棉花糖基转移酶基因GHUGT73C6及其在调控植物株型中的应用.pdf

本发明公开了一种陆地棉糖基转移酶基因GhUGT73C6在调控植物株型中的应用，其中所述的糖基转移酶基因GhUGT73C6的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明具体步骤包括：A、GhUGT73C6基因全长cDNA的克隆；B、超表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S-GhUGT73C6的构建；C、通过转化拟南芥进行功能验证，证明所述GhUGT73C6基因能够使植物具有矮化、叶面积小的表型。本发明对于植物的矮化育种具有重要价值。

1.  棉花糖基转移酶基因GhUGT73C6，其特征在于它的序列如SEQ ID NO.2所示。

2.  权利要求1所述的棉花糖基转移酶基因GhUGT73C6在调控植物株型方面的应用。

3.  根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述调控植物株型为降低株高、缩小叶片。

4.  由权利要求1所述的棉花糖基转移酶基因GhUGT73C6编码的蛋白质，其特征在于它的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.  含有权利要求1所述的棉花糖基转移酶基因GhUGT73C6的超表达载体是pCAMBIA2301-CaMV35S-GhUGT73C6。

棉花糖基转移酶基因GhUGT73C6及其在调控植物株型中的应用
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，是棉花糖基转移酶基因GhUGT73C6在调控植物株型中的应用。
背景技术
棉花是重要的经济作物，但近年来由于农村劳动力的短缺，棉花种植面积大幅度下降，发展棉花全程机械化成为目前棉花生产的必然方向，因此培育适宜机械化的棉花株型是其中重要方面。通过传统的育种技术获得矮化的表型比较困难，而且常规育种方法对棉花进行种质改良周期长、成效低。近年来随着分子生物学技术的飞速发展，转基因技术成为一种不错的选择。
油菜素内酯是一类重要的植物激素，具有生物活性的油菜素内酯在植物的生长发育起着重要作用，它可以促进种子的萌发、茎根叶的伸长，表皮毛发育、花粉管伸长、花和果实发育等。并且研究表明植物体内油菜素内酯的活性受到多个基因的调控，其中糖基转移酶家族的某些基因可以使油菜素内酯失活。对拟南芥的研究表明，糖基转移酶家族中UGT73C亚家族的6个基因中C1、C2、C3、C4不能使油菜素内酯失活，而C5、C6可以使油菜素内酯失活(Husar S,Berthiller F,Fujioka S,et al.Overexpression of the UGT73C6alters brassinosteroid glucoside formation in Arabidopsis thaliana,BMC Plant Biology,2011,11:51.doi:10.1186/1471-2229-11-51)。说明糖基转移酶UGT73C亚家族基因的功能存在差异。
因此本发明依据拟南芥中可以使油菜素内酯失活的AtUGT73C6(NM_129234.2)基因，在棉花雷蒙德斯棉花基因组中比对得到UGT73C6基因的预测序列，该预测基因的氨基酸序列在NCBI中已公开(KJB13655.1)，但是经过检索，棉花糖基转移酶基因GhUGT73C6的功能以及陆地棉中UGT73C6基因序列均未见报道。
本发明从陆地棉棉花品种苏棉18中获得GhUGT73C6基因，其与陆地棉中UGT73C亚家族中已公布的GhUGT73C14基因(JX846921.1)氨基酸序列相似度低于80％，研究认为GhUGT73C14基因参与脱落酸的活性调控(Gilbert MK,Bland JM,Shockey JM,et al.,A transcript profiling approach reveals an abscisic acid-specific glycosyltransferase(UGT73C14)induced in developing fiber of Ligon lintless-2mutant of cotton(Gossypium hirsutum L.).Plos One,2013,8(9):e75268)。通过转基因技术使GhUGT73C6基因在拟南芥中过量表达，获得的转GhUGT73C6基因植株具有矮化、叶面积小的表型。所以，棉花GhUGT73C6基因的克隆和基因功能验证可以为棉花的矮化育种提供了基因资源。
