本发明涉及的是一种水溶性中分子量动物胸腺提取物，尤其是具有促进细胞增殖效应的乳猪胸腺蛋白，它能有效的促进细胞增殖，对治疗胃溃疡、十二指肠球部溃疡及促进创面的愈合有明显的疗效;本发明也是CN92105643.5的后续专利。 胸腺是体内分泌激素和产生多种细胞因子的器官，胸腺产生的多肽和蛋白质能调节免疫反应。近年，国外对胸腺提取物的研究已引起重视。七十年代初期，Goldstein等人从小牛胸腺中分离出一组能调节免疫系统的多肽，生化分析表明上述胸腺肽是具有活性的单一肽类，其分子量均小于15000道尔顿，七十年中期，Hoopper等人从小牛胸腺肽的制备中第一次采用超滤技术截留分子量小于15000道尔顿的胸腺肽组份;77年Goldstin提出了分子量为3108道尔顿的制品a;79年Ahmed提出分子量为2500道尔顿的制品a7;以及81年Low提出的分子量为4982道尔顿的制品a。从上述内容可以看出，目前已经公开地研究结果，主要集中在小分子胸腺肽，分子量小于15000道尔顿，还有的学者认为，胸腺中具有生物活性的成份均是分子量在6000道尔顿以下的较小的多肽。
92年，我们提出了从乳猪胸腺中提取出一组中分子量水溶性胸腺蛋白，并对其进行促细胞增殖活性的研究。在先专利仅提出了胸腺蛋白的制备，对在先专利所述的胸腺蛋白的各种物化参数的进一步研究得出：本发明所述的水溶性中分子量动物胸腺提取物的主要活性为3～5万的水溶性胸腺蛋白，它还含有多种人体必须的维量元素和氨基酸，本发明所述的水溶性中分子量动物胸腺提取物对胃溃疡、十二指肠球部溃疡以及促进创伤面的愈合有非常明显的效果。
本发明的主要目的是提供一种具有促进细胞增殖的水溶性中分子量动物胸腺提取物，尤其是乳猪胸腺蛋白，它能有效的促进细胞增殖，对治疗胃溃疡、十二指肠球部溃疡及促进创面的愈合有明显的疗效;
下面简单叙述本发明中分子量的乳猪胸腺蛋白的制备工艺。
首先，选用40-60天猪龄的健康乳猪的胸腺，拔除胸腺上的脂肪组织，在尽可能短的时间和低温条件下将胸腺高速捣碎成匀浆，将捣碎后的匀浆的温度保持在80-90℃下保持10-30分钟，然后，离心分离去沉淀，对上清液进行二次透析截留分子量3-5万道尔顿的胸腺蛋白。
上述实例是用来说明本发明工艺，而不是用来限制本发明，类似的方法都在本发明的范畴之内。
图1是不同浓度的水溶性中分子量动物胸腺提取物对内皮细胞（EC）的增殖状况。
图2是不同浓度的中分子量动物胸腺提取物对小鼠3T3成纤维细胞（FC）的增殖状况。
图3是水溶性中分子量动物胸腺提取物、成猪胸腺蛋白（TP）、胸腺肽注射液（TF）、肝细胞生长素注射液（HGF）对内皮细胞的增殖效应。
图4是水溶性中分子量动物胸腺提取物、成猪胸腺蛋白（TP）、胸腺肽注射液（TF）、肝细胞生长素注射液（HGF）对成纤维细胞的增殖效应。
图3、图4中1是水溶性中分子量动物胸腺提取物、2是成猪胸腺蛋白（TP）、3是胸腺肽注射液（TF）、4是肝细胞生长素注射液（HGF）;方框中空白是试样，阴影为对照。
图5是本发明所述的水溶性中分子量动物胸腺提取物单独或和其它药物组合以及本发明所述的水溶性中分子量动物胸腺提取物不同剂量互相或和盐水对照下愈合率的比较;
图6、7是水溶性中分子量动物胸腺提取物在不同条件下的高效液相色谱图;
本发明提取的中分子量乳猪胸腺提取物（TP）经高效液相色谱分析共有6个组份峰、6条电泳带，在波长200-340nm的紫外扫描中，本发明的胸腺提取物在280nm有一主要吸收峰，仍属一组中分子蛋白类物。本发明所述的中分子量乳猪胸腺提取物经用内皮细胞（EC），小鼠3T3成纤维细胞（FC）连续增殖传代培养研究发现存在着一组能明显促进内皮细胞（EC），小鼠3T3成纤维细胞（FC）增殖效应的活性组份，而且出现增殖效应与乳猪胸腺提取物最佳浓度相关的现象。
将上述方式制备的水溶性中分子量动物胸腺提取物进行各项试验，具体内容如下。
样品包括：中分子量动物胸腺提取物;胸腺肽注射液（TF），由广东省生物制品研究所提供;促肝细胞生长素注射液，由广东省阳江制药厂提供。内皮细胞（EC）的制备与在先专利相同。
