上清液4，留取沉淀4(即胶原蛋白)。
5．将两次沉淀(胶原蛋白)装入透析袋透析至无有机溶剂为止。
6．收集透析后的胶原蛋白，以0.05～15％(V/V)的交联剂(甲醛、乙醛、戊二醛)交联2小时，加入凝血酶。
7．将交联的胶原蛋白装在特制的模型中，进行冷冻干燥24～32小时，温度变化-40℃～35℃，升温1～2℃/小时，真空度6～4Pa。
8．最后将制得的胶原蛋白海绵包装，用CO60照射后入库。
本发明与现有的医用胶原蛋白生产技术相比有如下优点：
1．现有的医用胶原蛋白产品制造过程中，共同的缺点是缺少除脂肪工艺过程，所以在他们的产品中都含有一定量的脂肪。由于脂肪的存在大大降低了胶原蛋白的生物功能，影响胶原蛋白制品的保存时间。因为脂肪酸在氧分子的作用下产生酸败反应，释放超氧阴离子(过氧化脂质)，它对全身和局部伤口都将产生损害作用，而且这种酸败反应随着时同推移会加重。所以目前进口同类产品五年有效期是不够安全的，(如：欧洲科研大药厂生产的解尔分思片[GELIX]中含有脂肪酸，有效期五年)，因为有效期长短决定于留样观察实验，而留样观察实验没有注意到从分子水平上观察胶原蛋白中所含脂肪酸的变化情况。本发明弥补了上述的不足，在制造过程中增加了除脂肪的工艺步骤。这样本发明产品五年有效期内，相对比进口产品安全系数大。
2．本发明增添了凝血因子。所以凝血效果甚佳，并有良好的粘附性和组织相溶性，易被组织吸收，经动物实验观察证明四周后本发明医用胶原蛋白海绵可被完全吸收。
3．本发明在提取胶原蛋白过程中是在低温情况下，使用微量蛋白酶水解得到的胶原蛋白具有生物活性，因此制成医用胶原蛋白海绵临床应用效果显著。
4．原材料广泛、成本低，生产工艺先进，设备简单。
本人认为实现本发明最好方式，最快捷径是在原药厂的基楚之上，有万级洁净区，有低温高速冷冻离心机和冷冻干燥机等主要设备就可以建立一条医用胶原蛋白海绵生产线。
实例：
称取牛跟腱5Kg，用自来水清洗，剔除跟腱外壳，脂肪，肌肉等杂质，自来水再冲洗三遍，去离子水冲洗三遍，浸泡在75％酒精5分钟，取出用无菌水冲洗后冷冻8小时，取出切片厚度1mm，加无菌水300L配成稀碱液PH8.5浸泡过夜，加入碱性蛋白酶10g、在10℃条件下酶解反应96小时，取出反应液离心4000rpm 20分钟，得沉淀约50L，(留作下步处理)上清夜约250L，丙酮20L，离心12000rpm 30分钟，弃上清夜得胶原蛋白显重约8Kg，将上步留下的50L沉淀，加无菌水250L，用丙二酸调PH至2.5，加木瓜蛋白酶20g水解96小时，离心4000rpm 20分钟，弃沉淀，留上清夜约250L，加20L丙酮，静置4小时后离心12000rpm 30分钟。弃上清，得胶原蛋白8Kg，将两次获得胶原蛋白透析至中性。取出后用2.5％戊二醛交联，装模型5×5×0.4方盘中进行冷冻干燥，可得1350片胶原蛋白海绵，经内外包装后经CO60照射消毒即可入库。