发明内容
棉花AA、DD二倍体和AADD四倍体全基因组测序的完成，获得很多基因的预测序列，但是基因功能并未明确。因此本发明的目的是提供一种棉花糖基转移酶基因GhUGT73C6在调控植物株型中的应用，所述基因cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的调控植物株型的棉花糖基转移酶基因GhUGT73C6基因编码的蛋白质，具有序列表中SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列。
本发明提供了含有上述棉花糖基转移酶基因GhUGT73C6的植物表达载体。将GhUGT73C6基因克隆到pCAMBIA2301，获得pCAMBIA2301-CaMV35S-GhUGT73C6。
本发明所述基因GhUGT73C6在培育矮化植物中的应用。具体是将GhUGT73C6基因通过植物表达载体转入目的植物内。所述植物是模式植物拟南芥。
本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，利用电子克隆及RT-PCR技术，分离与鉴定棉花矮化相关基因序列信息，并通过根癌农杆菌浸花法将基因转入拟南芥，鉴定证明转基因植株的株高明显低于野生型、叶片明显小于野生型(图6)，说明GhUGT73C6基因调控植物株型有明显效果。
附图说明
图1 GhUGT73C6基因全长cDNA序列的扩增结果。
M：DL2000DNA marker,1、2为GhUGT73C6基因全长cDNA PCR扩增结果。
图2与其他UGT73C亚家族基因的氨基酸序列比对。
图3植物表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S-GhUGT73C6的构建。
(a)大肠杆菌pCAMBIA2301-CaMV35S-GhUGT73C6PCR检测电泳结果；
M：DL2000DNA marker,1、2、3、4、5为大肠杆菌pCAMBIA2301-CaMV35S-GhUGT73C6菌液PCR结果，+为GhUGT73C6基因PCR结果，-为阴性对照。
(b)pCAMBIA2301-CaMV35S-GhUGT73C6质粒的PCR、酶切鉴定。
M：DL2000DNA marker,1为空白，2为pCAMBIA2301-CaMV35S-GhUGT73C6质粒的PCR结果，3为pCAMBIA2301-CaMV35S-GhUGT73C6质粒的酶切结果。
图4转基因植株的PCR鉴定。
M：DL2000DNA marker；1、2、3为转基因植株。“+”为pCAMBIA2301--CaMV35S-GhUGT73C6质粒，“-”为阴性对照。
图5转基因植株的RT-PCR鉴定。
M：DL2000DNA marker；WT为野生型拟南芥，2、3为转GhUGT73C6基因植株2、3。
图6转基因拟南芥与野生型拟南芥株型比较。
(a)开花期株型；(b)成熟期株型；(c)叶片。
转基因植株株高明显低于野生型，叶片明显小于野生型。
图7转基因拟南芥株系与野生型拟南芥的株高。
WT为野生型拟南芥，GhUGT73C6-2为转基因株系2，GhUGT73C6-3为转基因株系3。
具体实施方式
实施例1、GhUGT73C6基因的获得
1.1 RNA的提取
(1)取0.5g新鲜陆地棉棉花品种苏棉18的叶片组织，加入0.1g聚乙烯砒咯烷酮(PVPP)，在液氮中充分研磨至粉末，将冻粉末迅速转入10ml离心管中，加5ml CTAB提取液与500μl0.1M pH8.0的Tris-HCl，65℃水浴20min，中途翻转混匀；
(2)加等体积氯仿充分混匀，冰浴静置10min；
(3)4℃，10000rpm离心20min。分装于4个1.5ml离心管；
(4)吸上清，加入1/3体积的8M LiCl混匀，-70℃1h或-20℃过夜；
(5)4℃，10000rpm离心20min。弃上清，70％乙醇洗涤两次后，吹干沉淀溶解于30μl DEPC水；
(6)加入10U无RNase活性的DNase和25U RNase Inhabitor，10×buffer消化30min后加等体积氯仿，抽提一次；
(7)上清转移到新管中，加1/10体积的3M pH 5.2NaAc和等体积的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置过夜或-70℃冰浴3h；
(8)4℃，10000rpm离心20min，弃上清，70％乙醇洗涤两次后溶解于30μl DEPC水。即得棉花RNA。
1.2 cDNA的合成
体系:


1.3 GhUGT73C6基因的克隆
根据拟南芥UGT73C6基因(NM_129234.2)在棉花雷蒙德斯棉基因组中Blast比对得到棉花中UGT73C6基因预测序列，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。在ORF序列两侧设计上游引物5’-CTCATATTCCTATGGGTT-3’(SEQ ID NO.4)和下游引物5’-GACGTTATCTCGATTTTC-3’(SEQ ID NO.5)，用陆地棉苏棉18的cDNA(由步骤1.2合成)进行PCR，PCR反应体系(25μl)：10×EasyPfu buffer 2.5μl,50mM MgSO₄0.5μl，2.5mM dNTP 2μl，引物1(10μM)1μl，引物2(10μM)1μl，ddH₂O 16.5μl，cDNA 1μl，EasyPfu DNA Polymerase 0.5μl。PCR扩增程序：94℃3min；94℃30sec,48℃45sec,72℃2min,36个循环；72℃10min；4℃保温。
回收扩增得到的PCR产物，克隆至pEASY-T1载体(北京全式金生物技术有限公司)，通过PCR筛选阳性克隆，送至上海英俊公司测序。我们将分离得到的陆地棉基因命名为GhUGT73C6，ORF全长1494bp(SEQ ID NO.2)(图1)，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。陆地棉中获得的GhUGT73C6基因与在雷蒙德斯棉基因组中预测的基因序列相似度99％。将获得GhUGT73C6基因与棉花中已获得的GhUGT73C14、以及其他作物中已获得的UGT73C亚家族的基因(拟南芥中的AtUGT73C6、AtUGT73C5，可可中的Tcglu1、TcUGT73C5，橙子CsUGT73C1，梅PmUGT73C1)进行比对发现，GhUGT73C6基因氨基酸序列与其他作物UGT73C亚家族的基因氨基酸序列的一致性均低于80％(图2)。
实施例2、pCAMBIA2301-CaMV35S-GhUGT73C6植物表达载体的构建
用含有酶切位点的引物GhUGT73C6-KpnI：5’-CTCATATT CCTATGGGTT-3’(SEQ ID NO.6)和GhUGT73C6-XbaI:5'-GACG TTATCTCGATTTTC-3'(SEQ ID NO.7)进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期片段。PCR反应程序如下：94℃5min；94℃30sec,48℃45sec,72℃1min 30sec,36个循环；72℃10min；4℃保温。得到含有酶切位点的GhUGT73C6PCR产物。
选用KpnⅠ和XbaⅠ分别对植物表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S质粒(本实验室保存，郑卿，抗Ⅰ型糖尿病基因转化烟草、番茄的研究[D]，扬州大学硕士研究生毕业论文，2010)和含有酶切位点的GhUGT73C6PCR产物进行双酶切。
pCAMBIA2301-CaMV35S质粒双酶切体系如下：


含有酶切位点的GhUGT73C6PCR产物双酶切体系：

于37℃酶切，反应时间≥3h。用琼脂糖凝胶对双酶切产物进行电泳检测，结果见图3(b)。回收pCAMBIA2301-CaMV35S载体大片段和目的基因片段，用T4连接酶连接后转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，鉴定重组子后即得到带有目的基因的植物表达载体。
基因与酶切得到的pCAMBIA2301大片段的连接反应体系：