传代培养时，用D-Hanks＇液轻洗细胞单层2-3遍。用0.06%胰蛋白酶在室温下消化1-2分钟，弃消化液，加入内皮细胞培养液，用吸管吹打20-30次，制成细胞悬液。以1∶2-3比率传代。用于实验的为2-3代细胞，经V因子相关抗原（VR.Ag）的抗体检测，确认为血管内皮细胞后方作为生物效应测定用细胞。
小鼠3T3成纤维细胞（FC）由第一军医大学珠江医院提供（培养基为1640培养基加20%小牛血清）。
本发明的动物胸腺提取物生物效应测定和CN92105643.5相同，即将各检测样品（胃安素口服液、成年猪胸腺蛋白、胸腺肽注射液（TF）、肝细胞生长素注射液（HGF），按不同浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml）分别加入3孔细胞中平行检测。每份样品设立3孔空白对照（与盐水做对照）。
不同浓度的中分子量动物胸腺提取物对内皮细胞（EC）、小鼠3T3成纤维细胞（FC）增殖状况见图1，图2。
图1、图2提示，本发明的水溶性中分子量动物胸腺提取物对内皮细胞、小鼠3T3成纤维细胞均有明显的促增殖生物效应，与对照组比较有显著性差异（P＜0.01），而且增殖效应与水溶性中分子量乳猪胸腺蛋白的最佳浓度有关（0.2mg-0.4mg/ml）。
各种不同检测样品对内皮细胞（EC）、小鼠3T3成纤维细胞（FC）增殖效应的影响比较，结果见图3，图4。
图3、4表明本发明的水溶性中分子量动物胸腺提取物有明显促进内皮细胞（EC）、小鼠3T3成纤维细胞（FC）增殖的作用;而成年猪胸腺蛋白、胸腺肽注射液（TF）、促肝细胞生长素注射液（HGF）三种被检样品均无明显促内皮细胞（EC）、小鼠3T3成纤维细胞（FC）增殖活性，与对照组比较无明显差异（P＞0.05）;另外，促肝细胞生长素注射液（HGF）对内皮细胞（EC）虽然有低水平的刺激现象，但与水溶性中分子量动物胸腺提取物相比仍有显著性差异，与成年猪胸腺蛋、胸腺太注射液（TF）结果比较无明显意义。说明其中确存在着一组能提高内皮细胞（EC）、小鼠3T3成纤维细胞（FC）增殖的活性组份。
正如图6、7以及相应的表1和表2中所给出的数据，本发明述的水溶性中分子量动物胸腺提取物经高效液相色谱分析共有6个组份峰、6条电泳带，这是在波长261nm的条件下测定的六个主要吸收峰;其具体测定值见表1、2，图谱见图6、7。
表1对本发明胸腺提取物组份分析（图谱见图6）
93 10:30:23 [261 nm Threshold 950]
No. RT Match Area[AU*min] Left time Right time
261 nm
time [%] Peak Pure Peak Pure Peak Pure
1 2.71 33.56 0.332771 0.111683 1.97 2.63 4.79 2.79
2 5.14 75.21 0.038792 0.029175 4.79 4.98 6.07 5.27
3 6.45 83.29 0.009298 0.007744 6.10 6.23 6.95 6.66
4 7.59 58.50 0.058697 0.034337 6.95 7.46 9.14 7.75
6 10.13 99.94 0.001007 0.001007 9.78 9.81 10.53 10.53
7 11.43 10.28 0.015631 0.001606 10.53 11.41 11.65 11.46
8 11.86 31.33 0.037561 0.011767 11.65 11.81 12.29 11.89
9 12.47 34.72 0.010392 0.003608 12.29 12.45 12.82 12.53
10 12.98 84.48 0.036578 0.030902 12.77 12.93 13.17 13.11
11 14.05 93.25 0.203458 0.189729 13.25 13.70 14.69 14.21
12 16.29 95.86 0.625559 0.599632 14.71 15.46 16.55 16.50
13 18.18 70.12 0.001803 0.001264 17.78 18.05 18.37 18.29
14 18.95 44.65 0.005032 0.002247 18.37 18.85 19.17 19.17
15 19.38 60.27 0.003061 0.001845 19.17 19.22 19.86 19.54
表2
BASELINE(O)1987 Dyngmio
BASELINE 810 PEAK INTEGRAT
SAMPLE:KV-61 Typ
#1 in Method:DEM
RATE:2.0points see Filename:KV 61
Duration:28.000minutes Index:DiSk
Injeetien Vol5.0
DETECTOR:detector 1
PK# ID# PeakStart PeakEnd Retention Type PeakAied
(min) (min) (min) (microvolt see) (microvolt)
1 7 5.792 6.803 6.475 BP 240111.27 6765.1280 1.37 1.96
2 6.808 7.233 6.950 PP 139439.13 5714.8940 0.80 1.65
3 8 7.233 8.942 7.567 PP 441108.90 7094.8609 2.52 2.03
4 8.942 10.933 9.900 PP 4105228.2 132086.65 23.43 38.21
5 10.933 13.158 11.308 PP 2583546.6 23773.196 14.75 6.88
6 13.158 13.802 13.650 PP 632159.16 15103.700 3.610 4.37
7 13.892 16.258 15.108 PP 2399322.4 26578.787 13.69 7.69
8 16.258 10.042 17.353 PP 3252509.7 40426.259 18.56 11.70
9 19.042 20.325 19.575 PP 331481.69 6614.6858 1.30 1.91
10 20.325 22.917 21.117 PP 2943270.0 68632.560 16.80 19.87
11 22.917 23.742 23.425 PP 67105.156 1714.0123 0.38 0.51
12 23.742 24.500 24.187 PP 114374.27 3274.3219 0.67 0.95
13 24.500 25.458 24.875 PP 194417.63 5611.8972 1.11 1.62
14 25.458 26.700 23.758 PP 64305.517 1819.9684 0.37 0.58
15 26.700 27.733 27.417 PB 11581.512 349.28326 0.07 0.10
THTAL 17520021 345643.20
水溶性中分子量动物胸腺提取物紫外扫描在波长280nm有一主要吸收峰，此结果是委托中山医科大学分析测试中心测试得出的。
对本发明的胸腺提取物分析表明，本发明的胸腺提取物与现有的小分子（分子量1.8万）多肽类物质，内皮细胞生长因子，成纤维细胞生长因子，胸腺肽注射液，促肝细胞生长素注射液差异较大，而本发明图3、图4结果也表明，水溶性中分子量动物胸腺提取物与成年猪胸腺蛋白（TP）、胸腺肽注射液（TF）、促肝细胞生长素注射液（HGF）的作用效应不同。
水溶性中分子量动物胸腺提取物表现出良好的抗和明显促进肉芽组织生长效果。研究初步表明本发明的胸腺提取物在实验室促内皮细胞（EC）、小鼠3T3成纤维细胞（FC）增殖效应与临床外用治疗促进伤口愈合的结果相吻合。
研究结果还表明，水溶性中分子量动物胸腺提取物的剂量与疗效也存在一定的关系（可参见图5），经实验和临床试验得出本发明动物胸腺提取物用量以5-15mg（蛋白）/kg/日为宜，优选用量为10mg（蛋白）/kg/日。大剂量的水溶性中分子量动物胸腺提取物（50mg/kg/日）治疗反而对溃疡面的愈和造成不良的影响，在细胞培养实验中发现，高浓度的水溶性中分子量动物胸腺提取物对于内皮细胞或成纤维细胞的增值起着抑制作用。