16℃连接过夜。
连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，在含kan100mg/L的LB液体培养基中37℃振荡培养1h后。均匀涂在kan100mg/L的LB固体培养基上，37℃培养过夜。
挑取单菌落接种于1.5ml含卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养，用GhUGT73C6基因引物GhUGT73C6-Kpn I(SEQ ID NO.6)和GhUGT73C6-XbaⅠ(SEQ ID NO.7)进行PCR扩增鉴定，结果见图3(a)。
用AXYGEN质粒提取试剂盒提取PCR检测为阳性的菌液质粒，选取XbaⅠ和KpnⅠ酶进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测图3(b)。将获得的重组表达载体命名为pCAMBIA2301-CaMV35S-GhUGT73C6。
实施例3、农杆菌感受态的制备与转化
3.1农杆菌EHA105感受态的制备
(1)挑取EHA105单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4；
(2)以1：100接种于40-50ml LB培养基中(50ml离心管中)，摇菌至OD600为0.6-0.8，冰浴10min；
(3)4℃，5000rpm，离心5min；
(4)弃上清，沉淀用无菌水充分悬浮，4℃，5000rpm，离心5min；重复此过程3次。
(5)向洗好的菌体中加1ml(根据菌体多少而定)含10％无菌甘油重悬浮细胞。
(6)分装成50μL每管，液氮速冻，置于-80℃备用。
3.2电击法转化农杆菌感受态细胞EHA105
1.取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。
2.加1μl pCAMBIA2301-CaMV35S-GhUGT73C6质粒DNA于50μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。
3.取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中(电击杯-20℃预冷)，吸干电击杯表面的水，将电击杯放入电转化仪的电极之间，在2400V高压下电击4-5s。
4.取出电击杯，迅速加入1ml LB液体培养基不含抗生素，混匀并转移混合液到1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养3h。
5.取100ul菌液涂布于含Rif(50mg/L)和Kan(100mg/L)LB平板上，28℃倒置培养2-3天。
3.3菌液PCR鉴定
挑取在Rif和Kan抗性平板上生长的单菌落进行PCR鉴定。将鉴定含有目的基因的菌液加50％甘油，混匀，保存于-80℃的冰箱中备用。
实施例4、转化拟南芥及转基因功能验证
4.1浸花法侵染拟南芥
1.选择盆中长出约20-30个花絮的拟南芥，剪掉已成熟的果荚，转化前2-3天浇足水。
2.用接种环将3.3保存的含GhUGT73C6基因的农杆菌接种到1.5ml离心管中28℃，200rpm振荡培养1-2天。
3.取100ul到50ml LB(50mg/L的Rif和100mg/L的Kan)培养基中，28℃，200rpm振荡培养直到OD₆₀₀＝0.6-1.0。
4. 4000g离心5分钟。
5.弃上清，收集菌体，用30ml的1/2MS转化液重悬浮菌体备用。
6.将待转化的植株倒置于1/2MS转化液中45s，花蕾要全部浸入转化液(转化液加入silwette-775μl/100ml)。
7.将侵染植株套袋，暗光培养24h后置于正常培养条件下。
8.一周后再转化一次，步骤同上。
9.成熟后收获种子为T0代。
4.2转基因阳性植株的鉴定
4.2.1筛选具有卡那抗性的转基因拟南芥种子
1.将收获的T0代种子装于2ml的EB管中，70％的乙醇(v/v)消毒1-3min，15％的NaClO(v/v)消毒5min，9000rpm离心1分钟，无菌水清洗3-5次。
2.加适量的无菌水，均匀播种在含有100mg/L Kan的1/2MS培养基上。
3. 4℃暗培养2-3天后，放于培养箱中。
4. 2周后观察，阳性转基因植株长出真叶并呈绿色，表型正常，而非转基因植株生长停留在子叶期，并且发黄。
5.将长出真叶并呈绿色的拟南芥植株移栽到土质基质上，置于培养箱中正常培养数周。
4.2.2对转基因植株进行PCR检测
对转基因植株进行基因组和转录组水平的PCR验证。以T1代转基因植株总DNA为模板，以质粒为阳性对照，以未转化植株的总DNA为阴性对照，用GhUGT73C6-F(SEQ ID NO.4)，GhUGT73C6-R(SEQ ID NO.5)进行PCR扩增。阳性质粒对照和转基因植株中编号为2、3的两个植株扩增出目的片段，而阴性对照和编号为1的转基因植株无目的条带(图4)。
提取T1代拟南芥叶片的RNA，以转基因拟南芥植株cDNA为模板，以未转化拟南芥植株(WT)的cDNA为阴性对照，进行GhUGT73C6基因的半定量表达分析。根据GhUGT73C6基因的cDNA序列设计RT-PCR引物，引物为GhUGT73C6-RT-F GAAGCACGGTTACCAGAC(SEQ ID NO.8)，GhUGT73C6-RT-R CTCCCAAGACAAGCATAA(SEQ ID NO.9)，以actin基因(GenBank No：NM_112764.3)为内部参照基因(460bp)，引物为actin-F:5′-TGCCAATCTACG AGGGTT-3′(SEQ ID NO.10)，actin-R:5′-TCTTTGCTCATACGGTCA-3′(SEQ ID NO.11)。GhUGT73C6基因的半定量表达结果(图5)进一步证实，GhUGT73C6基因已导入拟南芥中并表达。
4.2.3转基因拟南芥的表型鉴定
取T2代纯合转基因GhUGT73C6的拟南芥株系(GhUGT73C6-2、GhUGT73C6-3)和野生型拟南芥Col-0(WT)种子，灭菌后经4度春化2-3天，播种后于22-23度、每天16h光照8小时黑暗条件下，正常水肥管理，抽薹期和成熟时观察表型(图6)，成熟时测量株高(每个株系5株)(图7)。可以看出过量表达GhUGT73C6基因的拟南芥植株具有矮化、叶片小的表型。