我们认为水溶性中分子量动物胸腺提取物主要是通过营养局部受损粘膜并促进内表皮细胞、成纤细胞增生而达到治疗目的，因此，它适应范围广，为解决目前抑酸药所造成的胃酸过低的不良反应等问题起到积极作用。
表3水溶性中分子量动物胸腺提取物治疗10天大鼠胃溃疡面积的变化及其与盐水对照组的比较
组别 剂量(mg/kg/n) 动物数n 溃疡面积(mm2)
X±SD
NS 0.5ml 10 5.23±3.59
TP1 10 10 1.56±1.36a
TP2 15 10 3.40±1.47b
与对照组比较，aP＜0.01，bP＜0.05。
表4不同剂量的水溶性中分子量动物胸腺提取物、西咪替叮及盐水喂药20天，大鼠胃溃疡完全愈和率比较
组别 剂量(mg/kg/n) 动物数n 愈合例数(%)
NS 0.5ml 20 3(15.00)
TP1 10 20 15(75.00)a
TP2 15 18 9(50.00)b
TP3 50 20 1(5.00)
Cimet 500 20 11(55.00)c
Cimet.+TP1 500/10 19 13(94.47)d
与对照组比较，aP＜0.01，bP＜0.05，cP＜0.05，dP＜0.05，
进行该实验时所用的胸腺提取物是本发明所述的水溶性中分子量动物胸腺提取物，所述的西咪替叮是广州市桥制药厂出品;胃溃疡的模型是参照Okabe等设计和董秀云的改良法，即，用50%的乙酸涂胃壁以造成溃疡模型。
喂药处理：术后第一天即开始经口灌入胃内，每天二次（上午9时，下午3时，）共给药10天及20天，大鼠分为6组，第一组为对照组（30只），给生理盐水;第二组（30只）为TP1组（10mg/kg/日）;第三组（30只）为TP2组（15mg/kg/日）;第四组（20只）为TP3组（50mg/kg/日）;第五组（20只）为Cimetiine组（500mg/kg/日）;第六组（20只）为二联组（即Cimetidine500mg/kg/日+TP10mg/kg/日）。观察药物对溃疡对愈合的影响如下：给药材10天后将第一、第二、第三组的各10只动物处死以1%的福尔马林固定胃壁沿大工，测量溃疡面积并进行比较;给药20天后同样处理并于病变部位做组织学切片观察大鼠的轩溃疡愈和情况统计结果如表3所示。
对水溶性中分子量动物胸腺提取物的进一部的分析表明，本发明所述的水溶性中分子量动物胸腺提取物还含有一定量的微量元素和十七种氨基酸，所述的微量元素和氨基酸的命称和合量，由表5和表6列出：
表5水溶性中分子量动物胸腺提取物微量元素分析
检测仪器：HITACHI180-70AAS（单位：mg/L）
Zn 12-15
Cu 0.2-0.27
K 370-405
Na 111-132
Mn 0.1-0.23
Fe 0.1-0.18
Mg 19-25
Ca 22-31
Co 0.033-0.49
Se <0.01
表5是多次检测所得的范围。
表6氨基酸检验
样品处理 游离氨基酸用5%磺基水杨酸法处理
分析方法 高压液相色谱
检验结果 含量单位（mg/g）
天冬氨酸 1.65-1.98
苏氨酸 12.0-13.0
丝氨酸 6.53-8.11
谷氨酸 15.2-17.7
脯氨酸 3.88-4.45
甘氨酸 2.03-2.79
丙氨酸 5.34-5.97
胱氨酸 /
颉氨酸 6.10-6.74
蛋氨酸 2.44-2.98
异亮氨酸 4.12-4.88
亮氨酸 12.1-14.8
酪氨酸 7.03-7.75
苯丙氨酸 7.11-8.32
赖氨酸 13.9-15.1
组氨酸 4.00-4.67
精氨酸 9.97-11.1
表5、6是多次检测所得的范围。
表5、6的检测结果可能会因原料来源及其它条件的变化而有所误差，误差率约为±10%。
上述内容都是对动物、或在实验室的试验或检验结果，具体用于临床的效果如何？自1992年10月至1993年5月，我们进行水溶性中分子量动物胸腺提取物治疗消化性溃疡的临床验证工作，共观察消化性溃疡41例，全部病例均经纤维胃镜检查确诊为胃、十二指肠球部溃疡（活动期），疗程结束后再经纤维胃镜检查评价治疗效果。
在总数为41例的病人中，男36例，女5例;年龄最小为18岁，最大为70岁，其中20岁以下3例，20-30岁17例，31-40岁5例，41-50岁12例，51岁以上为4例，平均年龄为36.4岁，病程最短1个月，最长30年，平均为3.78年;41例中有胃溃疡4例，十二指肠球部溃疡35例，复合溃疡2例;41例患者共57个溃疡，其中仅1个溃疡者32例，2个溃疡者4例，3个溃疡者4例，5个溃疡者1例（其中球内有2个溃疡，胃内有3个溃疡）。全部病例无幽门梗阻，癌变并发症，其中10例合并有小量出血。
治疗方法-凡附合观察病例条件者可住院或门诊治疗。41例均服水溶性中分子量动物胸腺提取物每次6ml，每日2次，15天为一个疗程，服期间不得使用其他治疗消化性溃疡的药物，全部病例均观察一个疗程的治疗效果。
疗效标准-治疗结果分为痊愈、显效、有效、无效4个组，经水溶性中分子量动物胸腺提取物治疗15天后溃疡完全愈合或转为红色瘢痕期为治愈;溃疡面积较治疗前缩小50%以上者为显效;溃疡面有缩小，但缩小不到50%者为有效;溃疡面无缩小或增大或出现新的溃疡者为无效。
临床症状-水溶性中分子量动物胸腺提取物能有效改善消化性溃疡的临床症状，特别是能较快缓解上腹痛症状，最快的患者服药1-2天腹痛消失，一星期内腹痛的消失率约为97-36%（34例/38例），改善反酸，暖气症状次之，反酸消失率64.21%（18例/28例），暖气的消失率为65.48%（17例26例）;10例伴有黑便者亦多在一周内大例转黄，出血停止。
溃疡愈合率-痊愈为65.85%（27例/41例），显效24.39%（10例，41例），有效2例占4.89%，无效2例4.89%。总有效率为95.12%。
对胃酸度的影响-本组部分病例观察了服用水溶性中分子量动物胸腺提取物后对胃液游离酸，PH值的影响，结果表明本发明的胸腺提取物对胃内酸环境影响不大。
付作用-全部观察病例均对比观察了水溶性中分子量动物胸腺提取物治疗前后患者肝功能、肾功能、血常规、洋常规、粪常规的变化情况，本组治疗剂量范围内未见损害肝肾功能，亦无血、尿、粪常规的改变，故本药在治疗范围内无毒付作用，安全可靠。
本文观察了单用水溶性中分子量动物胸腺提取物治疗消化性溃疡41例，其中胃溃疡4例，十二指肠球部溃疡35例，复合性溃疡2例，多数为一个溃疡面，少数为多发性溃疡，最多达5个溃疡。服水溶性中分子量动物胸腺提取物治疗15天，治愈率为65.48%，总有效率为95.12%，疗效满意，其疗效类似于H2受体阻滞剂为药物。但本药具有疗程短，缓解症状快，无任何毒付作用的特点，深受患者欢迎。因此水溶性中分子量动物胸腺提取物不失为一种新开辟的较好的治疗溃疡病新药物，值得大力推广使用。
异常毒性试验
经口急性毒性试验的动物，对本发明的动物胸腺提取物最大耐受量为20000mg/kg（即：LD50＞20000mg）。
兔皮肤、眼结膜刺激试验：本品对试验动物的皮肤、眼结膜无刺激作用。
实施例1-3
采用本文前述的方法制备水溶性中分子量动物胸腺提取物，并用检测仪器测定其微量元素的含量（单位：mg/L），每次测定所用的方法相同，只是生产日期不同，即原料的批号不同，得出下述结果。
元素名称 1 2 3
Zn 12.4 14.1 15.7
Cu 0.21 0.23 0.27
K 405 398 370
Na 111 126 132
Mn 0.23 0.15 0.11
Fe 0.10 0.14 0.18
Mg 19.5 21.6 25.4
Ca 31.3 27.1 22.2
Co 0.033 0.04 0.49
Se 均小于0.01
它还包括如下氨基酸(含量单位mg/g):
氨基酸名称 1 2 3
天冬氨酸 1.65 1.82 1.98
苏氨酸 12.0 12.43 13.0
丝氨酸 8.11 7.22 6.53
谷氨酸 15.2 16.23 17.7
脯氨酸 4.45 4.12 3.88
甘氨酸 2.79 2.32 2.03
丙氨酸 5.34 5.69 5.97
胱氨酸 /
颉氨酸 6.10 6.36 6.74
蛋氨酸 2.44 2.75 2.98
异亮氨酸 4.12 4.58 4.88
亮氨酸 12.1 13.97 14.8
酪氨酸 7.03 7.23 7.75
苯丙氨酸 7.11 7.59 8.32
赖氨酸 15.1 14.85 13.9
组氨酸 4.00 4.19 4.67
精氨酸 9.97 10.34 11.1